秋水仙胺的浓度和处理时间对白血病患者骨髓细胞分裂指数的影响
作者：郑玲 薛永权 李建勇 过宇 谢新 吴亚芳 沈美凤
单位：郑玲 薛永权 李建勇 过宇 谢新 吴亚芳 苏州医学院附属一院，苏州，215006；沈美凤 苏州医学院附属二院
关键词：秋水仙胺；白血病；有丝分裂指数
摘要 目的 摘要 目的：探讨秋水仙胺的浓度和处理时间对初诊未治和治疗后缓解的白血病患者骨髓细胞有丝分裂指数(MI)的影响。方法：采用浓度为10μg/ml和0.1μg/ml的秋水仙胺对17例各类白血病(初诊未治12例、复发1例、完全缓解(CR)4例)的骨髓细胞分别处理12h和24h，计算其MI，并与常规方法(0.05μg/ml×1h)比较。结果：白血病初诊未治和CR的骨髓标本采用10μg/ml的秋水仙胺处理12h组和用0.1μg/ml处理12h组，其平均MI均比0.05μg/ml×1h组明显增高(P<0.01)，而10μg/ml或0.1μg/ml×24h组则分别导致14/17例和7/17例的MI为零。结论：高浓度(10μg/ml)或常规浓度(0.1μg/ml)的秋水仙胺处理12h是使白血病患者特别是髓细胞白血病患者，无论是初诊未治还是治疗后CR的病例，获得高骨髓细胞MI的有效方法。
, http://www.100md.com
中图法分类 R733.704
Effects of the Concentration and the Processing Time of Colcemide on Mitotic Index of Bone Marrow Cells in Leukemia Patients
Zheng Ling,Xue Yongquan,Li Jianyong,et al
(First Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou，215007)
Abstract To investigate the effects of the concentration and the processing time of colcemide onmitotic index of bone marrow nucleated cells in the leukemia patinents.The bone marrow cells from 17 patients with leukemia prior treatment or after remission were processed by colcemide at a concentration of 10μg/ml and 0.1μg/ml for 12 or 24 hours,respectively.Their mean mitotic index(MI) was calculated and compared with that obtained from the routine methods (0.5μg/ml×1hour).Results:The mean MI in the group A (processed with colcemide 10μg/ml×12hours) and group C (processed with colcemide 0.1μg/ml×12hours) significantly increased compared with the mean MI in the group E(processed with colcemide 0.05μg/ml×1hour)(P<0.01).However,the MI was 0‰ in 14 of 17 cases of the group B(processed with colcemide 10μg/ml×24hours) and in 6 of 17 cases of the group D(processed with colcemide 0.1μg/ml×24hours).It suggests that high concentration colcemide with a long processing time is a reliable method for producing a high MI of bone marrow cells in leukemia patients,especially for those with myeloid leukemia.
, 百拇医药
Key words colcemide;leukemia;mitotic index
近来EL-RIFAI等[1～3]报道，采用高浓度秋水仙胺长时间处理可显著提高缓解期白血病骨髓细胞的有丝分裂指数(MI)，从而使中期荧光原位杂交(metaphase-FISH)成为检测白血病微小残留(MRD)的一种有效手段。为了验证其结果和进一步了解它是否能提高初诊未治急性白血病的骨髓细胞MI及探索秋水仙胺浓度和加药时间对骨髓细胞MI的影响，1998年12月～1999年1月，我们对17例各类白血病进行了高浓度秋水仙胺长时间处理对骨髓细胞MI影响的研究。结果报道如下。
1 资料和方法
1.1 病例：17例中，男10例，女7例，年龄7～50岁。根据临床表现、血象、骨髓象并参照《血液病诊断及疗效标准》[4]诊断为：急性早幼粒细胞白血病(APL) 3例，APL复发1例，APL完全缓解(CR) 2例，急性髓细胞白血病(M2) 1例，早期急性白血病1例，骨髓增生异常综合征(MDS) 1例，慢性粒细胞白血病(CGL) 2例，急性淋巴细胞白血病(ALL) 4例，ALL-CR 2例。
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1.2 方法
1.2.1 染色体制备：参照文献[1、2]略加变更。以肝素湿润的针筒无菌抽取骨髓标本，计数有核细胞，并按3×106/ml接种于数瓶RPMI-1640培养基中(含20%小牛血清、0.29mg/ml L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)，其中2瓶加入秋水仙胺，使终浓度分别为10μg/ml和0.1μg/ml，培养24h。另2瓶经预培养12h后，再分别加入秋水仙胺，使终浓度分别为10μg/ml和0.1μg/ml，继续培养12h。每一病例还同时作短期培养法或直接法即直接加入或37℃培养24h，于终止培养前1h加入秋水仙胺，终浓度为0.05μg/ml，再按常规方法收获制片。
1.2.2 计数MI：在光镜下计数1000～3000个间期细胞及分裂细胞，计算分裂细胞所占的比例，即为MI。
1.2.3 统计学处理：应用F检验进行数据处理。
, 百拇医药
2 结果
17例实验数据见附表。鉴于我们以往的经验即急性髓细胞白血病和慢性粒细胞白血病MI均以短期培养法为优，而急性淋巴细胞白血病则以直接法为优。本实验中前二者采用短期培养法作为对照，后者采用直接法作为对照。按秋水仙胺的浓度和作用时间的不同，本研究可分为5个实验组：10μg/ml×12h(A组)，10μg/ml×24h(B组)，0.1μg/ml×12h(C组)、0.1μg/ml×24h(D组)和0.05μg/ml×1h(E组)。由附表可算出17例白血病患者各组的平均MI分别为13.79‰、0.82‰、9.18‰、7.47‰、1.88‰。A组的平均MI明显高于对照组(P<0.01)，也高于C组和D组(P<0.05)。A组中中期分裂相最多的病例在2cm×2.5cm区域内可见500多个分裂相(附图)。B组中除例7，例15和例16的MI分别为9‰、4‰和1‰外，其余各例均为零。C或D组的平均MI和对照组相比，差异也有显著性(P<0.01)。虽然D组平均MI很高，但有7例MI为0。4例初诊ALL患者中2例的A、B、C、D组的MI明显低于对照组，且绝大多数为零。
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附图 例7 A组分裂相(×100)
3 讨论
为了仔细分析白血病细胞的染色体异常，要求标本有足够数量的中期分裂相。阻留有期分裂相最常用的方法是向新鲜或短期培养后的骨髓标本中加入终浓度为0.05μg/ml的秋水仙胺，37℃作用1h。此种方法收获的骨髓MI通常较低，以致常规核型分析有时因分裂相过少而检测不到异常，尤其不适用于白血病的MRD检测。Metaphase FISH技术采用整条染色体涂染探针检测分裂中期细胞中的染色体状况。该法之特异性和敏感性均明显高于常规核型分析，故可用来检测白血病的MRD，但其敏感性也直接取决于骨髓细胞MI的高低。由此可见，提高骨髓细胞MI无论对常规核型分析还是对metaphase FISH都具有重要意义。
本文17例髓系白血病中以A组的平均MI为最高，说明大剂量秋水仙胺处理12h确实能明显提高骨髓细胞的MI。不但包括治疗后CR的病例，也包括初诊未治的髓细胞白血病和部分急淋；B组则相反，除3例外，大多数MI为零，说明大剂量秋水仙胺处理24h反而会使MI明显降低。C组和D组的平均MI也高于对照组(P<0.01)，但不如A组显著，表明常规剂量秋水仙胺长时间处理也能使骨髓细胞的MI适当增加。其可取之处在于秋水仙胺浓度仅为A组的1/100，因而比较经济实惠。虽然D组的平均MI很高，但近一半病例的MI为零。结合A组和B组中所见，似乎说明骨髓细胞经过预培养后再加入秋水仙胺，可使更多的增殖细胞阻滞在分裂中期，从而提高了MI。反之，细胞增殖一开始就受到抑制，MI显著降低以致等于零，因而D组和B组都不值得推荐。除了秋水仙胺的浓度和作用时间外，白血病细胞的生物学特性、培养基中小牛血清的质量、培养基的酸碱度等对MI均有较大的影响。本实验中，除了白血病细胞的生物学特性外，其它条件都是恒定的，因而各组资料有可比性。4例ALL中2例其A、B、C、D组MI均小于对照组，且绝大多数为零，这可能与ALL的白血病细胞在体外培养条件下较少分裂有关[1]。
, http://www.100md.com
综上所述：我们认为高浓度秋水仙胺长时间处理(10μg/ml×12h)能显著提高白血病骨髓细胞MI，包括CR病例和初诊未治病例，常规浓度的秋水仙胺于标本收获前12h加入也能使其MI适当增加，特别是髓细胞白血病患者。
附表 不同浓度和处理时间的秋水仙胺对17例白血病骨髓细胞MI的影响
例
号
诊
断
MI(‰)
A组
10μg/ml
×12h
, 百拇医药
B组
10μg/ml
×24h
C组
0.1μg/ml
×12h
D组
0.1μg/ml
×24h
E组
0.05μg/ml
×1h
1
, 百拇医药
M3CR
2
0
3
17
2
2
M3CR
11
0
7
9
2
, 百拇医药
3
早白
47
0
22
27
0.5
4
M3
5
0
2
0
1.5
, 百拇医药
5
MDS-
RAEB
8
0
1
0
0
6
M3复发
3
0
0
, http://www.100md.com 0
0
7
M2CR
41
9
26
30
1
8
CGL
9
0
12
, 百拇医药
0
4
9
CGL
2
0
2
0
1
10
M3
16
0
7
, 百拇医药
1
2
11
M3
24
0
18
8
4
12
ALL
0.5
0
, 百拇医药 0
0
4
13
ALL
0
0
0
0
3
14
ALL
16
4
, 百拇医药
8
10
0.5
15
ALL
7
1
26
6
0.5
16
ALL-CR
19
0
, 百拇医药
12
6
4
17
ALL-CR
24
0
10
13
2
作者简介：郑玲 硕士研究生
薛永权 导师
参考文献
, 百拇医药
1 Nylund S,et al.Metaphase fluorescene in situ hybridization (FISH) in the fol low up of 60 patients with hemapoietic malignances.Bri J Haematol,1994,88∶778
2 EL-Rifai W,et al.Mininal residual disease after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia∶a metaphase-FISH study.Bri J Haematol,1996,92∶365
3 EL-Rifai W,et al.Follow up of residual disease using metaphase-FISH in patients with acute lymphoblastic leukemia in remission.Leukemia 1997,11∶633
4 张之南主编.血液病诊断及疗效标准.第二版.北京：科学出版社，1998
(1999年5月27日收稿), 百拇医药
单位：郑玲 薛永权 李建勇 过宇 谢新 吴亚芳 苏州医学院附属一院，苏州，215006；沈美凤 苏州医学院附属二院
关键词：秋水仙胺；白血病；有丝分裂指数
摘要 目的 摘要 目的：探讨秋水仙胺的浓度和处理时间对初诊未治和治疗后缓解的白血病患者骨髓细胞有丝分裂指数(MI)的影响。方法：采用浓度为10μg/ml和0.1μg/ml的秋水仙胺对17例各类白血病(初诊未治12例、复发1例、完全缓解(CR)4例)的骨髓细胞分别处理12h和24h，计算其MI，并与常规方法(0.05μg/ml×1h)比较。结果：白血病初诊未治和CR的骨髓标本采用10μg/ml的秋水仙胺处理12h组和用0.1μg/ml处理12h组，其平均MI均比0.05μg/ml×1h组明显增高(P<0.01)，而10μg/ml或0.1μg/ml×24h组则分别导致14/17例和7/17例的MI为零。结论：高浓度(10μg/ml)或常规浓度(0.1μg/ml)的秋水仙胺处理12h是使白血病患者特别是髓细胞白血病患者，无论是初诊未治还是治疗后CR的病例，获得高骨髓细胞MI的有效方法。
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中图法分类 R733.704
Effects of the Concentration and the Processing Time of Colcemide on Mitotic Index of Bone Marrow Cells in Leukemia Patients
Zheng Ling,Xue Yongquan,Li Jianyong,et al
(First Hospital Affiliated to Suzhou Medical College,Suzhou，215007)
Abstract To investigate the effects of the concentration and the processing time of colcemide onmitotic index of bone marrow nucleated cells in the leukemia patinents.The bone marrow cells from 17 patients with leukemia prior treatment or after remission were processed by colcemide at a concentration of 10μg/ml and 0.1μg/ml for 12 or 24 hours,respectively.Their mean mitotic index(MI) was calculated and compared with that obtained from the routine methods (0.5μg/ml×1hour).Results:The mean MI in the group A (processed with colcemide 10μg/ml×12hours) and group C (processed with colcemide 0.1μg/ml×12hours) significantly increased compared with the mean MI in the group E(processed with colcemide 0.05μg/ml×1hour)(P<0.01).However,the MI was 0‰ in 14 of 17 cases of the group B(processed with colcemide 10μg/ml×24hours) and in 6 of 17 cases of the group D(processed with colcemide 0.1μg/ml×24hours).It suggests that high concentration colcemide with a long processing time is a reliable method for producing a high MI of bone marrow cells in leukemia patients,especially for those with myeloid leukemia.
, 百拇医药
Key words colcemide;leukemia;mitotic index
近来EL-RIFAI等[1～3]报道，采用高浓度秋水仙胺长时间处理可显著提高缓解期白血病骨髓细胞的有丝分裂指数(MI)，从而使中期荧光原位杂交(metaphase-FISH)成为检测白血病微小残留(MRD)的一种有效手段。为了验证其结果和进一步了解它是否能提高初诊未治急性白血病的骨髓细胞MI及探索秋水仙胺浓度和加药时间对骨髓细胞MI的影响，1998年12月～1999年1月，我们对17例各类白血病进行了高浓度秋水仙胺长时间处理对骨髓细胞MI影响的研究。结果报道如下。
1 资料和方法
1.1 病例：17例中，男10例，女7例，年龄7～50岁。根据临床表现、血象、骨髓象并参照《血液病诊断及疗效标准》[4]诊断为：急性早幼粒细胞白血病(APL) 3例，APL复发1例，APL完全缓解(CR) 2例，急性髓细胞白血病(M2) 1例，早期急性白血病1例，骨髓增生异常综合征(MDS) 1例，慢性粒细胞白血病(CGL) 2例，急性淋巴细胞白血病(ALL) 4例，ALL-CR 2例。
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1.2 方法
1.2.1 染色体制备：参照文献[1、2]略加变更。以肝素湿润的针筒无菌抽取骨髓标本，计数有核细胞，并按3×106/ml接种于数瓶RPMI-1640培养基中(含20%小牛血清、0.29mg/ml L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)，其中2瓶加入秋水仙胺，使终浓度分别为10μg/ml和0.1μg/ml，培养24h。另2瓶经预培养12h后，再分别加入秋水仙胺，使终浓度分别为10μg/ml和0.1μg/ml，继续培养12h。每一病例还同时作短期培养法或直接法即直接加入或37℃培养24h，于终止培养前1h加入秋水仙胺，终浓度为0.05μg/ml，再按常规方法收获制片。
1.2.2 计数MI：在光镜下计数1000～3000个间期细胞及分裂细胞，计算分裂细胞所占的比例，即为MI。
1.2.3 统计学处理：应用F检验进行数据处理。
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2 结果
17例实验数据见附表。鉴于我们以往的经验即急性髓细胞白血病和慢性粒细胞白血病MI均以短期培养法为优，而急性淋巴细胞白血病则以直接法为优。本实验中前二者采用短期培养法作为对照，后者采用直接法作为对照。按秋水仙胺的浓度和作用时间的不同，本研究可分为5个实验组：10μg/ml×12h(A组)，10μg/ml×24h(B组)，0.1μg/ml×12h(C组)、0.1μg/ml×24h(D组)和0.05μg/ml×1h(E组)。由附表可算出17例白血病患者各组的平均MI分别为13.79‰、0.82‰、9.18‰、7.47‰、1.88‰。A组的平均MI明显高于对照组(P<0.01)，也高于C组和D组(P<0.05)。A组中中期分裂相最多的病例在2cm×2.5cm区域内可见500多个分裂相(附图)。B组中除例7，例15和例16的MI分别为9‰、4‰和1‰外，其余各例均为零。C或D组的平均MI和对照组相比，差异也有显著性(P<0.01)。虽然D组平均MI很高，但有7例MI为0。4例初诊ALL患者中2例的A、B、C、D组的MI明显低于对照组，且绝大多数为零。
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附图 例7 A组分裂相(×100)
3 讨论
为了仔细分析白血病细胞的染色体异常，要求标本有足够数量的中期分裂相。阻留有期分裂相最常用的方法是向新鲜或短期培养后的骨髓标本中加入终浓度为0.05μg/ml的秋水仙胺，37℃作用1h。此种方法收获的骨髓MI通常较低，以致常规核型分析有时因分裂相过少而检测不到异常，尤其不适用于白血病的MRD检测。Metaphase FISH技术采用整条染色体涂染探针检测分裂中期细胞中的染色体状况。该法之特异性和敏感性均明显高于常规核型分析，故可用来检测白血病的MRD，但其敏感性也直接取决于骨髓细胞MI的高低。由此可见，提高骨髓细胞MI无论对常规核型分析还是对metaphase FISH都具有重要意义。
本文17例髓系白血病中以A组的平均MI为最高，说明大剂量秋水仙胺处理12h确实能明显提高骨髓细胞的MI。不但包括治疗后CR的病例，也包括初诊未治的髓细胞白血病和部分急淋；B组则相反，除3例外，大多数MI为零，说明大剂量秋水仙胺处理24h反而会使MI明显降低。C组和D组的平均MI也高于对照组(P<0.01)，但不如A组显著，表明常规剂量秋水仙胺长时间处理也能使骨髓细胞的MI适当增加。其可取之处在于秋水仙胺浓度仅为A组的1/100，因而比较经济实惠。虽然D组的平均MI很高，但近一半病例的MI为零。结合A组和B组中所见，似乎说明骨髓细胞经过预培养后再加入秋水仙胺，可使更多的增殖细胞阻滞在分裂中期，从而提高了MI。反之，细胞增殖一开始就受到抑制，MI显著降低以致等于零，因而D组和B组都不值得推荐。除了秋水仙胺的浓度和作用时间外，白血病细胞的生物学特性、培养基中小牛血清的质量、培养基的酸碱度等对MI均有较大的影响。本实验中，除了白血病细胞的生物学特性外，其它条件都是恒定的，因而各组资料有可比性。4例ALL中2例其A、B、C、D组MI均小于对照组，且绝大多数为零，这可能与ALL的白血病细胞在体外培养条件下较少分裂有关[1]。
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综上所述：我们认为高浓度秋水仙胺长时间处理(10μg/ml×12h)能显著提高白血病骨髓细胞MI，包括CR病例和初诊未治病例，常规浓度的秋水仙胺于标本收获前12h加入也能使其MI适当增加，特别是髓细胞白血病患者。
附表 不同浓度和处理时间的秋水仙胺对17例白血病骨髓细胞MI的影响
例
号
诊
断
MI(‰)
A组
10μg/ml
×12h
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B组
10μg/ml
×24h
C组
0.1μg/ml
×12h
D组
0.1μg/ml
×24h
E组
0.05μg/ml
×1h
1
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M3CR
2
0
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M3CR
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早白
47
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作者简介：郑玲 硕士研究生
薛永权 导师
参考文献
, 百拇医药
1 Nylund S,et al.Metaphase fluorescene in situ hybridization (FISH) in the fol low up of 60 patients with hemapoietic malignances.Bri J Haematol,1994,88∶778
2 EL-Rifai W,et al.Mininal residual disease after allogeneic bone marrow transplantation for chronic myeloid leukemia∶a metaphase-FISH study.Bri J Haematol,1996,92∶365
3 EL-Rifai W,et al.Follow up of residual disease using metaphase-FISH in patients with acute lymphoblastic leukemia in remission.Leukemia 1997,11∶633
4 张之南主编.血液病诊断及疗效标准.第二版.北京：科学出版社，1998
(1999年5月27日收稿), 百拇医药