挤压性脊髓损伤模型的制备
作者：路华 冯忠堂 王廷华 马以骝 杨志敏 陈彦红
单位：路华(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 冯忠堂(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 马以骝(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 杨志敏(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 王廷华(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)； 陈彦红(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)
关键词：脊髓损伤；挤压；疾病模型
昆明医学院学学报000115 摘 要：为建立一种简易实用、稳定可靠的脊髓损伤动物模型. 挤压T13脊髓节段至其直径的1/2(持续2 min)，术后不同时间观察损伤脊髓的组织学变化并记录受损脊髓神经功能的综合评分(CBS). 结果：光镜下，挤压相临节段脊髓侧索和灰质神经组织部分变形坏死. 术后24 h、1周实验组CBS评分与假手术组有显著差别(P<0.05)，且脊髓腹角运动神经元形态与假手术组者比较有明显变化. 行为表现为大鼠运动和感觉功能障碍. 本模型所致的脊髓损伤结果稳定可靠、操作简便，作为一种损伤模型对研究脊髓损伤有一定的价值.
, http://www.100md.com
分类号：R 744-332 文献标识码：A
文章编号：1003-4706(2000)01-0057-03
A Model of Crushed Spinal Cord Injury in Adult Rat
LU Hua，FENG Zhong-tang，MA Yi-liou，YANG Zhi-ming，(Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650032)
WANG Ting-hua，CHENG Yan-hong
(Institute for Research on Neuroscience，Kunming Medical College，Kunming 650031)
, 百拇医药
Abstract：To set up a practical and reliable animal model of spinal cord injury，spinal cord was crushed in T13 level. At different time of post injury，the behavior and the histological change of lesioned spinal cord was observed and evaluated. The results showed the method was feasible and reliable.
Key words：Spinal cord injury; Crush; Disease model▲
随着对脊髓损伤后可塑性研究的深入，建立各种脊髓损伤模型以探讨损伤修复机制是势在必行. 既往应用较为普遍的脊髓损伤模型制备方法是重物下落法，但其模型的稳定性受非致伤因素如脊髓固定程度、重物落下的精确打击点等影响较大. 近来，有作者报道用电解损毁方法制备脊髓损伤模型，其损伤机制也与临床所见脊髓损伤机制相去甚远[1]. 本研究结合本室工作之需要，建立了挤压性脊髓损伤模型.
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 实验动物分组及动物模型制备
实验动物均采用成年SD大鼠(Srague-Daweley rats)，雌雄不限，体重180～320 g.实验前将动物随机分为手术组和假手术组. 按戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，俯卧固定. 暴露T11棘突(与肋弓下缘相连椎体即是)[2]. 用有齿镊夹持T10椎体固定脊柱，用蚊式有齿血管钳咬除T11棘突及两侧椎板至关节突，充分显露脊髓T13节段(腰膨大上段). 用虹膜镊夹持脊髓. 虹膜镊手柄缠上胶布，测量大鼠脊髓直径后调整其合拢时尖端留下的间隙，正好为脊髓左右横径的一半. 将虹膜镊尖端轻轻插入T13节段的硬膜外间隙至前方椎体并持续压缩达2 min.术毕在创口撒少量青霉素粉，分别缝合椎旁肌和皮肤.术后自然光照周期，饮水、饲料不加限制，每2 d更换一次垫料保持干燥. 假手术组只暴露脊髓T13节段，不挤压脊髓，余处理同手术组.
, 百拇医药
1.2 行为学评分标准
用实验性脊髓损伤神经功能综合评分法(combinea behavioural score，CBS)，每日定时记录一次. 内容包括后肢活动、伸趾、立足、端正体位、回缩反射、斜坡法、热板实验和游泳等9项，其数值代表脊髓损伤后神经功能丧失的百分比. CBS最大值为100，代表神经功能为100%丧失；其最小值为0，代表神经功能完全正常[3]. 所有行为学评分在单盲情况下进行.
1.3 形态学观察
分别在损伤后24 h、1周、2周、3周处死动物，取出受损脊髓，在4%多聚甲醛固定24 h后，冰冻切片，苏木精染色. 以观察挤压脊髓导致的组织病理变化.
1.4 数据分析和处理
实验结果用
±s表示. 大鼠脊髓腹角神经元计数与CBS评分之间的相关性用线性回归方法分析.
, 百拇医药
2 结果
2.1 脊髓挤压伤后组织学变化
假手术组各时间点脊髓组织冰冻切片苏木精染色未见明显异常. 手术组术后24 h即可见有神经元变性坏死，脊髓灰质水肿，有的可见出血灶. 术后3周，有的神经元皱缩、坏死，在灰质内形成空洞. 但水肿、出血逐渐减轻，挤压平面尾侧段脊髓体积有所缩小. 此外，3周时还可见胶质细胞增生. 逐渐填充空洞.
2.2 行为学评分结果
脊髓挤压伤后不同时间的行为学评分结果见附表. 可见假手术组与挤压损伤组术前CBS评分比较，无统计学意义. 挤压损伤组术后24 h、1周CBS评分与假手术组CBS相比有明显增高(P<0.01)，提示损伤1周内神经功能明显障碍，至2，3周CBS评分明显减少，但仍高于假手术组(P<0.05).提示神经功能有所恢复，但仍有功能障碍.
, 百拇医药
附表 脊髓损伤后不同时间的运动评分(±s) 时间
术前
术 后
24 h
1周
2周
3周
假手术组
0
5±0.1(a)
0(b)
, http://www.100md.com 0(c)
0(d)
挤压损伤组
0
90±1.3(e)
55±0.9(f)
5±0.1(g)
5±0.2(h)
a:b P<0.05；a:e P<0.01；b:f P<0.01；e:f P<0.05；f:g P<0.05.2.3 相关统计分析结果
大鼠脊髓腹角神经元计数与CBS评分之间无显著相关性(P>0.05).
, http://www.100md.com 3 讨 论
脊髓是中枢神经系统中易受损部位，年发病率在2～5人/百万人口 ，且受伤后造成劳动力丧失和生活不能自理等严重社会问题. 因此对脊髓可塑性的研究具有十分迫切的现实意义. 建立一种可靠、简单、实用的脊髓损伤模型是研究的先决条件. 本实验采用了挤压T13脊髓节段的方法建立模型，使之与临床上多见的脊髓挤压伤受伤机制相仿，因此可在一定程度上模拟人类脊髓损伤后的病理改变和临床表现，为研究脊髓受损后神经修复及运动功能改善提供工具.
笔者在预实验证实，大鼠脊髓损伤的严重程度随挤压程度加重与挤压时间延长而加重. 经过摸索，认为挤压脊髓至其直径的一半、持续2 min，可致模型动物的神经功能障碍达到实验预期目的且术后动物的死亡率较低. 而损伤后脊髓的形态学变化也与文献报道的相类似[3，4，5]. 假手术组24 h神经功能出现一过性轻度障碍，可能与手术刺激及术后出血压迫脊髓有关. 本法既简单易行，又获得了一些可靠结果，因而有一定价值.
, 百拇医药
近年，有学者虽采用数字式磁控脊髓夹损仪和立体定位的方法制造脊髓损伤模型[6]，但实验操作复杂且需特殊设备. 在本实验中，手术组大鼠感觉障碍、肌力下降、肌张力增高、运动功能明显下降，能持续1周左右，且由于损伤程度适中、范围局限、术后一般情况良好，不需特殊护理，动物死亡率低(15%). 加之，实验操作简便、客观、不需特殊仪器设备，也避免了某些主观因素的影响，可重复性强. 因此，模型具有较强的实用性及可操作性.
线性回归分析方法发现大鼠脊髓腹角神经元计数与CBS评分之间无显著相关性(P<0.05). 根据结果推测：挤压伤不仅引起皮质脊髓束的损伤，还可导致其它传道束，如红核脊髓束、薄束、锲束的损伤， 有待进一步研究. ■
基金项目：云南省自然科学基金资助(99C0006R)
作者简介：路华，男(1974～)，江苏淮阴人，硕士研究生. 研究方向：脊髓损伤与修复.
, http://www.100md.com
参考文献：
[1] 唐晓青，万有，黄志华，等. 用电解毁损方法制备大鼠的脊髓损伤模型 [J]. 北京医科大学学报，1999，31(3)：226
[2] 王平宇主编. 大白鼠中枢神经系统解剖学基础 [M]. 北京：人民卫生出版社，1986.188～188
[3] 庞清江. 实验性脊髓损伤的神经功能及组织形态学评定方法 [J]. 中国修复重建外科杂志，8(4)：248
[4] WHITE R J. Pathology of spinal cord injury in experimental lesions [J]. Clin Orthop，1975，112:16
[5] NOBLE L J，WRATHALL J R.. Spinal cord contusion in the rat: morphometric analyses of alterations in the spinal cord [J].Exp Neurol，1985，88:135
[6] 张子印，吕国蔚. 大鼠脊髓立体定位磁控过半夹损模型 [J]. 中华神经外科杂志，1993(9)2：75
收稿日期：1999-12-22, 百拇医药
单位：路华(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 冯忠堂(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 马以骝(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 杨志敏(昆明医学院第一附属医院神经外科，昆明 650032)； 王廷华(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)； 陈彦红(昆明医学院神经科学研究所，昆明 650031)
关键词：脊髓损伤；挤压；疾病模型
昆明医学院学学报000115 摘 要：为建立一种简易实用、稳定可靠的脊髓损伤动物模型. 挤压T13脊髓节段至其直径的1/2(持续2 min)，术后不同时间观察损伤脊髓的组织学变化并记录受损脊髓神经功能的综合评分(CBS). 结果：光镜下，挤压相临节段脊髓侧索和灰质神经组织部分变形坏死. 术后24 h、1周实验组CBS评分与假手术组有显著差别(P<0.05)，且脊髓腹角运动神经元形态与假手术组者比较有明显变化. 行为表现为大鼠运动和感觉功能障碍. 本模型所致的脊髓损伤结果稳定可靠、操作简便，作为一种损伤模型对研究脊髓损伤有一定的价值.
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分类号：R 744-332 文献标识码：A
文章编号：1003-4706(2000)01-0057-03
A Model of Crushed Spinal Cord Injury in Adult Rat
LU Hua，FENG Zhong-tang，MA Yi-liou，YANG Zhi-ming，(Department of Neurosurgery，the First Affiliated Hospital of Kunming Medical College,Kunming 650032)
WANG Ting-hua，CHENG Yan-hong
(Institute for Research on Neuroscience，Kunming Medical College，Kunming 650031)
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Abstract：To set up a practical and reliable animal model of spinal cord injury，spinal cord was crushed in T13 level. At different time of post injury，the behavior and the histological change of lesioned spinal cord was observed and evaluated. The results showed the method was feasible and reliable.
Key words：Spinal cord injury; Crush; Disease model▲
随着对脊髓损伤后可塑性研究的深入，建立各种脊髓损伤模型以探讨损伤修复机制是势在必行. 既往应用较为普遍的脊髓损伤模型制备方法是重物下落法，但其模型的稳定性受非致伤因素如脊髓固定程度、重物落下的精确打击点等影响较大. 近来，有作者报道用电解损毁方法制备脊髓损伤模型，其损伤机制也与临床所见脊髓损伤机制相去甚远[1]. 本研究结合本室工作之需要，建立了挤压性脊髓损伤模型.
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1 材料与方法
1.1 实验动物分组及动物模型制备
实验动物均采用成年SD大鼠(Srague-Daweley rats)，雌雄不限，体重180～320 g.实验前将动物随机分为手术组和假手术组. 按戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后，俯卧固定. 暴露T11棘突(与肋弓下缘相连椎体即是)[2]. 用有齿镊夹持T10椎体固定脊柱，用蚊式有齿血管钳咬除T11棘突及两侧椎板至关节突，充分显露脊髓T13节段(腰膨大上段). 用虹膜镊夹持脊髓. 虹膜镊手柄缠上胶布，测量大鼠脊髓直径后调整其合拢时尖端留下的间隙，正好为脊髓左右横径的一半. 将虹膜镊尖端轻轻插入T13节段的硬膜外间隙至前方椎体并持续压缩达2 min.术毕在创口撒少量青霉素粉，分别缝合椎旁肌和皮肤.术后自然光照周期，饮水、饲料不加限制，每2 d更换一次垫料保持干燥. 假手术组只暴露脊髓T13节段，不挤压脊髓，余处理同手术组.
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1.2 行为学评分标准
用实验性脊髓损伤神经功能综合评分法(combinea behavioural score，CBS)，每日定时记录一次. 内容包括后肢活动、伸趾、立足、端正体位、回缩反射、斜坡法、热板实验和游泳等9项，其数值代表脊髓损伤后神经功能丧失的百分比. CBS最大值为100，代表神经功能为100%丧失；其最小值为0，代表神经功能完全正常[3]. 所有行为学评分在单盲情况下进行.
1.3 形态学观察
分别在损伤后24 h、1周、2周、3周处死动物，取出受损脊髓，在4%多聚甲醛固定24 h后，冰冻切片，苏木精染色. 以观察挤压脊髓导致的组织病理变化.
1.4 数据分析和处理
实验结果用
±s表示. 大鼠脊髓腹角神经元计数与CBS评分之间的相关性用线性回归方法分析., 百拇医药
2 结果
2.1 脊髓挤压伤后组织学变化
假手术组各时间点脊髓组织冰冻切片苏木精染色未见明显异常. 手术组术后24 h即可见有神经元变性坏死，脊髓灰质水肿，有的可见出血灶. 术后3周，有的神经元皱缩、坏死，在灰质内形成空洞. 但水肿、出血逐渐减轻，挤压平面尾侧段脊髓体积有所缩小. 此外，3周时还可见胶质细胞增生. 逐渐填充空洞.
2.2 行为学评分结果
脊髓挤压伤后不同时间的行为学评分结果见附表. 可见假手术组与挤压损伤组术前CBS评分比较，无统计学意义. 挤压损伤组术后24 h、1周CBS评分与假手术组CBS相比有明显增高(P<0.01)，提示损伤1周内神经功能明显障碍，至2，3周CBS评分明显减少，但仍高于假手术组(P<0.05).提示神经功能有所恢复，但仍有功能障碍.
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附表 脊髓损伤后不同时间的运动评分(
±s) 时间术前
术 后
24 h
1周
2周
3周
假手术组
0
5±0.1(a)
0(b)
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0(d)
挤压损伤组
0
90±1.3(e)
55±0.9(f)
5±0.1(g)
5±0.2(h)
a:b P<0.05；a:e P<0.01；b:f P<0.01；e:f P<0.05；f:g P<0.05.2.3 相关统计分析结果
大鼠脊髓腹角神经元计数与CBS评分之间无显著相关性(P>0.05).
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脊髓是中枢神经系统中易受损部位，年发病率在2～5人/百万人口 ，且受伤后造成劳动力丧失和生活不能自理等严重社会问题. 因此对脊髓可塑性的研究具有十分迫切的现实意义. 建立一种可靠、简单、实用的脊髓损伤模型是研究的先决条件. 本实验采用了挤压T13脊髓节段的方法建立模型，使之与临床上多见的脊髓挤压伤受伤机制相仿，因此可在一定程度上模拟人类脊髓损伤后的病理改变和临床表现，为研究脊髓受损后神经修复及运动功能改善提供工具.
笔者在预实验证实，大鼠脊髓损伤的严重程度随挤压程度加重与挤压时间延长而加重. 经过摸索，认为挤压脊髓至其直径的一半、持续2 min，可致模型动物的神经功能障碍达到实验预期目的且术后动物的死亡率较低. 而损伤后脊髓的形态学变化也与文献报道的相类似[3，4，5]. 假手术组24 h神经功能出现一过性轻度障碍，可能与手术刺激及术后出血压迫脊髓有关. 本法既简单易行，又获得了一些可靠结果，因而有一定价值.
, 百拇医药
近年，有学者虽采用数字式磁控脊髓夹损仪和立体定位的方法制造脊髓损伤模型[6]，但实验操作复杂且需特殊设备. 在本实验中，手术组大鼠感觉障碍、肌力下降、肌张力增高、运动功能明显下降，能持续1周左右，且由于损伤程度适中、范围局限、术后一般情况良好，不需特殊护理，动物死亡率低(15%). 加之，实验操作简便、客观、不需特殊仪器设备，也避免了某些主观因素的影响，可重复性强. 因此，模型具有较强的实用性及可操作性.
线性回归分析方法发现大鼠脊髓腹角神经元计数与CBS评分之间无显著相关性(P<0.05). 根据结果推测：挤压伤不仅引起皮质脊髓束的损伤，还可导致其它传道束，如红核脊髓束、薄束、锲束的损伤， 有待进一步研究. ■
基金项目：云南省自然科学基金资助(99C0006R)
作者简介：路华，男(1974～)，江苏淮阴人，硕士研究生. 研究方向：脊髓损伤与修复.
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参考文献：
[1] 唐晓青，万有，黄志华，等. 用电解毁损方法制备大鼠的脊髓损伤模型 [J]. 北京医科大学学报，1999，31(3)：226
[2] 王平宇主编. 大白鼠中枢神经系统解剖学基础 [M]. 北京：人民卫生出版社，1986.188～188
[3] 庞清江. 实验性脊髓损伤的神经功能及组织形态学评定方法 [J]. 中国修复重建外科杂志，8(4)：248
[4] WHITE R J. Pathology of spinal cord injury in experimental lesions [J]. Clin Orthop，1975，112:16
[5] NOBLE L J，WRATHALL J R.. Spinal cord contusion in the rat: morphometric analyses of alterations in the spinal cord [J].Exp Neurol，1985，88:135
[6] 张子印，吕国蔚. 大鼠脊髓立体定位磁控过半夹损模型 [J]. 中华神经外科杂志，1993(9)2：75
收稿日期：1999-12-22, 百拇医药