骨髓移植配型中组织相容性抗原Ⅱ类基因PCR-SSP分型技术的应用
作者：聂向民 王 潍 徐 群 张世训
单位：山东省血液中心(250014)
关键词：
实用医学杂志991026 组织相容性抗原(HLA)Ⅱ类基因是位于人类第6对染色体短臂远端的一组高度多态的基因，主要包括HLA-DR、DQ、DP三个亚区[1]。骨髓移植现已被接受作为治疗血液系统恶性疾病，骨髓衰竭，某些遗传病及免疫缺陷的手段。对于慢性粒细胞性白血病(CML)患者，继大剂量化疗后采用骨髓移植可使50%～70%病例治愈[2]。HLAⅡ类基因配型对提高异基因骨髓移植存活率，减少移植物抗宿主疾病(GVHD)，具有重要意义[3]。既往HLAⅡ类分型采用血清学微量淋巴细胞毒试验，近年国外实验室已转向基因分型，并已将其列为常规。我们采用序列特异性引物(SSP)PCR技术对HLA-DRB1，DQB1进行基因分型，快速简便，现报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 样本 山东医科大学附属医院提供22名拟行骨髓移植的恶性血液病患者及其相关供者样本。
1.2 DNA提取 抽取静脉血1ml，EDTA抗凝，2000×g离心取白膜层加入红细胞裂解液(NH4Cl6.35g/L，EDTA1.33g/L，Tris0.92g/L)，充分裂解红细胞，离心弃上清液，取白细胞沉淀加入蛋白酶K(10g/L)25μl，7.5M盐酸胍200μl，10%十二烷基硫酸钠(SDS)200 μl，双蒸水200μ l，70℃震荡水浴20分钟，高速离心，取上清液，加入2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA，溶于pH8.0TE溶液中备用。
1.3 引物 扩增引物由北京市血液中心提供，包括17对DRB1引物及5对DQB1引物，相应扩增检定17种DR基因型及5种DQ基因型，可识别：DRB1*01，DRB1*15，DRB1*16，DRB1*03，DRB1*04，DRB1*11，DRB1*12，DRB1*07，DRB1*08，DRB1*09，DRB1*10，DRB1*13a，DRB1*13b，DRB1*14a，DRB1*14b，DRB3，DRB4及DQB1*0201，DQB1*03，DQB1*04，DQB1*05，DQB1*06。
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1.4 扩增 美国PE公司2400基因扩增仪。扩增体系25μl，包括10×PCR扩增缓冲液2.5μl，25mMMgCl21.5μl，2mM 10×dNTPs 2.5 μl，模板DNA 100 ng，TaqDNA聚合酶1u(美国Promega公司)。PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟进入PCR循环：94℃40秒，64℃40秒，72℃40秒，35个循环后继续延伸2分钟，降温至5℃。
1.5 结果分析 以1.5%琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴乙锭)，0.5×TBE电泳缓冲液电泳，302nm波长紫外线透射仪下显示扩增条带。
2 结果
22例骨髓移植供受者HLA-DR，DQ基因分型结果见表1。
表1 22例骨髓移植供受者HLA-DR、DQ基因分型结果 样本
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PCR-SSP扩增分型
扩增片段长度(bP)
血清学特异性
患者1
DRB1*04，DRB1*07，DRB4
269，233，222，DR4，DR7
DQB1*0201，DQB1*03
214，79
DQ2，DQ3
供者1
, http://www.100md.com
DRB1*04，DRB1*09，DRB4
269，180，222
DR4，DR9
DQB1*03
79
DQ3
患者2
DRB1*11，DRB1*15，DRB3
177，205，240
DR11，DR15
, http://www.100md.com
DQB1*03，DQB1*06
79，81
DQ3，DQ6
供者2
DRB1*14a，DRB1*15，DRB3
210，205，240
DR14，DR15
DQB1*05，DQB1*06
225，81
DQ5，DQ6
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患者3
DRB1*09，DRB1*15，DRB4
180，205，222
DR9，DR15
DQB1*03，DQB1*06
79，81
DQ3，DQ6
供者3
DRB1*04，DRB1*11，DRB3，DRB4
269，177，240，222
, 百拇医药
DR4，DR11
DQB1*03
79
DQ3
患者4
DRB1*08，DRB1*13a，DRB3
222，137，240
DR8，DR13
DQB1*06
81
DQ6
, 百拇医药
供者4
DRB1*08，DRB1*11，DRB3
222，177，240
DR8，DR11
DQB1*03，DQB1*06
79，81
DQ3，DQ6
患者5
DRB1*04，DRB1*15，DRB4
269，205，222
, http://www.100md.com
DR4，DR15
DQB1*04，DQB1*06
192，81
DQ4，DQ6
供者5-1
DRB1*04，DRB1*11，DRB3，DRB4
269，177，240，222
DR4，DR11
DQB1*03，DQB1*04
79，192
, http://www.100md.com
DQ3，DQ4
供者5-2
DRB1*09，DRB1*15，DRB4
180，205，222
DR9，DR15
DQB1*03，DQB1*06
79，81
DQ3，DQ6
患者6
DRB1*09，DRB1*10，DRB4
, 百拇医药
180，213，222
DR9，DR10
DQB1*03，DQB1*05
79，225
DQ3，DQ5
供者6
DRB1*10，DRB1*12，DRB3
213，110，240
DR10，DR12
DQB1*05，DQB1*03
, 百拇医药
225，79
DQ3，DQ5
患者7
DRB1*04，DRB1*09，DRB4
269，180，222
DR4，DR9
DQB1*03
79
DQ3
供者7-1
DRB1*10，DRB1*12，DRB3
, 百拇医药
213，110，240
DR10，DR12
DQB1*03，DQB1*05
79，225
DQ3，DQ5
供者7-2
DRB1*09，DRB1*10，DRB4
180，213，222
DR9，DR10
DQB1*03，DQB1*05
, http://www.100md.com
79，225
DQ3，DQ5
患者8
DRB1*11，DRB1*15，DRB3
177，205，240
DR11，DR15
DQB1*03，DQB1*06
79，81
DQ3，DQ6
供者8
DRB1*11，DRB1*15，DRB3
, 百拇医药
177，205，240
DR11，DR15
DQB1*03，DQB1*06
79，81
DQ3，DQ6
患者9
DRB1*09，DRB1*14a，DRB3，DRB4
180，210，240，222
DR9，DR14
DQB1*03，DQB1*05
, 百拇医药
79，225
DQ3，DQ5
供者9
DRB1*09，DRB1*14a，DRB3，DRB4
180，210，240，222
DR9，DR14
DQB1*03，DQB1*05
79，225
DQ3，DQ5
患者10
, 百拇医药 DRB1*04，DRB1*15，DRB4
269，205，222
DR4，DR15
DQB1*04，DQB1*06
192，81
DQ4，DQ6
供者10
DRB1*04，DRB1*07，DRB4
269，233，222
DR4，DR7
, 百拇医药
DQB1*04，DQB1*0201
192，214
DQ4，DQ2
3 讨论
HLA基因位于人类第6号染色体短臂6P23.1片断上。DR区有1个功能性α链基因(2个等位基因)及4个功能性β链基因DRB1，BRB3，DRB4和DRB5，4个功能性β链基因是全部血清学特异性(DR1～DR18，DR52，DR53)的基因密码[4]。HLA-DQ区有2个DQA基因和3个DQB基因(DQB1，DQB2和DQB3)。其中DQA1和DQB1为结构基因，DQ的表型是由DQB1决定的[5]。
器官移植配型中重要的是了解供、受者之间的HLA基因型是否相合。既往配型采用血清学定型分析，由于高质量的Ⅱ类定型血清来源困难，存在交叉反应，而且血清学相同者基因型不一定相同，导致比较高的分型错误率[6]。与其比较，PCR-SSP具有特异性高的特点，避免了杂交、酶切等步骤。整个过程3～4小时即可完成，是血清学和其它PCR基础上的基因分型方法难以比拟的。在以上分型标本中，患者8，患者9与其供者DR，DQ基因分型全相同，其中，患者8成功地进行了骨髓移植，移植后情况良好，未出现严重移植物抗宿主病。
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4 参考文献
1 刘红雨.HLA-Ⅱ类基因表达的上游调节.国外医学输血及血液学分册，1997，20(3)：162.
2 Clift RA,Appelbaum FR,Thomos ED. Treatment of chronic myeloid leuke mia by marrow transplantation. Blood,1993,82(7):1954～1956.
3 Stroneck DF. Results of bone marrow transplant from unrelated donor . Transfusion,1992,32:180～189.
4 Marsh SG. HLA class Ⅱ nucleotide sequences. Human Immunol,1992,35( 1):21.
5 Marsh SG. Bodmer JG. HLA class Ⅱ region nucleotide sequence. Tissu e Antigens,1995,46:258～280.
6 Willem V,Ilias IN,Anholts J. Biotinylated DRB sequence -specific
oligonucleotides comparision to serologic HLA-DR typing of o rgan donors in eurotransplant. Human Immunol,1993,37:59., http://www.100md.com
单位：山东省血液中心(250014)
关键词：
实用医学杂志991026 组织相容性抗原(HLA)Ⅱ类基因是位于人类第6对染色体短臂远端的一组高度多态的基因，主要包括HLA-DR、DQ、DP三个亚区[1]。骨髓移植现已被接受作为治疗血液系统恶性疾病，骨髓衰竭，某些遗传病及免疫缺陷的手段。对于慢性粒细胞性白血病(CML)患者，继大剂量化疗后采用骨髓移植可使50%～70%病例治愈[2]。HLAⅡ类基因配型对提高异基因骨髓移植存活率，减少移植物抗宿主疾病(GVHD)，具有重要意义[3]。既往HLAⅡ类分型采用血清学微量淋巴细胞毒试验，近年国外实验室已转向基因分型，并已将其列为常规。我们采用序列特异性引物(SSP)PCR技术对HLA-DRB1，DQB1进行基因分型，快速简便，现报告如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 样本 山东医科大学附属医院提供22名拟行骨髓移植的恶性血液病患者及其相关供者样本。
1.2 DNA提取 抽取静脉血1ml，EDTA抗凝，2000×g离心取白膜层加入红细胞裂解液(NH4Cl6.35g/L，EDTA1.33g/L，Tris0.92g/L)，充分裂解红细胞，离心弃上清液，取白细胞沉淀加入蛋白酶K(10g/L)25μl，7.5M盐酸胍200μl，10%十二烷基硫酸钠(SDS)200 μl，双蒸水200μ l，70℃震荡水浴20分钟，高速离心，取上清液，加入2.5倍体积预冷无水乙醇沉淀DNA，溶于pH8.0TE溶液中备用。
1.3 引物 扩增引物由北京市血液中心提供，包括17对DRB1引物及5对DQB1引物，相应扩增检定17种DR基因型及5种DQ基因型，可识别：DRB1*01，DRB1*15，DRB1*16，DRB1*03，DRB1*04，DRB1*11，DRB1*12，DRB1*07，DRB1*08，DRB1*09，DRB1*10，DRB1*13a，DRB1*13b，DRB1*14a，DRB1*14b，DRB3，DRB4及DQB1*0201，DQB1*03，DQB1*04，DQB1*05，DQB1*06。
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1.4 扩增 美国PE公司2400基因扩增仪。扩增体系25μl，包括10×PCR扩增缓冲液2.5μl，25mMMgCl21.5μl，2mM 10×dNTPs 2.5 μl，模板DNA 100 ng，TaqDNA聚合酶1u(美国Promega公司)。PCR扩增程序为：94℃预变性2分钟进入PCR循环：94℃40秒，64℃40秒，72℃40秒，35个循环后继续延伸2分钟，降温至5℃。
1.5 结果分析 以1.5%琼脂糖凝胶(含0.5μg/ml溴乙锭)，0.5×TBE电泳缓冲液电泳，302nm波长紫外线透射仪下显示扩增条带。
2 结果
22例骨髓移植供受者HLA-DR，DQ基因分型结果见表1。
表1 22例骨髓移植供受者HLA-DR、DQ基因分型结果 样本
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PCR-SSP扩增分型
扩增片段长度(bP)
血清学特异性
患者1
DRB1*04，DRB1*07，DRB4
269，233，222，DR4，DR7
DQB1*0201，DQB1*03
214，79
DQ2，DQ3
供者1
, http://www.100md.com
DRB1*04，DRB1*09，DRB4
269，180，222
DR4，DR9
DQB1*03
79
DQ3
患者2
DRB1*11，DRB1*15，DRB3
177，205，240
DR11，DR15
, http://www.100md.com
DQB1*03，DQB1*06
79，81
DQ3，DQ6
供者2
DRB1*14a，DRB1*15，DRB3
210，205，240
DR14，DR15
DQB1*05，DQB1*06
225，81
DQ5，DQ6
, http://www.100md.com
患者3
DRB1*09，DRB1*15，DRB4
180，205，222
DR9，DR15
DQB1*03，DQB1*06
79，81
DQ3，DQ6
供者3
DRB1*04，DRB1*11，DRB3，DRB4
269，177，240，222
, 百拇医药
DR4，DR11
DQB1*03
79
DQ3
患者4
DRB1*08，DRB1*13a，DRB3
222，137，240
DR8，DR13
DQB1*06
81
DQ6
, 百拇医药
供者4
DRB1*08，DRB1*11，DRB3
222，177，240
DR8，DR11
DQB1*03，DQB1*06
79，81
DQ3，DQ6
患者5
DRB1*04，DRB1*15，DRB4
269，205，222
, http://www.100md.com
DR4，DR15
DQB1*04，DQB1*06
192，81
DQ4，DQ6
供者5-1
DRB1*04，DRB1*11，DRB3，DRB4
269，177，240，222
DR4，DR11
DQB1*03，DQB1*04
79，192
, http://www.100md.com
DQ3，DQ4
供者5-2
DRB1*09，DRB1*15，DRB4
180，205，222
DR9，DR15
DQB1*03，DQB1*06
79，81
DQ3，DQ6
患者6
DRB1*09，DRB1*10，DRB4
, 百拇医药
180，213，222
DR9，DR10
DQB1*03，DQB1*05
79，225
DQ3，DQ5
供者6
DRB1*10，DRB1*12，DRB3
213，110，240
DR10，DR12
DQB1*05，DQB1*03
, 百拇医药
225，79
DQ3，DQ5
患者7
DRB1*04，DRB1*09，DRB4
269，180，222
DR4，DR9
DQB1*03
79
DQ3
供者7-1
DRB1*10，DRB1*12，DRB3
, 百拇医药
213，110，240
DR10，DR12
DQB1*03，DQB1*05
79，225
DQ3，DQ5
供者7-2
DRB1*09，DRB1*10，DRB4
180，213，222
DR9，DR10
DQB1*03，DQB1*05
, http://www.100md.com
79，225
DQ3，DQ5
患者8
DRB1*11，DRB1*15，DRB3
177，205，240
DR11，DR15
DQB1*03，DQB1*06
79，81
DQ3，DQ6
供者8
DRB1*11，DRB1*15，DRB3
, 百拇医药
177，205，240
DR11，DR15
DQB1*03，DQB1*06
79，81
DQ3，DQ6
患者9
DRB1*09，DRB1*14a，DRB3，DRB4
180，210，240，222
DR9，DR14
DQB1*03，DQB1*05
, 百拇医药
79，225
DQ3，DQ5
供者9
DRB1*09，DRB1*14a，DRB3，DRB4
180，210，240，222
DR9，DR14
DQB1*03，DQB1*05
79，225
DQ3，DQ5
患者10
, 百拇医药 DRB1*04，DRB1*15，DRB4
269，205，222
DR4，DR15
DQB1*04，DQB1*06
192，81
DQ4，DQ6
供者10
DRB1*04，DRB1*07，DRB4
269，233，222
DR4，DR7
, 百拇医药
DQB1*04，DQB1*0201
192，214
DQ4，DQ2
3 讨论
HLA基因位于人类第6号染色体短臂6P23.1片断上。DR区有1个功能性α链基因(2个等位基因)及4个功能性β链基因DRB1，BRB3，DRB4和DRB5，4个功能性β链基因是全部血清学特异性(DR1～DR18，DR52，DR53)的基因密码[4]。HLA-DQ区有2个DQA基因和3个DQB基因(DQB1，DQB2和DQB3)。其中DQA1和DQB1为结构基因，DQ的表型是由DQB1决定的[5]。
器官移植配型中重要的是了解供、受者之间的HLA基因型是否相合。既往配型采用血清学定型分析，由于高质量的Ⅱ类定型血清来源困难，存在交叉反应，而且血清学相同者基因型不一定相同，导致比较高的分型错误率[6]。与其比较，PCR-SSP具有特异性高的特点，避免了杂交、酶切等步骤。整个过程3～4小时即可完成，是血清学和其它PCR基础上的基因分型方法难以比拟的。在以上分型标本中，患者8，患者9与其供者DR，DQ基因分型全相同，其中，患者8成功地进行了骨髓移植，移植后情况良好，未出现严重移植物抗宿主病。
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4 参考文献
1 刘红雨.HLA-Ⅱ类基因表达的上游调节.国外医学输血及血液学分册，1997，20(3)：162.
2 Clift RA,Appelbaum FR,Thomos ED. Treatment of chronic myeloid leuke mia by marrow transplantation. Blood,1993,82(7):1954～1956.
3 Stroneck DF. Results of bone marrow transplant from unrelated donor . Transfusion,1992,32:180～189.
4 Marsh SG. HLA class Ⅱ nucleotide sequences. Human Immunol,1992,35( 1):21.
5 Marsh SG. Bodmer JG. HLA class Ⅱ region nucleotide sequence. Tissu e Antigens,1995,46:258～280.
6 Willem V,Ilias IN,Anholts J. Biotinylated DRB sequence -specific
oligonucleotides comparision to serologic HLA-DR typing of o rgan donors in eurotransplant. Human Immunol,1993,37:59., http://www.100md.com