辐射对淋巴细胞RNA、蛋白质合成的影响及其诱导的适应性反应*
作者：赵雨杰 苏燎原 刘芬菊 孔向蓉
单位：赵雨杰：博士研究生(现在东南大学吴健雄实验室博士后流动站工作)；刘芬菊 孔向蓉(苏州医学院医学放射生物学教研室,苏州,215007)
关键词：淋巴细胞；RNA合成；蛋白质合成；适应性反应
苏州医学院学报991202 摘要 目的 观察电离辐射对淋巴细胞RNA、蛋白质合成的影响及其诱导的适应性反应。方法 采用体外培养的淋巴细胞，经丝裂原PHA刺激后，14C-UR、3H-Tyrosine双标记掺入法观察0.5～8.0Gy γ射线照射后，RNA和蛋白质合成速率的变化及低剂量(D1＝4.8cGy)照射后相继攻击剂量(D2)照射，淋巴细胞所表现的适应性反应。结果 体外培养的淋巴细胞随着照射剂量的增加，RNA和蛋白质合成速度下降，并表现出对低剂量辐射诱导的适应性反应。结论 电离辐射可致淋巴细胞RNA、蛋白质合成速度下降，但低剂量辐射可诱导淋巴细胞的适应性反应。
, http://www.100md.com
中图法分类 R811.5
Radiation Effect and Adaptive Response by Low-dose Irradiation
on RNA and Protein Synthesis in Human Lymphocytes
Zhao Yujie,Su Liaoyuan,Liu Fenju,et al
(Department of Medical Radiobiology,Suzhou Medical College,Suzhou ,215007)
Abstract Objective Radiation effect and adaptive response indu ced by low dose irradiation on synthesis of RNA and protein in human lymphocytes were studied.Methods Double labeling incorportaion of 14C -UR and 3H-Tyrosine in human lymphocytes was used to reflect the radiation e ffect and adaptive response.Results The rates of protein synthesi s in lymphocyte was decreased when the irradiation dose was above 1.0 Gy.With in creasing radiation dosage,the rate of synthesis decreased significantly.While th e rate of RNA synthesis at the dose of 0.5 Gy decreased to 84.0% compared with c ontrol.The radiosensitivity of RNA is higher than that of protein.This paper als o found that the adaptive response induced by low dose irradiation.Conclus ion Radiation could decrease RNA and protein synthesis,but the adaptive r esponse were induced by low dose irradiaton.
, 百拇医药
Key words lymphocyte;RNA synthesis;protein synthesis;ada ptive response
基因转录(Gene transcription)的过程也就是RNA的生物合成过程，在RNA聚合酶催化作用下将DNA分子上核苷酸序列转变为RNA分子上核苷酸序列的过程。如果电离辐射对基因转录过程的任意一个环节发生作用都会影响RNA的合成速度。RNA合成速度的改变将影响蛋白质的生物合成。细胞受照射后的RNA合成变化比体外试验复杂，多数报道认为细胞受γ射线照射后受抑制，但也有报告认为在中等剂量照射后RNA合成是增强的。我们采用了14C-UR、3H-Tyrosine双标记的方法[1]，同时研究了淋巴细胞照射后总RNA和蛋白质生物合成速度的变化及低剂量辐射诱导的适应性反应，结果报道如下。
1 材料和方法
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1.1 实验材料：6名健康献血员静脉血，各2ml，肝素抗凝。
1.2 实验分组：将每个人的静脉血各0.1ml，分别装入培养瓶，共10份。其中5份为对照组，5份为低剂量照射组。
1.3 照射条件及方法：低剂量照射组采用226Raγ射线照射，强度为38.9×107Bq，辐射源置37℃培养箱中。培养瓶按同心圆排列在木制支架上，距辐射源50cm，剂量率为0.48cGy/h，照射10h，吸收剂量为4.8cGy。照射后继续培养14h给予攻击剂量照射。攻击剂量照射组用60Co-γ射线源照射，强度为2.22×1015Bq，样品距放射源3.0m，剂量率为1.0Gy/min，分别照射0.5、1.0、4.0、8.0Gy。
1.4 细胞培养条件：将攻击剂量照射组30份样品和6份(4.8cGy+1.0Gy)照射组全血样品，分别加入含有100mg/LPHA(广州)、15%AB型血清的PRMI1640培养液2ml，培养48h。攻击剂量照射后置37℃培养箱，加入1.85×107Bq/L3H-Tyrosine、1.85×107Bq/L14C-UR各20μl/瓶(中国医科院放射医学研究所)。温箱培养24h后，终止培养，抽滤在49型玻璃纤维膜上，烘干。用BeckmanLs-6800型液体闪烁计数仪(USA)测量双标记的cpm值。
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2 结果
2.1 攻击剂量照射对蛋白质合成速度的影响:从表1中可看出，0.5Gy的照射剂量，对于体外培养的外周血淋巴细胞蛋白质的合成影响不明显，3H-Tyrosine掺入的cpm值不但没有下降，还略有升高，虽与对照组的cpm值经统计学处理未见有显著性差异，但考虑到淋巴细胞照射后RNA合成速度下降了16%，而蛋白质合成速度未见相应下降，提示在此剂量照射条件下对蛋白质合成有刺激作用。当照射剂量达到1.0Gy时，蛋白质合成速度下降至对照组的83.0%。说明辐射对淋巴细胞的损伤作用超过了辐射所引起的刺激兴奋作用[2]，因而导致蛋白质合成速度的下降。4.0Gy和8.0Gy照射使蛋白质合成的速度分别下降至58.5%和44.9%；随着照射剂量的增加，蛋白质合成速度的抑制程度也在增加。
表1 γ射线对淋巴细胞的辐射效应(
±s)
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剂量(Gy)
0.0
0.5
1.0
4.0
8.0
3H-Tyrosine
PCCH
3408±278
100±0.0
3484±293
102.5±8.6
, http://www.100md.com
2829±220**
83.5±6.5**
1992±253**
58.5±7.4**
1529±258*
44.9±7.6**
14C-UR
PCCC
5365±312
100±0.0
, http://www.100md.com
4505±195**
84.0±3.6**
3842±259**
71.6±4.8**
2713±208**
50.6±3.9**
2486±164
46.3±3.1**
n=6;PCC:相对百分比；与对照组比较,*P<0.05，**P<0.01
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2.2 辐射对RNA合成速度的影响:体外培养的淋巴细胞在适宜的条件下，不断地合成新的RNA，我们用14C-UR掺入的方法观察细胞RNA合成速度的变化。附图表明，经不同的攻击剂量(0.5～8.0Gy)照射后，体外培养的淋巴细胞RNA合成的速度发生了不同程度变化，RNA合成速度与照射剂量呈负相关。随着照射剂量的增加，RNA合成的速度下降，在0.5～1.0Gy照射剂量范围内RNA合成速度下降比较快。当照射剂量4.0～8.0Gy时，RNA合成速度下降较慢。随着剂量的增加，合成速度下降逐渐减小。
附图 电离辐射对淋巴细胞的影响
2.3 蛋白质与RNA合成的辐射敏感性的比较：附图表明，除了8.0Gy照射剂量组之外，RNA合成的辐射敏感性大于蛋白质的辐射敏感性。至于8.0Gy照射剂量组是否存在RNA和蛋白质的辐射敏感性出现反变的问题，还需进一步加以证实。
, 百拇医药
2.4 低剂量辐射诱导蛋白质与RNA合成的适应性反应：体外培养的淋巴细胞预先给予4.8cGyγ射线照射，然后37℃温箱中培养14h后，再给予攻击剂量1.0Gy照射， 3H-Tyrosine和14C-UR双标记的实验结果(见表2)表明，蛋白质与RNA合成在低剂量辐射诱导下都表现出适应性反应。与相同攻击剂量组比较，蛋白质的合成速度达到129.8%；RNA的合成速度达到116.7%。经统计分析处理均具有极显著差别(P<0.01)。
表2 淋巴细胞对低剂量辐射的适应性反应(±s)
3H-Tyr
14C--UR
D(2)
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2829±220
3842±259
D(1+2)
3672±507**
4482±235**
RP
129.8±17.9
116.7±6.1
n=6；**与相同攻击剂量组比较，P<0.01;D(1)=4.8cGy，D(2)=1.0Gy
3 讨论
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为了阐明辐射对RNA合成的影响，学者们展开了多方面的研究，以DNA为模板，在4种核苷三磷酸、镁离子和RNA聚合酶的混合液中进行RNA的合成，可以见到随着模板照射剂量的增加，RNA合成逐渐减少，当照射剂量为10.0Gy时合成下降了20%左右，说明了模板的损伤可以使RNA合成下降[3]。
辐射作用可通过DNA损伤或活性氧的直接作用影响细胞内的转录和复制因子，从而改变信息传递过程，使某些基因转录活性增强。低剂量照射后T细胞对丝裂原的反应明显上升，c-fos和c-jun蛋白水平增高[4]；伴有热休克蛋白(HSP)表达的上调[5]。另外，低剂量辐射可以刺激清除自由基酶类的活性增高，加强细胞的抗氧化功能，防止细胞组成部分的损伤，从而保持细胞结构和功能的完整性[6,7]，使细胞表现出适应性反应。我们的实验结果证明了体外培养的淋巴细胞预先给予4.8cGy照射后再受1Gy攻击剂量照射，可以显著减轻1Gy照射所致RNA和蛋白质的损伤，也表现出低剂量诱导的适应性反应。体外培养的淋巴细胞蛋白质合成的速度随照射剂量(1.0Gy以上)的增加而下降，可能是由于RNA合成抑制，与蛋白质合成有关的酶类损伤，与膜结合的多核糖体的解离增加等作用超过了辐射引起的蛋白质合成兴奋效应，因而，出现下降的结果。最近的有关细胞周期的关卡调控途径研究认为，辐射停滞缺陷基因53(radiation arrest defective 53，RAD 53)在射线引起的DNA损伤信号被某个未知感受器感受，将信号传递给多聚酶2(POL 2)；通过有丝分裂入口关卡(mitosis entry checkpoint)蛋白1(MEC1)和端粒酶1(Tel1)激酶传导，引起RAD53蛋白磷酸化表现出活性；使细胞DNA合成抑制，或使Dun1激酶活化，活化的Dun1诱导损伤诱导性基因表达[8]，使细胞合成新的蛋白质。现有研究证实用50cGy照射细胞能诱导产生新的基因片段[9]。所以，在50cGy照射时，体外培养的淋巴细胞蛋白合成速度与对照组比较没有差别。
, 百拇医药
*中国核工业总公司资助课题(Y6920062-17)
苏燎原：导师
参考文献
1 苏燎原，等.应用3H、14C双标记法测定人血淋巴细胞DNA和RNA合成的研究.核技术， 1979， 3∶88
2 Sancar A, Rupp WD. A novel repair enzyme: UVRABC excision nuclease of Escherichia coli cuts a DNA strand on both sides of the damage region. Ce ll,1983， 33∶249
3 Hutterman J, et al. Effects of Ionizing Radiation on DNA. Berlin∶Spr ingerverlag, 1978∶235
, 百拇医药
4 Herrlich R,et al. DNA-damage-induced gene expression: signal transduc tion and relation to growth factor signaling. Rev Physiol Biochem Pharmacol, 1992，129∶187
5 Kramer M, et al. Radiation induced activation of transcription factors in mammalian cells. Radiat Envirn Biophys, 1990， 29∶303
6 Nogami M, et al. Mice chronically exposed to low dose ionizing radiati on possess splenocytes with elevated levels of HSP70 mRNA, HSC70 and HSP72 and w ith an increased capacity to proliferate. Int J Radiat Biol, 1993, 63∶775
, 百拇医药
7 Akashi M, et al. Increase in manganese superoxide dismutase by radiat ion i n human fibtoblasts: apossible mechanism of self- protection against radiation. Proc. International Symposium on Biological Effects of Low Level Exposures to Ra diation and Related Agents(ISBEELES93), Abstr. Changchun China, 1993∶75
8 Sanchez Y, et al. Regulation of rad53 by the ATM-like kinases MEC1 and TEL1 in yeast cellcycle checkpoint pathway. Science, 1996, 271(5247)∶357
9 Lydall D, Weinert T. Yeast checkpoint genes in DNA damage processing; Implications for repair and arrest. Science, 1995，270(5241)∶314
(1999年7月15日收稿), 百拇医药
单位：赵雨杰：博士研究生(现在东南大学吴健雄实验室博士后流动站工作)；刘芬菊 孔向蓉(苏州医学院医学放射生物学教研室,苏州,215007)
关键词：淋巴细胞；RNA合成；蛋白质合成；适应性反应
苏州医学院学报991202 摘要 目的 观察电离辐射对淋巴细胞RNA、蛋白质合成的影响及其诱导的适应性反应。方法 采用体外培养的淋巴细胞，经丝裂原PHA刺激后，14C-UR、3H-Tyrosine双标记掺入法观察0.5～8.0Gy γ射线照射后，RNA和蛋白质合成速率的变化及低剂量(D1＝4.8cGy)照射后相继攻击剂量(D2)照射，淋巴细胞所表现的适应性反应。结果 体外培养的淋巴细胞随着照射剂量的增加，RNA和蛋白质合成速度下降，并表现出对低剂量辐射诱导的适应性反应。结论 电离辐射可致淋巴细胞RNA、蛋白质合成速度下降，但低剂量辐射可诱导淋巴细胞的适应性反应。
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中图法分类 R811.5
Radiation Effect and Adaptive Response by Low-dose Irradiation
on RNA and Protein Synthesis in Human Lymphocytes
Zhao Yujie,Su Liaoyuan,Liu Fenju,et al
(Department of Medical Radiobiology,Suzhou Medical College,Suzhou ,215007)
Abstract Objective Radiation effect and adaptive response indu ced by low dose irradiation on synthesis of RNA and protein in human lymphocytes were studied.Methods Double labeling incorportaion of 14C -UR and 3H-Tyrosine in human lymphocytes was used to reflect the radiation e ffect and adaptive response.Results The rates of protein synthesi s in lymphocyte was decreased when the irradiation dose was above 1.0 Gy.With in creasing radiation dosage,the rate of synthesis decreased significantly.While th e rate of RNA synthesis at the dose of 0.5 Gy decreased to 84.0% compared with c ontrol.The radiosensitivity of RNA is higher than that of protein.This paper als o found that the adaptive response induced by low dose irradiation.Conclus ion Radiation could decrease RNA and protein synthesis,but the adaptive r esponse were induced by low dose irradiaton.
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Key words lymphocyte;RNA synthesis;protein synthesis;ada ptive response
基因转录(Gene transcription)的过程也就是RNA的生物合成过程，在RNA聚合酶催化作用下将DNA分子上核苷酸序列转变为RNA分子上核苷酸序列的过程。如果电离辐射对基因转录过程的任意一个环节发生作用都会影响RNA的合成速度。RNA合成速度的改变将影响蛋白质的生物合成。细胞受照射后的RNA合成变化比体外试验复杂，多数报道认为细胞受γ射线照射后受抑制，但也有报告认为在中等剂量照射后RNA合成是增强的。我们采用了14C-UR、3H-Tyrosine双标记的方法[1]，同时研究了淋巴细胞照射后总RNA和蛋白质生物合成速度的变化及低剂量辐射诱导的适应性反应，结果报道如下。
1 材料和方法
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1.1 实验材料：6名健康献血员静脉血，各2ml，肝素抗凝。
1.2 实验分组：将每个人的静脉血各0.1ml，分别装入培养瓶，共10份。其中5份为对照组，5份为低剂量照射组。
1.3 照射条件及方法：低剂量照射组采用226Raγ射线照射，强度为38.9×107Bq，辐射源置37℃培养箱中。培养瓶按同心圆排列在木制支架上，距辐射源50cm，剂量率为0.48cGy/h，照射10h，吸收剂量为4.8cGy。照射后继续培养14h给予攻击剂量照射。攻击剂量照射组用60Co-γ射线源照射，强度为2.22×1015Bq，样品距放射源3.0m，剂量率为1.0Gy/min，分别照射0.5、1.0、4.0、8.0Gy。
1.4 细胞培养条件：将攻击剂量照射组30份样品和6份(4.8cGy+1.0Gy)照射组全血样品，分别加入含有100mg/LPHA(广州)、15%AB型血清的PRMI1640培养液2ml，培养48h。攻击剂量照射后置37℃培养箱，加入1.85×107Bq/L3H-Tyrosine、1.85×107Bq/L14C-UR各20μl/瓶(中国医科院放射医学研究所)。温箱培养24h后，终止培养，抽滤在49型玻璃纤维膜上，烘干。用BeckmanLs-6800型液体闪烁计数仪(USA)测量双标记的cpm值。
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2 结果
2.1 攻击剂量照射对蛋白质合成速度的影响:从表1中可看出，0.5Gy的照射剂量，对于体外培养的外周血淋巴细胞蛋白质的合成影响不明显，3H-Tyrosine掺入的cpm值不但没有下降，还略有升高，虽与对照组的cpm值经统计学处理未见有显著性差异，但考虑到淋巴细胞照射后RNA合成速度下降了16%，而蛋白质合成速度未见相应下降，提示在此剂量照射条件下对蛋白质合成有刺激作用。当照射剂量达到1.0Gy时，蛋白质合成速度下降至对照组的83.0%。说明辐射对淋巴细胞的损伤作用超过了辐射所引起的刺激兴奋作用[2]，因而导致蛋白质合成速度的下降。4.0Gy和8.0Gy照射使蛋白质合成的速度分别下降至58.5%和44.9%；随着照射剂量的增加，蛋白质合成速度的抑制程度也在增加。
表1 γ射线对淋巴细胞的辐射效应(
±s), http://www.100md.com
剂量(Gy)
0.0
0.5
1.0
4.0
8.0
3H-Tyrosine
PCCH
3408±278
100±0.0
3484±293
102.5±8.6
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2829±220**
83.5±6.5**
1992±253**
58.5±7.4**
1529±258*
44.9±7.6**
14C-UR
PCCC
5365±312
100±0.0
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4505±195**
84.0±3.6**
3842±259**
71.6±4.8**
2713±208**
50.6±3.9**
2486±164
46.3±3.1**
n=6;PCC:相对百分比；与对照组比较,*P<0.05，**P<0.01
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2.2 辐射对RNA合成速度的影响:体外培养的淋巴细胞在适宜的条件下，不断地合成新的RNA，我们用14C-UR掺入的方法观察细胞RNA合成速度的变化。附图表明，经不同的攻击剂量(0.5～8.0Gy)照射后，体外培养的淋巴细胞RNA合成的速度发生了不同程度变化，RNA合成速度与照射剂量呈负相关。随着照射剂量的增加，RNA合成的速度下降，在0.5～1.0Gy照射剂量范围内RNA合成速度下降比较快。当照射剂量4.0～8.0Gy时，RNA合成速度下降较慢。随着剂量的增加，合成速度下降逐渐减小。
附图 电离辐射对淋巴细胞的影响
2.3 蛋白质与RNA合成的辐射敏感性的比较：附图表明，除了8.0Gy照射剂量组之外，RNA合成的辐射敏感性大于蛋白质的辐射敏感性。至于8.0Gy照射剂量组是否存在RNA和蛋白质的辐射敏感性出现反变的问题，还需进一步加以证实。
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2.4 低剂量辐射诱导蛋白质与RNA合成的适应性反应：体外培养的淋巴细胞预先给予4.8cGyγ射线照射，然后37℃温箱中培养14h后，再给予攻击剂量1.0Gy照射， 3H-Tyrosine和14C-UR双标记的实验结果(见表2)表明，蛋白质与RNA合成在低剂量辐射诱导下都表现出适应性反应。与相同攻击剂量组比较，蛋白质的合成速度达到129.8%；RNA的合成速度达到116.7%。经统计分析处理均具有极显著差别(P<0.01)。
表2 淋巴细胞对低剂量辐射的适应性反应(
±s)3H-Tyr
14C--UR
D(2)
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2829±220
3842±259
D(1+2)
3672±507**
4482±235**
RP
129.8±17.9
116.7±6.1
n=6；**与相同攻击剂量组比较，P<0.01;D(1)=4.8cGy，D(2)=1.0Gy
3 讨论
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为了阐明辐射对RNA合成的影响，学者们展开了多方面的研究，以DNA为模板，在4种核苷三磷酸、镁离子和RNA聚合酶的混合液中进行RNA的合成，可以见到随着模板照射剂量的增加，RNA合成逐渐减少，当照射剂量为10.0Gy时合成下降了20%左右，说明了模板的损伤可以使RNA合成下降[3]。
辐射作用可通过DNA损伤或活性氧的直接作用影响细胞内的转录和复制因子，从而改变信息传递过程，使某些基因转录活性增强。低剂量照射后T细胞对丝裂原的反应明显上升，c-fos和c-jun蛋白水平增高[4]；伴有热休克蛋白(HSP)表达的上调[5]。另外，低剂量辐射可以刺激清除自由基酶类的活性增高，加强细胞的抗氧化功能，防止细胞组成部分的损伤，从而保持细胞结构和功能的完整性[6,7]，使细胞表现出适应性反应。我们的实验结果证明了体外培养的淋巴细胞预先给予4.8cGy照射后再受1Gy攻击剂量照射，可以显著减轻1Gy照射所致RNA和蛋白质的损伤，也表现出低剂量诱导的适应性反应。体外培养的淋巴细胞蛋白质合成的速度随照射剂量(1.0Gy以上)的增加而下降，可能是由于RNA合成抑制，与蛋白质合成有关的酶类损伤，与膜结合的多核糖体的解离增加等作用超过了辐射引起的蛋白质合成兴奋效应，因而，出现下降的结果。最近的有关细胞周期的关卡调控途径研究认为，辐射停滞缺陷基因53(radiation arrest defective 53，RAD 53)在射线引起的DNA损伤信号被某个未知感受器感受，将信号传递给多聚酶2(POL 2)；通过有丝分裂入口关卡(mitosis entry checkpoint)蛋白1(MEC1)和端粒酶1(Tel1)激酶传导，引起RAD53蛋白磷酸化表现出活性；使细胞DNA合成抑制，或使Dun1激酶活化，活化的Dun1诱导损伤诱导性基因表达[8]，使细胞合成新的蛋白质。现有研究证实用50cGy照射细胞能诱导产生新的基因片段[9]。所以，在50cGy照射时，体外培养的淋巴细胞蛋白合成速度与对照组比较没有差别。
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*中国核工业总公司资助课题(Y6920062-17)
苏燎原：导师
参考文献
1 苏燎原，等.应用3H、14C双标记法测定人血淋巴细胞DNA和RNA合成的研究.核技术， 1979， 3∶88
2 Sancar A, Rupp WD. A novel repair enzyme: UVRABC excision nuclease of Escherichia coli cuts a DNA strand on both sides of the damage region. Ce ll,1983， 33∶249
3 Hutterman J, et al. Effects of Ionizing Radiation on DNA. Berlin∶Spr ingerverlag, 1978∶235
, 百拇医药
4 Herrlich R,et al. DNA-damage-induced gene expression: signal transduc tion and relation to growth factor signaling. Rev Physiol Biochem Pharmacol, 1992，129∶187
5 Kramer M, et al. Radiation induced activation of transcription factors in mammalian cells. Radiat Envirn Biophys, 1990， 29∶303
6 Nogami M, et al. Mice chronically exposed to low dose ionizing radiati on possess splenocytes with elevated levels of HSP70 mRNA, HSC70 and HSP72 and w ith an increased capacity to proliferate. Int J Radiat Biol, 1993, 63∶775
, 百拇医药
7 Akashi M, et al. Increase in manganese superoxide dismutase by radiat ion i n human fibtoblasts: apossible mechanism of self- protection against radiation. Proc. International Symposium on Biological Effects of Low Level Exposures to Ra diation and Related Agents(ISBEELES93), Abstr. Changchun China, 1993∶75
8 Sanchez Y, et al. Regulation of rad53 by the ATM-like kinases MEC1 and TEL1 in yeast cellcycle checkpoint pathway. Science, 1996, 271(5247)∶357
9 Lydall D, Weinert T. Yeast checkpoint genes in DNA damage processing; Implications for repair and arrest. Science, 1995，270(5241)∶314
(1999年7月15日收稿), 百拇医药