骨髓基质细胞与生物活性玻璃陶瓷和聚乳酸生物相容性的实验研究
作者：金丹 裴国献 王前
单位：金丹(第一军医大学附属南方医院创伤骨科(广州，510515)；裴国献(第一军医大学附属南方医院创伤骨科(广州，510515)；王前(第一军医大学附属南方医院创伤骨科(广州，510515))
关键词：骨髓基质细胞；生物材料；生物相容性；组织工程
中国修复重建外科杂志000115 摘 要：目的 探讨骨髓基质细胞与生物活性玻璃陶瓷(BGC)和聚乳酸(PLA)的生物相容性，为骨组织工程中生物材料的选择提供依据。方法 将骨髓基质细胞与BGC、PLA复合体外培养，进行形态学观察、细胞增殖、蛋白质含量及酶学测定。结果 骨髓基质细胞能在BGC、PLA上贴附、繁殖，其生长及功能不受影响，并且BGC具有一定的促细胞增殖作用。结论 BGC、PLA具有良好的细胞相容性，有可能作为骨髓基质细胞的载体应用于组织工程的研究。
, http://www.100md.com
BIOCOMPATIBILITY STUDIES ON BIOACTIVE GLASS CERAMICS AND POLYLACTIC ACID COMBINED WITH CULTURED BONE MARROW STROMAL CELLS IN VITRO
JIN Dan PEI Guo-xian WANG Qian
(Department of Orthopedic and Trauma Surgery, Nanfang Hospital, the First Military Medical University. Guangzhou Guangdong, P.R.China 510515)
Abstract：Objective To study the biocompatibility on bioactive glass ceramics (BGC) and polylactic acid (PLA) combined with cultured bone marrow stromal cells (BMSCs) in bone tissue engineering. Methods BMSCs were cultured combined with BGC and PLA in vitro, and the morphological characters, cell proliferation, protein content, and alkaline phosphatase activity were detected. Results BMSCs could be attached to and extended on both BGC and PLA, and normally grown, proliferated, had active function. BGC could promote cell proliferation. Conclusion The results show that both BGC and PLA have good biocompatibility with BMSCs, they can be used as biomaterials for cell transplantation in tissue engineering.
, 百拇医药
Key words：Bone marrow stromal cells Biomaterials Biocompatibility Tissue engineering▲
骨缺损修复一直是骨科领域的难题之一，目前常用的人工合成替代物、异体骨移植、自体骨移植等方法在不同程度上存在一定的问题。近年来，组织工程化骨组织的研究为骨缺损修复提供了全新的思路和方 法[1、2]，是研究的热点之一。对于骨组织工程的研究，生物材料的生物相容性检测是其中重要的一个环节。我们选择骨髓基质细胞与生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramics，BGC)、聚乳酸(polylactic acid, PLA)生物材料进行体外复合培养，检测其生物学性能，为骨组织工程中生物材料的选择提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
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RPMI 1640 (GIBCO)、新生牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)、胰蛋白酶(天象人生物制品公司)、四唑盐(MTT，5 mg/ml)、甲瓒溶解液、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白、24孔培养板、725紫外分光光度计、碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物制品有限公司)、BGC(中国科学院成都光电研究所)、PLA(中山大学高分子研究所)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 选4～8周龄健康新西兰大白兔，16号骨穿针抽吸双侧股骨骨髓共3 ml，混入RPMI 1640完全培养基(含青霉素及链霉素各100 U/ml，维生素C50 μg/ml，20%新生牛血清)10 ml，经4号针头反复抽吸，制成单细胞悬液，以3×106 /ml细胞数接种入50 ml培养瓶中，置于37℃、5% CO2孵箱中，5天后半量换液(1640完全培养基)，以后2～3天全量换液一次，细胞汇合成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，计数。进入传代培养，使用条件培养基。
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1.2.2 细胞接种
将传代至第3代的细胞以1.5×104/ml接种于24孔培养板或置有盖玻片的培养皿，每孔加入培养基1 ml。实验分为三组，即BGC组、PLA组及对照组。其中BGC组、PLA组中每孔加3 mm×3 mm×1 mm BGC或PLA材料，对照组单纯接种细胞，于不同时间进行处理，用于观察及检测。
1.2.3 相差显微镜观察 逐日使用相差显微镜观察细胞生长及与生物材料附着情况。
1.2.4 碱性磷酸酶染色 将培养3周的附有细胞的盖玻片取出，采用改良Gomori氏钙钴法进行碱性磷酸酶定性检测。
1.2.5 扫描电镜观察 分别于各时间点将生物材料取出，2%戊二醛固定，系列脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后进行观察。
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1.2.6 MTT法分析骨髓基质细胞与BGC、PLA复合培养的成活和增殖能力 按上述方法接种细胞后，于2、4、6及8天弃原培养基，加入MTT50 μl，37℃孵育4小时，加入甲瓒溶解液1 ml，选择波长570 nm比色，测定光吸收值。
1.2.7 考马斯亮蓝微量测定细胞蛋白含量 于2、4、6及8天将培养的细胞制成细胞裂解液。取1 ml考马斯亮蓝染液与100 μl上述细胞裂解液混匀，放置5分钟。用紫外光分光光度计在595 nm波长处测定溶液的光吸收值。以0.05%Triton X-100为空白对照、以牛血清白蛋白为标准品绘制标准曲线。依据标准曲线推算样品蛋白质含量。
1.2.8 碱性磷酸酶定量检测 按试剂盒说明要求操作，进行碱性磷酸酶定量测定。
1.2.9 统计方法 所测数据进行方差统计分析。P值<0.05时为有统计学差异。
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2 结果
2.1 相差显微镜观察
细胞接种后24小时可见部分大圆形单核细胞贴壁，72小时后细胞开始增殖并向几种细胞形态分化，5～8天后，细胞逐渐形成分散的细胞集落，其形状与大小各不相同，多为成纤维型细胞形态，称成纤维细胞集落。10～12天后细胞集落间相互融合成单层，形态多转化为梭形，为成纤维细胞型表现。
细胞传代培养中使用条件培养基(1640完全培养基中加入地塞米松8～10 mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L)，4小时开始贴壁，8～10小时基本贴壁完全，细胞多向梭形、多角形细胞转化，带有数个突起，突起的个数及形态各不相同。培养10～12天后细胞融合成单层，随着培养时间的延长，细胞形成多层细胞层，并不发生细胞间的接触抑制现象(图1)。
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图1 传代培养第8天细胞多向梭形细胞、多角形细胞转化(×200)
Fig. 1 Spindle-like and polygonal cell in
shape after subculture 8 days(×200)
细胞与材料复合培养组 早期可见培养板内细胞增多，并向BGC、PLA材料移行贴附于材料周边，部分细胞直接贴附于材料表面，随复合培养时间延长，附着的细胞增多，并可分泌细胞外基质，充填BGC、PLA材料周边的凹陷中，材料表面的细胞增殖连接成片，形成单层，细胞形态多为梭形及三角形，各材料组细胞生长状态与对照组相似，无细胞衰老及异常分裂现象(图2)。
图2 骨髓基质细胞与BGC复合培养第8天，材料周围有多量细胞附着(×100)
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Fig. 2 More cells were attached to materials
after 8 days of BMSCs combined culture with BGC(×100)
2.2 碱性磷酸酶定性染色
经改良钙钴法染色后，在骨髓基质细胞的胞浆中可见浅棕色至棕黑色的细小颗粒，细胞着色程度不一，碱性磷酸酶阳性率可达到80%以上，在细胞密集区反应强烈。
2.3 扫描电镜观察
单纯培养组培养6天的细胞多为单层细胞结构，细胞为梭形或多角形表现，带多个突起，各细胞突起数目不等，长短粗细各异，胞体表面有颗粒状物，可见细长微丝形成，形成细胞间的连接，细胞上及细胞间可见钙盐结晶沉积。
, 百拇医药
BGC表面在扫描电镜下为微颗粒状，具有微孔。培养2～4天时，细胞附着于材料表面，形态多样，有多个突起，细胞跨越微孔表面或向孔内长入，培养8天后细胞连接成片，可见细胞表层有丝状纤维形成(图3)。PLA表面较平坦光滑，上有较大的孔隙。培养早期细胞散在于材料表面，呈有多个突起的梭形或多角形，细胞间连接松散(图4)。随培养时间延长，细胞增殖，连接成单层或生长附着于较大孔隙表面，细胞排列紧密，部分区域有细胞外基质形成。
图3 细胞长入BGC的微孔内，相互连接，并有细胞外基质形成(×1 000)
Fig. 3 BMSCs were grown into the micropore of BGC and
cells connected with each other, extracellular matrix could be observed (×1 000)
, 百拇医药
图4 细胞跨越PLA表面的微孔，有胶原纤维产生(×1 000)
Fig. 4 BMSCs were crossed to the micropore of PLA,and collagen fibers could be observed (×1 000)
2.4 细胞增殖测定
随培养时间的延长，各组细胞数量都有所增加，BGC组在第8天与对照组有显著性差异(P<0.05)而PLA组与对照组无显著性差异(P>0.05)。结果见表1。
表1 各组MTT法测定吸光度值(n=8，
±s)
Tab. 1 Absorption coefficient by MTT method in various groups(n=8，±s) 组 别
, 百拇医药
Groups
2天
2 days
4天
4 days
6天
6 days
8天
8 days
对照组
Control group
0.219±0.056
0.276±0.054
, 百拇医药
0.623±0.053
0.971±0.025
BGC组
BGC group
0.223±0.092
0.325±0.069
0.689±0.058
1.011±0.035
PLA组
PLA group
0.198±0.091
0.278±0.099
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0.653±0.062
0.960±0.030
2.5 蛋白含量检测
随培养时间的延长，各组细胞数量均有增加，各组细胞蛋白含量测定无明显差异(P>0.05)。结果见表2。表2 各组蛋白测定值(μg/ml,n=8,±s)
Tab. 2 Protein content in various groups(μg/ml,n=8,±s) 组 别
Groups
2天
, 百拇医药
2 days
4天
4 days
6天
6 days
8天
8 days
对照组
Control group
38.53±10.55
91.86±10.26
122.06±12.22
, 百拇医药
140.25±6.99
BGC组
BGC group
41.80±11.53
88.70± 6.85
112.10±12.22
146.92±2.57
PLA组
PLA group
39.94±10.55
94.46± 6.29
, 百拇医药 123.74± 8.58
142.69±5.84
2.6 碱性磷酸酶定量测定
各组细胞ALP活性测定无明显差异(P>0.05)。结果见表3。表3 各组ALP测定值(ml/mg蛋白质，n=8,±s)
Tab. 3 ALP value in various groups(ml/mg protein, n=8,±s) 组 别
Groups
2天
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2 days
4天
4 days
6天
6 days
8天
8 days
对照组
Control group
2.474±1.743
4.301±1.413
7.020±1.203
, 百拇医药
8.134±1.073
BGC组
BGC group
3.045±1.688
4.878±0.970
7.306±1.953
8.233±1.340
PLA组
PLA group
2.437±1.270
4.296±1.420
6.613±1.583
, 百拇医药
8.074±1.297
3 讨论
由创伤、感染、肿瘤及先天性疾病等各种原因造成的四肢骨缺损、骨不愈合十分常见，如何进一步提高骨缺损的治疗效果，仍是骨科十分棘手的问题。近年来，随着细胞生物学和材料科学的发展，一些学者开始尝试将培养的细胞与人工细胞外基质复合后用于组织创伤的修复，已再生出具有仿真形态的软骨及皮肤组织[2]，并已初步应用于临床，为组织创伤的修复包括骨组织的修复提供了新的可能，并由此发展成为一门新的学科——组织工程学。
在骨组织工程修复骨缺损的研究中，对于细胞来源及生物材料的选择有一定的要求。其中细胞来源要求取材方便、成骨能力确切[3]。我们培养的细胞贴壁生长、形态多为梭形及多角形细胞，不出现接触抑制，呈多层重叠生长，电镜下可见细胞形成胶原纤维并有钙盐沉积，具有成骨细胞相似的形态及生长特点[4、5]。同时，经传代的骨髓基质细胞表现出较强的碱性磷酸酶活性，具有与成骨细胞类似的功能性表现。证实采用此种方法培养的骨髓基质细胞单细胞悬液脱离了原有的骨骼环境，在体外仍有成骨表现，为确定性骨祖细胞，具有明确的成骨能力，并且骨髓取材方便、创伤小，可以作为骨组织工程学研究中与生物材料复合的细胞来源。
, 百拇医药
单纯骨髓或骨髓基质细胞植入体内成骨能力较低，主要原因在于没有细胞载体，骨髓易流失，不能在植入部位形成有效的细胞浓度。有学者[6]采用羟基磷灰石等材料作为骨髓基质细胞的载体，较单纯骨髓植入提高了成骨效率。这一方面说明人骨细胞外基质材料作为骨髓基质细胞的载体是可行的，但同时羟基磷灰石为不可降解材料，植入体内后不能被新生骨组织完全替代，所形成的组织不完全符合骨的生物学特性[7]。与此相比，可降解人工细胞外基质如BGC、PLA具有明显的优势，可降解人工细胞外基质与细胞复合植入体内后，提供了可控制植入细胞的环境，且其降解速度可调节，使基质材料在完成支持结构功能后能完全降解吸收，形成的骨组织为真正完全的骨组织。避免了不可降解人工细胞外基质的缺点[8～10]，是近年来骨组织工程学常用的细胞载体材料。
对生物材料相容性研究有很多方法，其中常用的有体内直接植入法、体外复合细胞培养法。体内直接植入由于受多种体内环境因素的影响，不能准确反映生物材料与组织细胞的相容性。而体外复合细胞培养可以直接观察细胞与生物材料复合生长的情况，较前者更为敏感、客观[11]，是近年来研究生物材料相容性的主要方法。
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因此，选用了两种可降解的生物材料：BGC、PLA与骨髓基质细胞在体外复合培养，通过形态学观察，发现骨髓基质细胞可以在PLA、BGC周边贴附生长，并伸入材料之中，也可在材料表面及内部伸展、繁殖，保持细胞的梭形形态，并能分泌胶原纤维、钙离子颗粒等细胞外基质，其形态学表现未受到影响。
利用MTT比色法对细胞增殖进行检测，MTT是一种能接受氢原子的染料，活细胞线粒体的琥珀脱氢酸能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，该物质溶解后，在570 nm有最大吸收峰。在一定细胞范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比[12]。MTT法与其它检测细胞活力的方法如细胞计数法等有良好的相关性，检测MTT结晶形成的量可以间接反映细胞数量与活力。通过MTT法检测发现与BGC、PLA复合培养的骨髓基质细胞其增殖不受影响，同时BGC对细胞的生长还有一定的促进作用，表明PLA、BGC对骨髓基质细胞的生长分裂无明显的干扰作用。
, http://www.100md.com 仅检测生物材料对细胞增殖的作用，不足以说明生物材料对细胞功能有无影响。为更全面检测BGC、PLA对细胞功能状态的影响，进行细胞蛋白测定及碱性磷酸酶测定。碱性磷酸酶是成骨细胞分化成熟的重要标志，被认为与成骨细胞的分化有密切关系[13]。本实验显示，各组蛋白质含量及ALP活性均有增高，同期比较无明显差别。说明这两种生物材料不仅对骨髓基质细胞的增殖无明显阻滞作用，同时对细胞的功能尤其是对于骨髓基质细胞向成骨细胞转化无明显影响。由此可见，BGC、PLA具有良好的细胞相容性，有可能作为骨髓基质细胞的载体应用于组织工程的研究。
虽然BGC、PLA与骨髓基质细胞具有良好的生物相容性，但仍存在许多问题：BGC、PLA与细胞复合植入体内后降解与新生骨组织的关系，BGC、PLA降解速度的调节等均有待于深入研究。同时随着材料科学的发展，产生了许多新型材料，如：有机无机复合材料、新型高分子材料聚原酸酯、聚丁酸等。这些材料在骨组织工程学中的应用前景仍不明确。这些问题仍需进一步研究。
, 百拇医药
参考文献：
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, 百拇医药
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收稿日期：1998-12-02
修稿日期：1999-02-04, 百拇医药
单位：金丹(第一军医大学附属南方医院创伤骨科(广州，510515)；裴国献(第一军医大学附属南方医院创伤骨科(广州，510515)；王前(第一军医大学附属南方医院创伤骨科(广州，510515))
关键词：骨髓基质细胞；生物材料；生物相容性；组织工程
中国修复重建外科杂志000115 摘 要：目的 探讨骨髓基质细胞与生物活性玻璃陶瓷(BGC)和聚乳酸(PLA)的生物相容性，为骨组织工程中生物材料的选择提供依据。方法 将骨髓基质细胞与BGC、PLA复合体外培养，进行形态学观察、细胞增殖、蛋白质含量及酶学测定。结果 骨髓基质细胞能在BGC、PLA上贴附、繁殖，其生长及功能不受影响，并且BGC具有一定的促细胞增殖作用。结论 BGC、PLA具有良好的细胞相容性，有可能作为骨髓基质细胞的载体应用于组织工程的研究。
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BIOCOMPATIBILITY STUDIES ON BIOACTIVE GLASS CERAMICS AND POLYLACTIC ACID COMBINED WITH CULTURED BONE MARROW STROMAL CELLS IN VITRO
JIN Dan PEI Guo-xian WANG Qian
(Department of Orthopedic and Trauma Surgery, Nanfang Hospital, the First Military Medical University. Guangzhou Guangdong, P.R.China 510515)
Abstract：Objective To study the biocompatibility on bioactive glass ceramics (BGC) and polylactic acid (PLA) combined with cultured bone marrow stromal cells (BMSCs) in bone tissue engineering. Methods BMSCs were cultured combined with BGC and PLA in vitro, and the morphological characters, cell proliferation, protein content, and alkaline phosphatase activity were detected. Results BMSCs could be attached to and extended on both BGC and PLA, and normally grown, proliferated, had active function. BGC could promote cell proliferation. Conclusion The results show that both BGC and PLA have good biocompatibility with BMSCs, they can be used as biomaterials for cell transplantation in tissue engineering.
, 百拇医药
Key words：Bone marrow stromal cells Biomaterials Biocompatibility Tissue engineering▲
骨缺损修复一直是骨科领域的难题之一，目前常用的人工合成替代物、异体骨移植、自体骨移植等方法在不同程度上存在一定的问题。近年来，组织工程化骨组织的研究为骨缺损修复提供了全新的思路和方 法[1、2]，是研究的热点之一。对于骨组织工程的研究，生物材料的生物相容性检测是其中重要的一个环节。我们选择骨髓基质细胞与生物活性玻璃陶瓷(bioactive glass ceramics，BGC)、聚乳酸(polylactic acid, PLA)生物材料进行体外复合培养，检测其生物学性能，为骨组织工程中生物材料的选择提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
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RPMI 1640 (GIBCO)、新生牛血清(杭州四季青生物制品有限公司)、胰蛋白酶(天象人生物制品公司)、四唑盐(MTT，5 mg/ml)、甲瓒溶解液、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白、24孔培养板、725紫外分光光度计、碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物制品有限公司)、BGC(中国科学院成都光电研究所)、PLA(中山大学高分子研究所)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 选4～8周龄健康新西兰大白兔，16号骨穿针抽吸双侧股骨骨髓共3 ml，混入RPMI 1640完全培养基(含青霉素及链霉素各100 U/ml，维生素C50 μg/ml，20%新生牛血清)10 ml，经4号针头反复抽吸，制成单细胞悬液，以3×106 /ml细胞数接种入50 ml培养瓶中，置于37℃、5% CO2孵箱中，5天后半量换液(1640完全培养基)，以后2～3天全量换液一次，细胞汇合成单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，计数。进入传代培养，使用条件培养基。
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1.2.2 细胞接种
将传代至第3代的细胞以1.5×104/ml接种于24孔培养板或置有盖玻片的培养皿，每孔加入培养基1 ml。实验分为三组，即BGC组、PLA组及对照组。其中BGC组、PLA组中每孔加3 mm×3 mm×1 mm BGC或PLA材料，对照组单纯接种细胞，于不同时间进行处理，用于观察及检测。
1.2.3 相差显微镜观察 逐日使用相差显微镜观察细胞生长及与生物材料附着情况。
1.2.4 碱性磷酸酶染色 将培养3周的附有细胞的盖玻片取出，采用改良Gomori氏钙钴法进行碱性磷酸酶定性检测。
1.2.5 扫描电镜观察 分别于各时间点将生物材料取出，2%戊二醛固定，系列脱水，乙酸异戊酯置换，临界点干燥，表面喷金后进行观察。
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1.2.6 MTT法分析骨髓基质细胞与BGC、PLA复合培养的成活和增殖能力 按上述方法接种细胞后，于2、4、6及8天弃原培养基，加入MTT50 μl，37℃孵育4小时，加入甲瓒溶解液1 ml，选择波长570 nm比色，测定光吸收值。
1.2.7 考马斯亮蓝微量测定细胞蛋白含量 于2、4、6及8天将培养的细胞制成细胞裂解液。取1 ml考马斯亮蓝染液与100 μl上述细胞裂解液混匀，放置5分钟。用紫外光分光光度计在595 nm波长处测定溶液的光吸收值。以0.05%Triton X-100为空白对照、以牛血清白蛋白为标准品绘制标准曲线。依据标准曲线推算样品蛋白质含量。
1.2.8 碱性磷酸酶定量检测 按试剂盒说明要求操作，进行碱性磷酸酶定量测定。
1.2.9 统计方法 所测数据进行方差统计分析。P值<0.05时为有统计学差异。
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2 结果
2.1 相差显微镜观察
细胞接种后24小时可见部分大圆形单核细胞贴壁，72小时后细胞开始增殖并向几种细胞形态分化，5～8天后，细胞逐渐形成分散的细胞集落，其形状与大小各不相同，多为成纤维型细胞形态，称成纤维细胞集落。10～12天后细胞集落间相互融合成单层，形态多转化为梭形，为成纤维细胞型表现。
细胞传代培养中使用条件培养基(1640完全培养基中加入地塞米松8～10 mol/L、β-甘油磷酸钠10 mmol/L)，4小时开始贴壁，8～10小时基本贴壁完全，细胞多向梭形、多角形细胞转化，带有数个突起，突起的个数及形态各不相同。培养10～12天后细胞融合成单层，随着培养时间的延长，细胞形成多层细胞层，并不发生细胞间的接触抑制现象(图1)。
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图1 传代培养第8天细胞多向梭形细胞、多角形细胞转化(×200)
Fig. 1 Spindle-like and polygonal cell in
shape after subculture 8 days(×200)
细胞与材料复合培养组 早期可见培养板内细胞增多，并向BGC、PLA材料移行贴附于材料周边，部分细胞直接贴附于材料表面，随复合培养时间延长，附着的细胞增多，并可分泌细胞外基质，充填BGC、PLA材料周边的凹陷中，材料表面的细胞增殖连接成片，形成单层，细胞形态多为梭形及三角形，各材料组细胞生长状态与对照组相似，无细胞衰老及异常分裂现象(图2)。
图2 骨髓基质细胞与BGC复合培养第8天，材料周围有多量细胞附着(×100)
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Fig. 2 More cells were attached to materials
after 8 days of BMSCs combined culture with BGC(×100)
2.2 碱性磷酸酶定性染色
经改良钙钴法染色后，在骨髓基质细胞的胞浆中可见浅棕色至棕黑色的细小颗粒，细胞着色程度不一，碱性磷酸酶阳性率可达到80%以上，在细胞密集区反应强烈。
2.3 扫描电镜观察
单纯培养组培养6天的细胞多为单层细胞结构，细胞为梭形或多角形表现，带多个突起，各细胞突起数目不等，长短粗细各异，胞体表面有颗粒状物，可见细长微丝形成，形成细胞间的连接，细胞上及细胞间可见钙盐结晶沉积。
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BGC表面在扫描电镜下为微颗粒状，具有微孔。培养2～4天时，细胞附着于材料表面，形态多样，有多个突起，细胞跨越微孔表面或向孔内长入，培养8天后细胞连接成片，可见细胞表层有丝状纤维形成(图3)。PLA表面较平坦光滑，上有较大的孔隙。培养早期细胞散在于材料表面，呈有多个突起的梭形或多角形，细胞间连接松散(图4)。随培养时间延长，细胞增殖，连接成单层或生长附着于较大孔隙表面，细胞排列紧密，部分区域有细胞外基质形成。
图3 细胞长入BGC的微孔内，相互连接，并有细胞外基质形成(×1 000)
Fig. 3 BMSCs were grown into the micropore of BGC and
cells connected with each other, extracellular matrix could be observed (×1 000)
, 百拇医药
图4 细胞跨越PLA表面的微孔，有胶原纤维产生(×1 000)
Fig. 4 BMSCs were crossed to the micropore of PLA,and collagen fibers could be observed (×1 000)
2.4 细胞增殖测定
随培养时间的延长，各组细胞数量都有所增加，BGC组在第8天与对照组有显著性差异(P<0.05)而PLA组与对照组无显著性差异(P>0.05)。结果见表1。
表1 各组MTT法测定吸光度值(n=8，
±s)Tab. 1 Absorption coefficient by MTT method in various groups(n=8，
±s) 组 别, 百拇医药
Groups
2天
2 days
4天
4 days
6天
6 days
8天
8 days
对照组
Control group
0.219±0.056
0.276±0.054
, 百拇医药
0.623±0.053
0.971±0.025
BGC组
BGC group
0.223±0.092
0.325±0.069
0.689±0.058
1.011±0.035
PLA组
PLA group
0.198±0.091
0.278±0.099
, http://www.100md.com
0.653±0.062
0.960±0.030
2.5 蛋白含量检测
随培养时间的延长，各组细胞数量均有增加，各组细胞蛋白含量测定无明显差异(P>0.05)。结果见表2。表2 各组蛋白测定值(μg/ml,n=8,
±s)Tab. 2 Protein content in various groups(μg/ml,n=8,
±s) 组 别Groups
2天
, 百拇医药
2 days
4天
4 days
6天
6 days
8天
8 days
对照组
Control group
38.53±10.55
91.86±10.26
122.06±12.22
, 百拇医药
140.25±6.99
BGC组
BGC group
41.80±11.53
88.70± 6.85
112.10±12.22
146.92±2.57
PLA组
PLA group
39.94±10.55
94.46± 6.29
, 百拇医药 123.74± 8.58
142.69±5.84
2.6 碱性磷酸酶定量测定
各组细胞ALP活性测定无明显差异(P>0.05)。结果见表3。表3 各组ALP测定值(ml/mg蛋白质，n=8,
±s)Tab. 3 ALP value in various groups(ml/mg protein, n=8,
±s) 组 别Groups
2天
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2 days
4天
4 days
6天
6 days
8天
8 days
对照组
Control group
2.474±1.743
4.301±1.413
7.020±1.203
, 百拇医药
8.134±1.073
BGC组
BGC group
3.045±1.688
4.878±0.970
7.306±1.953
8.233±1.340
PLA组
PLA group
2.437±1.270
4.296±1.420
6.613±1.583
, 百拇医药
8.074±1.297
3 讨论
由创伤、感染、肿瘤及先天性疾病等各种原因造成的四肢骨缺损、骨不愈合十分常见，如何进一步提高骨缺损的治疗效果，仍是骨科十分棘手的问题。近年来，随着细胞生物学和材料科学的发展，一些学者开始尝试将培养的细胞与人工细胞外基质复合后用于组织创伤的修复，已再生出具有仿真形态的软骨及皮肤组织[2]，并已初步应用于临床，为组织创伤的修复包括骨组织的修复提供了新的可能，并由此发展成为一门新的学科——组织工程学。
在骨组织工程修复骨缺损的研究中，对于细胞来源及生物材料的选择有一定的要求。其中细胞来源要求取材方便、成骨能力确切[3]。我们培养的细胞贴壁生长、形态多为梭形及多角形细胞，不出现接触抑制，呈多层重叠生长，电镜下可见细胞形成胶原纤维并有钙盐沉积，具有成骨细胞相似的形态及生长特点[4、5]。同时，经传代的骨髓基质细胞表现出较强的碱性磷酸酶活性，具有与成骨细胞类似的功能性表现。证实采用此种方法培养的骨髓基质细胞单细胞悬液脱离了原有的骨骼环境，在体外仍有成骨表现，为确定性骨祖细胞，具有明确的成骨能力，并且骨髓取材方便、创伤小，可以作为骨组织工程学研究中与生物材料复合的细胞来源。
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单纯骨髓或骨髓基质细胞植入体内成骨能力较低，主要原因在于没有细胞载体，骨髓易流失，不能在植入部位形成有效的细胞浓度。有学者[6]采用羟基磷灰石等材料作为骨髓基质细胞的载体，较单纯骨髓植入提高了成骨效率。这一方面说明人骨细胞外基质材料作为骨髓基质细胞的载体是可行的，但同时羟基磷灰石为不可降解材料，植入体内后不能被新生骨组织完全替代，所形成的组织不完全符合骨的生物学特性[7]。与此相比，可降解人工细胞外基质如BGC、PLA具有明显的优势，可降解人工细胞外基质与细胞复合植入体内后，提供了可控制植入细胞的环境，且其降解速度可调节，使基质材料在完成支持结构功能后能完全降解吸收，形成的骨组织为真正完全的骨组织。避免了不可降解人工细胞外基质的缺点[8～10]，是近年来骨组织工程学常用的细胞载体材料。
对生物材料相容性研究有很多方法，其中常用的有体内直接植入法、体外复合细胞培养法。体内直接植入由于受多种体内环境因素的影响，不能准确反映生物材料与组织细胞的相容性。而体外复合细胞培养可以直接观察细胞与生物材料复合生长的情况，较前者更为敏感、客观[11]，是近年来研究生物材料相容性的主要方法。
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因此，选用了两种可降解的生物材料：BGC、PLA与骨髓基质细胞在体外复合培养，通过形态学观察，发现骨髓基质细胞可以在PLA、BGC周边贴附生长，并伸入材料之中，也可在材料表面及内部伸展、繁殖，保持细胞的梭形形态，并能分泌胶原纤维、钙离子颗粒等细胞外基质，其形态学表现未受到影响。
利用MTT比色法对细胞增殖进行检测，MTT是一种能接受氢原子的染料，活细胞线粒体的琥珀脱氢酸能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，该物质溶解后，在570 nm有最大吸收峰。在一定细胞范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比[12]。MTT法与其它检测细胞活力的方法如细胞计数法等有良好的相关性，检测MTT结晶形成的量可以间接反映细胞数量与活力。通过MTT法检测发现与BGC、PLA复合培养的骨髓基质细胞其增殖不受影响，同时BGC对细胞的生长还有一定的促进作用，表明PLA、BGC对骨髓基质细胞的生长分裂无明显的干扰作用。
, http://www.100md.com 仅检测生物材料对细胞增殖的作用，不足以说明生物材料对细胞功能有无影响。为更全面检测BGC、PLA对细胞功能状态的影响，进行细胞蛋白测定及碱性磷酸酶测定。碱性磷酸酶是成骨细胞分化成熟的重要标志，被认为与成骨细胞的分化有密切关系[13]。本实验显示，各组蛋白质含量及ALP活性均有增高，同期比较无明显差别。说明这两种生物材料不仅对骨髓基质细胞的增殖无明显阻滞作用，同时对细胞的功能尤其是对于骨髓基质细胞向成骨细胞转化无明显影响。由此可见，BGC、PLA具有良好的细胞相容性，有可能作为骨髓基质细胞的载体应用于组织工程的研究。
虽然BGC、PLA与骨髓基质细胞具有良好的生物相容性，但仍存在许多问题：BGC、PLA与细胞复合植入体内后降解与新生骨组织的关系，BGC、PLA降解速度的调节等均有待于深入研究。同时随着材料科学的发展，产生了许多新型材料，如：有机无机复合材料、新型高分子材料聚原酸酯、聚丁酸等。这些材料在骨组织工程学中的应用前景仍不明确。这些问题仍需进一步研究。
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收稿日期：1998-12-02
修稿日期：1999-02-04, 百拇医药