免疫PCR研究进展
http://www.100md.com
国外医学临床生物化学与检验学分册 1999年第20卷第5期
免疫PCR研究进展
山东省医学科学院基础医学研究所(250062)
李经忠*综述 郭进林 审阅
摘要 本文综述了免疫-PCR自建立以来的进展状况，包括灵敏度、抗体/DNA marker连接物的制备、显示系统、免疫PCR种类以及假阳性的控制等。
关键词 免疫PCR；灵敏度；DNA marker；假阳性结果
免疫PCR技术是1992年，Sano T.等建立的检测微量抗原的高灵敏度技术[1]。该技术将血清学中抗原抗体反应，与聚合酶链反应特异扩增一段DNA分子的技术结合起来，用一段具体的DNA分子标记抗体，应用此抗体去检测抗原，PCR扩增此段DNA分子，电泳定性，根据此段DNA分子是否存在，来显示抗原是否存在。其一般程序如下：在酶联板内包被捕获抗原的抗体，加入待检测抗体，温育后充分洗涤，PCR扩增粘附在抗体/抗原复合物上的DNA分子，电泳显示结果。
, 百拇医药
1 免疫PCR灵敏度
Sano T.等应用免疫PCR检测包被在ELISA板上的牛血清白蛋白，比应用碱性磷酸酶染色的ELISA法，在检测敏感性增加大约×105，由于PCR的巨大扩增能力和特异性，使得免疫PCR技术敏感性高于目前存在的任何抗原检测系统，理论上，可以检测单分子抗原。这将有利于微量抗原的检测[1]。该技术灵敏度不亚于放射免疫测定，但无放射危害，只是用于电泳染色的溴化乙锭有致癌性和污染环境，但只要加强个人防护和电泳液的无害化处理，即可避免。
人甲状腺刺激素(hTSH)是评价甲状腺功能的指标，血标本中正常浓度较低(5×10-12M,25×10-16mol)，临床一般用放射免疫测定，超过了ELISA的检测范围。Hendrickson等用三明治夹心法免疫PCR检测hTSH水平达lfg(10-19mol)，而用夹心法ELIAS检测水平是～lpg(10-16mol)，前者灵敏度比后者高三个数量级；对另外两个分析物β-半乳糖甙酶(β-Gal)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)的检测也得出类似的结果。
, 百拇医药
Sanna PP等[3]用免疫PCR和ELISA法分别检测了大鼠脑脊液中的肿瘤坏死因子，大鼠脑室注入内毒素(LPS)后，检测脑脊液中的TNF，在LPS注入后15min，免疫PCR法就测到了TNF，而用ELISA法，在注入后90min才测到。这从侧面说明前者灵敏度明显高于后者。对血浆心钠素[4]、血浆HBsAg[5]、胃癌抗原，牛单纯疱疹病毒1[6]、杀鱼性巴斯德菌[7]和血清可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)[8]等抗原的检测均证明免疫PCR方法灵敏度高于酶免检测方法。
2 DNA marker与检测抗体的连接技术
DNA marker是免疫PCR中标记检测抗体的报告分子。DNA marker与抗体的连接方法共有以下三种。
, 百拇医药
Sano T.等用链亲合素/蛋白A(Streptavidinprotein A)基因工程融合体作为连接分子，连接生物素标记的DNA marker与抗体；此种融合蛋白的链亲合素部分可识别DNA marker上的生物素，蛋白A部分可识别抗体的Fc段。缺点是不宜用于夹心法免疫PCR检测，因为融合蛋白可与包被在微孔板内用于捕获抗原的抗体的Fc段发生结合反应。
Ruzika等用亲和素分子连接生物素化的抗体与生物素标记的DNA marker，其方法类同于酶免疫学方法中的ABC法。首先制备亲和素-生物素化的DNA分子复合物(avidin-biotinylated DNA complex,ABD complex)，然后再与生物素化的抗体反应。缺陷是直接混合法制备的ABD复合物缺乏均一性；由于亲和素为四聚体分子，与生物素化的DNA分子按1：1混合时会产生三中情况：一、自由的亲和素分子，二、被DNA饱合的亲和素，三、部分饱合的亲和素。头两种情况对检测无用，甚至占用检测位点。针对这个缺陷，有人[6，9]将生物素化的抗体、亲合素(或链亲合素)、生物素化的DNA marker分次加入温育洗涤；虽避免了上述遗憾，但增加了试验复杂性。而我们应用2-亚氨基生物素作配基的琼脂糖珠，亲和层析法制备ABD复合物，克服了上述不足。另外，尚可用交联剂制备亲和素标记的抗体[3]，不然后再进一步与一端生物素标记的DNA marker混合，制备出抗体-DNA marker混合物，也可达到理想的效果。
, http://www.100md.com
较理想的办法是预先将抗体与DNA分子连接起来，Hendrickson E等[3]将单链DNA与报告抗体可以标上大小不同的DNA标记物，达到多抗原分析。Hendrickson E等用此法同时分析了hTSH、HCG和β-Gal三个抗原指标，而且标记抗体的三个大小不同的DNA marker用同一对引物，PCR产生大小不同。
3 免疫PCR显示系统的多样化
免疫PCR的结果可能通过电泳分析获得，也可以不通过电泳，采用其它方法，如在PCR扩增时，应用标记的引物，直接将放射性同位素、四甲基罗丹明或Texas Rad等嵌入PCR产物，应用亲和素包被的微孔板捕获PCR产物，然后显色分析。其模式可大致分为直接分析法纟和酶标探针杂交分析法。
直接分析法：将所用引物之一标上生物素，另一引物标上半抗原或显色，荧光性物质，这样将PCR产物直接温育于亲和素包被的ELISA板上，洗涤后酶标抗体分析或直接酶作用显色或直接观察荧光。
, 百拇医药
酶标探针杂交分析法[11，12]：原理如下，用于PCR的引物Ⅰ5'端标有生物素，扩增后的产物变性后迅速0℃冷却，然后与标有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-半乳糖甙酶的寡聚探针混合，温育于亲和素包被的微孔板内，大约半小时至1小时后，洗去多余的未结合物，加入酶底物显色，观察结果。
Nigemyer CM等[9]比较了凝胶电泳法与微孔板法在定量和定性免疫PCR产物上的优劣。其方法是，将系列稀释的鼠IgG包被在ELISA板上，生物素化的抗鼠IgG抗体、链亲和素以及生物素化的DNA marker顺序加样、孵育、洗涤，最后PCR扩增。所用引物之一5'端生物素分子标记，扩增时加上地高辛标记的dNTP，PCR产物分别通过溴化乙锭染色的琼脂糖电泳分析和酶联免疫吸附法分析。对于后者，程序如下，扩增的PCR产物被捕获在链亲和素包被的微孔板内，检测用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，底物用pNPP(para-nitrophenylphosphate)或荧光素底物Attophos(B.M.Co.)。两法比较，酶联免疫吸附法获得较好的结果，可重复检测包被的10-9mol的鼠IgG；应用夹心法免疫PCR，此显色系统在检测重组HBsAg方面，灵敏度达2×10-18mol。作为免疫PCR的显示系统，凝胶电泳法是最基本的方法，可适用于单抗原或多抗原分析物的检测；而微孔板分析法仅适用于单抗原的检测。凝胶电泳法可区分出PCR产物的特异带与非特异产物，在设计的引物质量不高的情况下，仍可分析PCR产物；而微孔板彩色显色法则对引物质量有较高的要求，必须尽量避免引物二聚体的形成、避免非特异产物的产生。
, 百拇医药
Sanna PP等[3]在用免疫PCR法检测大鼠脑脊液中肿瘤坏死因子时，采用了放射性同位素显示系统，其方法是在PCR扩增中，加入12.5mCi(1Ci=37GBq)的[32p]dCTP,反应产物在5%聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并放射自显影；含DNA的带被切下，β闪烁粒子计数器测定放射活性。该法所测定的TNFα灵敏度是6.25pg/ml，而用普通ELISA法为100pg/ml。该法不足之处，是存在放射危害和需特殊仪器设备。
4 免疫PCR种类
多抗原分析物免疫PCR，就是同时检测多种抗原。放射性同位素、荧光素、酶和化学发光法标记的抗体，已被开发用于多分析物的检测，但来自不同标记的重叠信号和扫描不同信号密度上的困难，使上述方法尚未实用。相对而言，DNA为多分析物区分提供了理想的分子标记，大小不同的DNA分子可以通过电泳准确、定量地区分。Hendrickson ER等[3]用99个碱基的寡核苷酸标记的HCG抗体、85个碱基寡核苷酸标记的hTSH抗体和55个碱基寡核苷酸标记的β-Gal抗体同时检测HCG、hTSH、β-Gal 3个分析物；而PCR扩增进，3个寡核苷酸应用一对引物，但产物分子量各为99bp、85bp、55bp，因而各个抗原得以鉴定。
, 百拇医药
Zhou[12]H和Hendrickson[2]分别在其论著中谈到单引物免疫PCR，所谓单引物免疫PCR，就是标记抗体的DNA指示分子的两侧翼含相同的引物序列区，可用单引物PCR扩增；该法可提高PCR扩增效率，且适于多抗原免疫PCR法。
双相免疫PCR，就是同时检测病原体抗体又检测病原体基因的免疫PCR。其原理就是一对用于扩增某病原体基因的引物，被人工加在标记抗体的DNA marker的两端，使二者共用一对引物，但产物分子量大小不同，达到免疫PCR在检测抗原的同时，又检测了目的基因。
总之，目前而言，免疫PCR可分为单分析物免疫PCR、多分析物免疫PCR，单引物免疫PCR以及双相免疫PCR。
5 免疫PCR假阳性的控制
充分的洗涤是必要的，对ELISA板在包被后的封闭也是不可缺少的。同时遵守普遍PCR的假阳性预防措施。
, 百拇医药
另外可设假阳性指示分子，假阳性指示分子就是免疫PCR程序中，与DNA marker分子一起加样而与抗体结合的DNA分子，作为最后的洗涤程序是否洗涤彻底的标志，若洗涤不彻底，非特异粘附在管壁上，则与DNA marker一同扩增，电泳显性，其意义在说明DNA marker是否存在非特异吸附；若假阳性指示分子的PCR产物出现，则DNA marker的PCR产物不能充分代表抗原，可能是一种假阳性结果，试验需重复，假阳性指示分子是免疫PCR系统内在信息的反馈。
免疫PCR技术日趋成熟，是近年出现的新一代免疫检测技术，灵敏度不亚于放射免疫测定，比ELISA法高几个数量级。免疫PCR技术中，DNA marker与抗体的连接，将多采用预制的抗体-DNA分子连接物，简化操作程序。免疫PCR显示系统，仍将以电泳为主，其它为辅。免疫PCR假阳性的控制，除遵守一般注意事项外，还可加入假阳性指示分子，作为洗涤是否彻底的标志。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Sano T,Smith CL,Cantor CR.Science,1992;258(5079):120-122
2 Hendrickson ER,Hatfield TM,Joerger RD,et al.Nucleic Acids Res,1995;23(3):522-529
3 Sanna PP,Weiss F,Samson ME,et aL.Proc.Natl Acad Sci USA,1995;92:272-275
4 Numata Y,Matsumoto Y.Clin Chim.Acta.1997;259(1-2):169-176
5 Maia M,Takahashis H,Adler K,et al.J Virol Methods,1995;52(3):273-278
, http://www.100md.com
6 Mweene AS,Okazaki K,Kide H,et al.Jpn J Vet,Res,1996;44(3):165-174
7 Kakizaki E,Yoskida T,Kawakami H,et al.Lett.Appl Microbiol,1996;23(2):101-103
8 Suzuki A,Itoh F,Hinoda Y,et al.Jpn J Cancer Res,1995;86(9):885-889
9 Niemyer CM,Adler M,Blohm D.Anal Biochem,1997;246:140-145
10 Van Gijlswijk RPM,et al.J Immunol Methods,1996;189:117-127
11 Soumet C,Ermel G,Boutin P,et al.Biotechniques,1995;19:792-796
12 Bortolin S,Christopoulos TS & Verhaegen M.Anal.Chem,1996;68:834-840
校对时间: 99-12-08 22:05:26 董静, 百拇医药
山东省医学科学院基础医学研究所(250062)
李经忠*综述 郭进林 审阅
摘要 本文综述了免疫-PCR自建立以来的进展状况，包括灵敏度、抗体/DNA marker连接物的制备、显示系统、免疫PCR种类以及假阳性的控制等。
关键词 免疫PCR；灵敏度；DNA marker；假阳性结果
免疫PCR技术是1992年，Sano T.等建立的检测微量抗原的高灵敏度技术[1]。该技术将血清学中抗原抗体反应，与聚合酶链反应特异扩增一段DNA分子的技术结合起来，用一段具体的DNA分子标记抗体，应用此抗体去检测抗原，PCR扩增此段DNA分子，电泳定性，根据此段DNA分子是否存在，来显示抗原是否存在。其一般程序如下：在酶联板内包被捕获抗原的抗体，加入待检测抗体，温育后充分洗涤，PCR扩增粘附在抗体/抗原复合物上的DNA分子，电泳显示结果。
, 百拇医药
1 免疫PCR灵敏度
Sano T.等应用免疫PCR检测包被在ELISA板上的牛血清白蛋白，比应用碱性磷酸酶染色的ELISA法，在检测敏感性增加大约×105，由于PCR的巨大扩增能力和特异性，使得免疫PCR技术敏感性高于目前存在的任何抗原检测系统，理论上，可以检测单分子抗原。这将有利于微量抗原的检测[1]。该技术灵敏度不亚于放射免疫测定，但无放射危害，只是用于电泳染色的溴化乙锭有致癌性和污染环境，但只要加强个人防护和电泳液的无害化处理，即可避免。
人甲状腺刺激素(hTSH)是评价甲状腺功能的指标，血标本中正常浓度较低(5×10-12M,25×10-16mol)，临床一般用放射免疫测定，超过了ELISA的检测范围。Hendrickson等用三明治夹心法免疫PCR检测hTSH水平达lfg(10-19mol)，而用夹心法ELIAS检测水平是～lpg(10-16mol)，前者灵敏度比后者高三个数量级；对另外两个分析物β-半乳糖甙酶(β-Gal)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)的检测也得出类似的结果。
, 百拇医药
Sanna PP等[3]用免疫PCR和ELISA法分别检测了大鼠脑脊液中的肿瘤坏死因子，大鼠脑室注入内毒素(LPS)后，检测脑脊液中的TNF，在LPS注入后15min，免疫PCR法就测到了TNF，而用ELISA法，在注入后90min才测到。这从侧面说明前者灵敏度明显高于后者。对血浆心钠素[4]、血浆HBsAg[5]、胃癌抗原，牛单纯疱疹病毒1[6]、杀鱼性巴斯德菌[7]和血清可溶性细胞间粘附分子-1(sICAM-1)[8]等抗原的检测均证明免疫PCR方法灵敏度高于酶免检测方法。
2 DNA marker与检测抗体的连接技术
DNA marker是免疫PCR中标记检测抗体的报告分子。DNA marker与抗体的连接方法共有以下三种。
, 百拇医药
Sano T.等用链亲合素/蛋白A(Streptavidinprotein A)基因工程融合体作为连接分子，连接生物素标记的DNA marker与抗体；此种融合蛋白的链亲合素部分可识别DNA marker上的生物素，蛋白A部分可识别抗体的Fc段。缺点是不宜用于夹心法免疫PCR检测，因为融合蛋白可与包被在微孔板内用于捕获抗原的抗体的Fc段发生结合反应。
Ruzika等用亲和素分子连接生物素化的抗体与生物素标记的DNA marker，其方法类同于酶免疫学方法中的ABC法。首先制备亲和素-生物素化的DNA分子复合物(avidin-biotinylated DNA complex,ABD complex)，然后再与生物素化的抗体反应。缺陷是直接混合法制备的ABD复合物缺乏均一性；由于亲和素为四聚体分子，与生物素化的DNA分子按1：1混合时会产生三中情况：一、自由的亲和素分子，二、被DNA饱合的亲和素，三、部分饱合的亲和素。头两种情况对检测无用，甚至占用检测位点。针对这个缺陷，有人[6，9]将生物素化的抗体、亲合素(或链亲合素)、生物素化的DNA marker分次加入温育洗涤；虽避免了上述遗憾，但增加了试验复杂性。而我们应用2-亚氨基生物素作配基的琼脂糖珠，亲和层析法制备ABD复合物，克服了上述不足。另外，尚可用交联剂制备亲和素标记的抗体[3]，不然后再进一步与一端生物素标记的DNA marker混合，制备出抗体-DNA marker混合物，也可达到理想的效果。
, http://www.100md.com
较理想的办法是预先将抗体与DNA分子连接起来，Hendrickson E等[3]将单链DNA与报告抗体可以标上大小不同的DNA标记物，达到多抗原分析。Hendrickson E等用此法同时分析了hTSH、HCG和β-Gal三个抗原指标，而且标记抗体的三个大小不同的DNA marker用同一对引物，PCR产生大小不同。
3 免疫PCR显示系统的多样化
免疫PCR的结果可能通过电泳分析获得，也可以不通过电泳，采用其它方法，如在PCR扩增时，应用标记的引物，直接将放射性同位素、四甲基罗丹明或Texas Rad等嵌入PCR产物，应用亲和素包被的微孔板捕获PCR产物，然后显色分析。其模式可大致分为直接分析法纟和酶标探针杂交分析法。
直接分析法：将所用引物之一标上生物素，另一引物标上半抗原或显色，荧光性物质，这样将PCR产物直接温育于亲和素包被的ELISA板上，洗涤后酶标抗体分析或直接酶作用显色或直接观察荧光。
, 百拇医药
酶标探针杂交分析法[11，12]：原理如下，用于PCR的引物Ⅰ5'端标有生物素，扩增后的产物变性后迅速0℃冷却，然后与标有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或β-半乳糖甙酶的寡聚探针混合，温育于亲和素包被的微孔板内，大约半小时至1小时后，洗去多余的未结合物，加入酶底物显色，观察结果。
Nigemyer CM等[9]比较了凝胶电泳法与微孔板法在定量和定性免疫PCR产物上的优劣。其方法是，将系列稀释的鼠IgG包被在ELISA板上，生物素化的抗鼠IgG抗体、链亲和素以及生物素化的DNA marker顺序加样、孵育、洗涤，最后PCR扩增。所用引物之一5'端生物素分子标记，扩增时加上地高辛标记的dNTP，PCR产物分别通过溴化乙锭染色的琼脂糖电泳分析和酶联免疫吸附法分析。对于后者，程序如下，扩增的PCR产物被捕获在链亲和素包被的微孔板内，检测用碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，底物用pNPP(para-nitrophenylphosphate)或荧光素底物Attophos(B.M.Co.)。两法比较，酶联免疫吸附法获得较好的结果，可重复检测包被的10-9mol的鼠IgG；应用夹心法免疫PCR，此显色系统在检测重组HBsAg方面，灵敏度达2×10-18mol。作为免疫PCR的显示系统，凝胶电泳法是最基本的方法，可适用于单抗原或多抗原分析物的检测；而微孔板分析法仅适用于单抗原的检测。凝胶电泳法可区分出PCR产物的特异带与非特异产物，在设计的引物质量不高的情况下，仍可分析PCR产物；而微孔板彩色显色法则对引物质量有较高的要求，必须尽量避免引物二聚体的形成、避免非特异产物的产生。
, 百拇医药
Sanna PP等[3]在用免疫PCR法检测大鼠脑脊液中肿瘤坏死因子时，采用了放射性同位素显示系统，其方法是在PCR扩增中，加入12.5mCi(1Ci=37GBq)的[32p]dCTP,反应产物在5%聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离，并放射自显影；含DNA的带被切下，β闪烁粒子计数器测定放射活性。该法所测定的TNFα灵敏度是6.25pg/ml，而用普通ELISA法为100pg/ml。该法不足之处，是存在放射危害和需特殊仪器设备。
4 免疫PCR种类
多抗原分析物免疫PCR，就是同时检测多种抗原。放射性同位素、荧光素、酶和化学发光法标记的抗体，已被开发用于多分析物的检测，但来自不同标记的重叠信号和扫描不同信号密度上的困难，使上述方法尚未实用。相对而言，DNA为多分析物区分提供了理想的分子标记，大小不同的DNA分子可以通过电泳准确、定量地区分。Hendrickson ER等[3]用99个碱基的寡核苷酸标记的HCG抗体、85个碱基寡核苷酸标记的hTSH抗体和55个碱基寡核苷酸标记的β-Gal抗体同时检测HCG、hTSH、β-Gal 3个分析物；而PCR扩增进，3个寡核苷酸应用一对引物，但产物分子量各为99bp、85bp、55bp，因而各个抗原得以鉴定。
, 百拇医药
Zhou[12]H和Hendrickson[2]分别在其论著中谈到单引物免疫PCR，所谓单引物免疫PCR，就是标记抗体的DNA指示分子的两侧翼含相同的引物序列区，可用单引物PCR扩增；该法可提高PCR扩增效率，且适于多抗原免疫PCR法。
双相免疫PCR，就是同时检测病原体抗体又检测病原体基因的免疫PCR。其原理就是一对用于扩增某病原体基因的引物，被人工加在标记抗体的DNA marker的两端，使二者共用一对引物，但产物分子量大小不同，达到免疫PCR在检测抗原的同时，又检测了目的基因。
总之，目前而言，免疫PCR可分为单分析物免疫PCR、多分析物免疫PCR，单引物免疫PCR以及双相免疫PCR。
5 免疫PCR假阳性的控制
充分的洗涤是必要的，对ELISA板在包被后的封闭也是不可缺少的。同时遵守普遍PCR的假阳性预防措施。
, 百拇医药
另外可设假阳性指示分子，假阳性指示分子就是免疫PCR程序中，与DNA marker分子一起加样而与抗体结合的DNA分子，作为最后的洗涤程序是否洗涤彻底的标志，若洗涤不彻底，非特异粘附在管壁上，则与DNA marker一同扩增，电泳显性，其意义在说明DNA marker是否存在非特异吸附；若假阳性指示分子的PCR产物出现，则DNA marker的PCR产物不能充分代表抗原，可能是一种假阳性结果，试验需重复，假阳性指示分子是免疫PCR系统内在信息的反馈。
免疫PCR技术日趋成熟，是近年出现的新一代免疫检测技术，灵敏度不亚于放射免疫测定，比ELISA法高几个数量级。免疫PCR技术中，DNA marker与抗体的连接，将多采用预制的抗体-DNA分子连接物，简化操作程序。免疫PCR显示系统，仍将以电泳为主，其它为辅。免疫PCR假阳性的控制，除遵守一般注意事项外，还可加入假阳性指示分子，作为洗涤是否彻底的标志。
参考文献
, http://www.100md.com
1 Sano T,Smith CL,Cantor CR.Science,1992;258(5079):120-122
2 Hendrickson ER,Hatfield TM,Joerger RD,et al.Nucleic Acids Res,1995;23(3):522-529
3 Sanna PP,Weiss F,Samson ME,et aL.Proc.Natl Acad Sci USA,1995;92:272-275
4 Numata Y,Matsumoto Y.Clin Chim.Acta.1997;259(1-2):169-176
5 Maia M,Takahashis H,Adler K,et al.J Virol Methods,1995;52(3):273-278
, http://www.100md.com
6 Mweene AS,Okazaki K,Kide H,et al.Jpn J Vet,Res,1996;44(3):165-174
7 Kakizaki E,Yoskida T,Kawakami H,et al.Lett.Appl Microbiol,1996;23(2):101-103
8 Suzuki A,Itoh F,Hinoda Y,et al.Jpn J Cancer Res,1995;86(9):885-889
9 Niemyer CM,Adler M,Blohm D.Anal Biochem,1997;246:140-145
10 Van Gijlswijk RPM,et al.J Immunol Methods,1996;189:117-127
11 Soumet C,Ermel G,Boutin P,et al.Biotechniques,1995;19:792-796
12 Bortolin S,Christopoulos TS & Verhaegen M.Anal.Chem,1996;68:834-840
校对时间: 99-12-08 22:05:26 董静, 百拇医药