羧甲基壳聚糖对豚鼠单一心室肌细胞延迟外向钾电流的作用
作者：张沈丽 王丽娟 肖庆桓 赵青 李金鸣
单位：(中国医科大学药理教研室，沈阳 110001)；王丽娟(齐齐哈尔医学院药物理教研室，齐齐哈尔 161042)
关键词：羧甲基壳聚糖；延迟外向钾电流；膜片钳制技术
中国海洋药物000104 摘 要：研究羧甲基壳聚糖对豚鼠单一心室肌细胞延迟外向钾电流(IK)的作用，从离子通道角度初步探讨其作用机理。应用膜片钳全细胞记录方式，设保持电位为-50mV，指令电位为-50～+70mV，步阶脉冲10mV,刺激频率1Hz，波宽1000ms，刺激间隔5s的方波钳制方案。羧甲基壳聚糖能抑制IK，并呈浓度依赖关系。选择指令电位+70mV时给药前后IK的变化进行统计，当浓度为0.1%时，IK由给药前的1.16±0.30nA减少至药后的0.96±0.27nA(n=4,P<0.01)，其抑制率是17.70±0.05%。当浓度为0.2%时，IK由给药前的1.46±0.62nA减少至给药后的1.06±0.49nA(n=4,P<0.01)，抑制率是28.66±0.06%。其它指令电位下的IK的改变也符合此趋势。羧甲基壳聚糖抑制豚鼠单一心室肌细胞延迟外向K+电流。
, 百拇医药
EFFECT OF CARBOXYMETHYL CHITOSAN ON DELAYED OUTWARD POTASSIUM CURRENT IN SINGLE VENTRICULAR MYOCYTES OF GUINEA PIG
Zhang Shenli Wang Lijuan Xiao Qinghuan Zhao Qing Li Jinming
(Department of Pharmacology,China Medical University Shenyang,110001)
ABSTRACT：To study the effect of Carboxymethyl chitosan on delayed outward potassium current (IK)in single ventricular myocytes of guinea pig and investigate its antiarrhythmic mechanism from ion channel aspect.Patch clanmp technique with whole-cell configuration.Holding potential was-50mV,commanding potential was-50～+70mV,step pulse+10mV,stimulating frequency 1 Hz,duration 1000 ms and stimulating interval 5 s. Carboxymethyl chitosan inhibited IK in a dose-dependent manner.When holding potential was-50 mV and commanding potential was+70mV,IK reduced from 1.16±0.30nA and 1.46±0.62nA to 0.96±0.27nA(n=4,P<0.01)and 1.06±0.49nA(n=4,P<0.01)respectively after 0.1% and 0.2% Carboxymethyl chitosan were added to the external solution.The inhibitory rate were 17.70±0.05% and 28.66±0.06% respectively. The changes of IK were consistent with this under other commanding potentials.Carboxymethyl chitosan can inhibite IK in single ventricular myocytes of guinea pig.
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KEY WORDS：Carboxymethyl chitosan,Delayed outward potassium current,Patch clamp technique▲
羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan)是壳聚糖经羧甲基化而得的一种水溶性多糖。壳聚糖是甲壳质脱去乙酰基的产物，也称为几丁聚糖。甲壳质广泛存在于节肢动物和昆虫及其它无脊椎动物外壳中，它脱去分子中的乙酰基就转变为壳聚糖。近年来，甲壳及其衍生物在医药和化工方面的研究取得了重大进展。实验表明壳聚糖具有抗感染、增强免疫、抗肿瘤、促进疾病恢复、调节生理功能使生理活动处于最佳平衡状态等功能；而且也具有防治高血压、抗心肌缺血和抗心律失常等心血管方面的作用。我们应用膜片钳技术，证明了壳聚糖抑制豚鼠单一心室肌细胞延迟外向钾电流[1]，从离子通道角度说明其抗心率失常作用的机制。本实验应用膜片钳技术全细胞记录方式，研究羧甲基壳聚糖对豚鼠单一心室肌细胞延迟外向钾电流的作用[2]。
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1 材料与方法
1.1 豚鼠单一心室肌细胞的制备[3]
豚鼠，300～350g，♂♀兼用，戊巴比妥钠20mg/kg ip.麻醉，在气管插管呼吸机支持下，主动脉插管，然后取出心脏，在37℃恒温和通氧条件下进行改良的Langendorff灌流。先用台氏液灌流3～5min，后用无钙台氏液灌流5min使心脏停跳，然后用含胶原酶(Sigma,Type I)20mg的无钙台氏液50ml灌流10～15min,再用60ml KB液冲洗残留的酶液，剪碎心肌组织，搅拌后用105μm的筛网过滤，1000r/min离心2次，弃上清。最后将分离的心肌细胞放在KB液中，置于4℃冰箱稳定1h后，即可进行通道记录。
1.2 液体组成
：台氏液(mmol.L-1)：NaCl 143、KCl 5.4、MgCl2 0.5、NaH2PO40.3、CaCl2 1.8、Gluose 5、NaOH 24.4、HEPES 5。无钙台氏液：将台氏液中的CaCl2去除后制得。KB(mmol.L-1：KCl 40、KOH 70、L-Glutamic acid 50、Taurine 20、KH2PO4 20、MgCl2 3、GEGTA 0.5、Glucose 10、HEPES 10。电极外液为台氏液。电极内液(mmol.L-1)：Kasp 49.89、KCl30.07、KH2PO425、HEPES 20.12、EGTA 0.999、KOH 29.95、MgCl2 1、CaCl2 0.2、ATPNa2 6.8。以上液体PH值均调至7.4。
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1.3 主要实验仪器
垂直电极拉制器(Narishige PP-83 Japan),Axopatch-1D(Axon Instrument USA)膜片钳放大器，双轨记忆示波器(VC-10 Japan),AD/DA(Digidata 1200 USA)转换板及pCLAMP5.51程序。
1.4 延迟外向钾电流(IK)的记录
利用全细胞膜片钳制技术记录IK，用台氏液作为细胞外液进行灌流。将分离的心肌细胞置于容积约1.5ml平放于倒置显微镜上的浴槽中，用尖端直径3μm的膜片电极(电极电阻3～5MΩ)进行千兆封接。全细胞状态形成后，用pCLAMP5.5.1软件程序发放刺激并收集记录信号。设保持电位为-50mV,用指令电位为-50～+70mV，步阶脉冲10mV,刺激频率1Hz，波宽1000ms，刺激间隔5s的方波钳制方案进行刺激。
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1.5 资料分析和数据处理：记录的电流在pCLAMP5.5.1中进行分析和电流大小的测量。实验结果用
±S表示，实验数据处理是将细胞给药前后数据进行配对资料的Student't检验，P<0.05为差异显著。
2 结果
在灌流液中加入Verapamil和TTX以阻断Ca2+和Na+电流，采用上述刺激方案记录IK。在细胞外液中加入0.1%和0.2%两种浓度的羧甲基甲壳胺，观察给药前后的IK的改变。结果表明两种浓度的羧甲基甲壳胺均能抑制IK，且具有浓度依赖关系。选择指令电位+70mV时给药前后IK的变化进行统计，当浓度为0.1%时，IK由给药前的1.16±0.30nA减少至给药后的0.96±0.27nA(n=4,P<0.01)，抑制率为17.70±0.05%(图1)。当浓度为0.2%时，IK由给药前的1.46±0.62nA减少至给药后的1.06±0.49nA(n=4,P<0.01)，抑制率为28.66±0.06%(图2)。
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Fig 1.Effect of Carboxymethyl chitosan(0.1%)on IK in single ventricular myocytes of guinea pig.
A.Control
B.Carboxymethyl chitosan(0.1%)
Fig 2.Effect of Carboxymethyl chitosan(0.2%)on IK in single ventricular myocytes of guinea pig.
A.Control
B.Carboxymethyl chitosan(0.2%)
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3 讨论
目前认为心律失常的发生与离子通道电流的异常有关，而钾电流的异常是心律失常的主要原因。心肌细胞在缺血、缺氧或代谢抑制时，心肌细胞的动作电位时程和有效不应期明显缩短，使心肌易产生折返激动而导致兴奋冲动异常，引起心律失常的发生[4]。心肌细胞动作电位时程和有效不应期长短主要取决于动作电位复极化过程中外向K+电流，该外向K+电流主要包括瞬间外向钾流(Ito)、延迟外向钾电流(IK)和ATP敏感钾电流(IKATP)，而IK是主要的复极化电流[5]。当前应用的Ⅲ类抗心律失常药就是以阻断IK，延长心肌动作电位时程和有效不应期为主。本实验应用膜片钳制技术全细胞记录方式，结果表明羧甲基壳聚糖以浓度依赖方式抑制IK，阻断细胞内K+的外流，减少细胞胞外K+堆积，从而延长心肌细胞的APD和ERP，取消折返激动而发挥抗心律失常的作用。羧甲基壳聚糖与甲壳质和壳聚糖相比，易溶于水，易被机体吸收，所以在心血管方面具有广泛的开发和应用前景。
, 百拇医药
4 结论
羧甲基壳聚糖抑制豚鼠单一心室肌细胞延迟外向K+电流。
致谢：本实验药品由青岛药物研究所丁源教授和关美君教授惠赠，在此表示感谢。
参考文献：
[1]李金鸣，张沈丽，肖庆桓，等.壳聚糖对豚鼠单一心室肌细胞延迟外向钾电流的作用.中国海洋药物，1998，17(4)：4
[2]H amill OP,Marty A,Nether E,et al.Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.Pflugers Arch,981,391:85
, 百拇医药
[3]Mitra R,Morad M.A uniform enzymatic method for the dissociation of myocytes from eart.Am J physiol,1985,249:H1056
[4]戴德哉.抗心律失常药的近况和发展方向.国外医学药学分册，1998，25(1)：22
[5]Dianne MB,Jeanne MN .Myocardial potassium channel:Electrophysioligical andmoleculardiversity.Ann Rew Physiol,1996,58:363
收稿日期：99-06-04, 百拇医药
单位：(中国医科大学药理教研室，沈阳 110001)；王丽娟(齐齐哈尔医学院药物理教研室，齐齐哈尔 161042)
关键词：羧甲基壳聚糖；延迟外向钾电流；膜片钳制技术
中国海洋药物000104 摘 要：研究羧甲基壳聚糖对豚鼠单一心室肌细胞延迟外向钾电流(IK)的作用，从离子通道角度初步探讨其作用机理。应用膜片钳全细胞记录方式，设保持电位为-50mV，指令电位为-50～+70mV，步阶脉冲10mV,刺激频率1Hz，波宽1000ms，刺激间隔5s的方波钳制方案。羧甲基壳聚糖能抑制IK，并呈浓度依赖关系。选择指令电位+70mV时给药前后IK的变化进行统计，当浓度为0.1%时，IK由给药前的1.16±0.30nA减少至药后的0.96±0.27nA(n=4,P<0.01)，其抑制率是17.70±0.05%。当浓度为0.2%时，IK由给药前的1.46±0.62nA减少至给药后的1.06±0.49nA(n=4,P<0.01)，抑制率是28.66±0.06%。其它指令电位下的IK的改变也符合此趋势。羧甲基壳聚糖抑制豚鼠单一心室肌细胞延迟外向K+电流。
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EFFECT OF CARBOXYMETHYL CHITOSAN ON DELAYED OUTWARD POTASSIUM CURRENT IN SINGLE VENTRICULAR MYOCYTES OF GUINEA PIG
Zhang Shenli Wang Lijuan Xiao Qinghuan Zhao Qing Li Jinming
(Department of Pharmacology,China Medical University Shenyang,110001)
ABSTRACT：To study the effect of Carboxymethyl chitosan on delayed outward potassium current (IK)in single ventricular myocytes of guinea pig and investigate its antiarrhythmic mechanism from ion channel aspect.Patch clanmp technique with whole-cell configuration.Holding potential was-50mV,commanding potential was-50～+70mV,step pulse+10mV,stimulating frequency 1 Hz,duration 1000 ms and stimulating interval 5 s. Carboxymethyl chitosan inhibited IK in a dose-dependent manner.When holding potential was-50 mV and commanding potential was+70mV,IK reduced from 1.16±0.30nA and 1.46±0.62nA to 0.96±0.27nA(n=4,P<0.01)and 1.06±0.49nA(n=4,P<0.01)respectively after 0.1% and 0.2% Carboxymethyl chitosan were added to the external solution.The inhibitory rate were 17.70±0.05% and 28.66±0.06% respectively. The changes of IK were consistent with this under other commanding potentials.Carboxymethyl chitosan can inhibite IK in single ventricular myocytes of guinea pig.
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KEY WORDS：Carboxymethyl chitosan,Delayed outward potassium current,Patch clamp technique▲
羧甲基壳聚糖(Carboxymethyl chitosan)是壳聚糖经羧甲基化而得的一种水溶性多糖。壳聚糖是甲壳质脱去乙酰基的产物，也称为几丁聚糖。甲壳质广泛存在于节肢动物和昆虫及其它无脊椎动物外壳中，它脱去分子中的乙酰基就转变为壳聚糖。近年来，甲壳及其衍生物在医药和化工方面的研究取得了重大进展。实验表明壳聚糖具有抗感染、增强免疫、抗肿瘤、促进疾病恢复、调节生理功能使生理活动处于最佳平衡状态等功能；而且也具有防治高血压、抗心肌缺血和抗心律失常等心血管方面的作用。我们应用膜片钳技术，证明了壳聚糖抑制豚鼠单一心室肌细胞延迟外向钾电流[1]，从离子通道角度说明其抗心率失常作用的机制。本实验应用膜片钳技术全细胞记录方式，研究羧甲基壳聚糖对豚鼠单一心室肌细胞延迟外向钾电流的作用[2]。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 豚鼠单一心室肌细胞的制备[3]
豚鼠，300～350g，♂♀兼用，戊巴比妥钠20mg/kg ip.麻醉，在气管插管呼吸机支持下，主动脉插管，然后取出心脏，在37℃恒温和通氧条件下进行改良的Langendorff灌流。先用台氏液灌流3～5min，后用无钙台氏液灌流5min使心脏停跳，然后用含胶原酶(Sigma,Type I)20mg的无钙台氏液50ml灌流10～15min,再用60ml KB液冲洗残留的酶液，剪碎心肌组织，搅拌后用105μm的筛网过滤，1000r/min离心2次，弃上清。最后将分离的心肌细胞放在KB液中，置于4℃冰箱稳定1h后，即可进行通道记录。
1.2 液体组成
：台氏液(mmol.L-1)：NaCl 143、KCl 5.4、MgCl2 0.5、NaH2PO40.3、CaCl2 1.8、Gluose 5、NaOH 24.4、HEPES 5。无钙台氏液：将台氏液中的CaCl2去除后制得。KB(mmol.L-1：KCl 40、KOH 70、L-Glutamic acid 50、Taurine 20、KH2PO4 20、MgCl2 3、GEGTA 0.5、Glucose 10、HEPES 10。电极外液为台氏液。电极内液(mmol.L-1)：Kasp 49.89、KCl30.07、KH2PO425、HEPES 20.12、EGTA 0.999、KOH 29.95、MgCl2 1、CaCl2 0.2、ATPNa2 6.8。以上液体PH值均调至7.4。
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1.3 主要实验仪器
垂直电极拉制器(Narishige PP-83 Japan),Axopatch-1D(Axon Instrument USA)膜片钳放大器，双轨记忆示波器(VC-10 Japan),AD/DA(Digidata 1200 USA)转换板及pCLAMP5.51程序。
1.4 延迟外向钾电流(IK)的记录
利用全细胞膜片钳制技术记录IK，用台氏液作为细胞外液进行灌流。将分离的心肌细胞置于容积约1.5ml平放于倒置显微镜上的浴槽中，用尖端直径3μm的膜片电极(电极电阻3～5MΩ)进行千兆封接。全细胞状态形成后，用pCLAMP5.5.1软件程序发放刺激并收集记录信号。设保持电位为-50mV,用指令电位为-50～+70mV，步阶脉冲10mV,刺激频率1Hz，波宽1000ms，刺激间隔5s的方波钳制方案进行刺激。
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1.5 资料分析和数据处理：记录的电流在pCLAMP5.5.1中进行分析和电流大小的测量。实验结果用
±S表示，实验数据处理是将细胞给药前后数据进行配对资料的Student't检验，P<0.05为差异显著。2 结果
在灌流液中加入Verapamil和TTX以阻断Ca2+和Na+电流，采用上述刺激方案记录IK。在细胞外液中加入0.1%和0.2%两种浓度的羧甲基甲壳胺，观察给药前后的IK的改变。结果表明两种浓度的羧甲基甲壳胺均能抑制IK，且具有浓度依赖关系。选择指令电位+70mV时给药前后IK的变化进行统计，当浓度为0.1%时，IK由给药前的1.16±0.30nA减少至给药后的0.96±0.27nA(n=4,P<0.01)，抑制率为17.70±0.05%(图1)。当浓度为0.2%时，IK由给药前的1.46±0.62nA减少至给药后的1.06±0.49nA(n=4,P<0.01)，抑制率为28.66±0.06%(图2)。
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Fig 1.Effect of Carboxymethyl chitosan(0.1%)on IK in single ventricular myocytes of guinea pig.
A.Control
B.Carboxymethyl chitosan(0.1%)
Fig 2.Effect of Carboxymethyl chitosan(0.2%)on IK in single ventricular myocytes of guinea pig.
A.Control
B.Carboxymethyl chitosan(0.2%)
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3 讨论
目前认为心律失常的发生与离子通道电流的异常有关，而钾电流的异常是心律失常的主要原因。心肌细胞在缺血、缺氧或代谢抑制时，心肌细胞的动作电位时程和有效不应期明显缩短，使心肌易产生折返激动而导致兴奋冲动异常，引起心律失常的发生[4]。心肌细胞动作电位时程和有效不应期长短主要取决于动作电位复极化过程中外向K+电流，该外向K+电流主要包括瞬间外向钾流(Ito)、延迟外向钾电流(IK)和ATP敏感钾电流(IKATP)，而IK是主要的复极化电流[5]。当前应用的Ⅲ类抗心律失常药就是以阻断IK，延长心肌动作电位时程和有效不应期为主。本实验应用膜片钳制技术全细胞记录方式，结果表明羧甲基壳聚糖以浓度依赖方式抑制IK，阻断细胞内K+的外流，减少细胞胞外K+堆积，从而延长心肌细胞的APD和ERP，取消折返激动而发挥抗心律失常的作用。羧甲基壳聚糖与甲壳质和壳聚糖相比，易溶于水，易被机体吸收，所以在心血管方面具有广泛的开发和应用前景。
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4 结论
羧甲基壳聚糖抑制豚鼠单一心室肌细胞延迟外向K+电流。
致谢：本实验药品由青岛药物研究所丁源教授和关美君教授惠赠，在此表示感谢。
参考文献：
[1]李金鸣，张沈丽，肖庆桓，等.壳聚糖对豚鼠单一心室肌细胞延迟外向钾电流的作用.中国海洋药物，1998，17(4)：4
[2]H amill OP,Marty A,Nether E,et al.Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.Pflugers Arch,981,391:85
, 百拇医药
[3]Mitra R,Morad M.A uniform enzymatic method for the dissociation of myocytes from eart.Am J physiol,1985,249:H1056
[4]戴德哉.抗心律失常药的近况和发展方向.国外医学药学分册，1998，25(1)：22
[5]Dianne MB,Jeanne MN .Myocardial potassium channel:Electrophysioligical andmoleculardiversity.Ann Rew Physiol,1996,58:363
收稿日期：99-06-04, 百拇医药