抗CD34单克隆抗体HI273的制备和鉴定
作者：佘鸣 沈德诚 廖晓龙 黄丽华 周立 李洪钊 张金香 郭桂庆 陈辉树
单位：佘鸣 沈德诚 廖晓龙 黄丽华 周立 李洪钊 张金香 郭桂庆 陈辉树(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所，天津300020)
关键词：CD34；单克隆抗体；免疫组化；ELISA
细胞与分子免疫学杂志000128
中图号：R392.11 文献标识码：B
文章编号:1007-8738(2000)01-0079-80
CD34抗原可选择性地表达于不成熟的造血干/祖细胞、血管内皮细胞和一些组织的成纤维细胞上。这一发现，不仅有利地促进了对造血干/祖细胞识别、发育、增殖和分化的研究，而且大大推动了临床上应用CD34+细胞回输体内治疗某些血液病和恶性肿瘤的开展。目前，抗CD34 mAb已成为研究造血调控、识别、分离富集造血干/祖细胞，以及分析白血病细胞表型的非常有用的工具。国际上，经HLDA命名的抗CD34 mAb近40株〔1，2〕。国内仅于1995年见舒翠玲等〔3〕报道的用表达CD34抗原的重组痘苗病毒为抗原，制备的4株分泌抗CD34抗原的mAb杂交瘤细胞。我们以人髓系细胞KG-1a为抗原，用杂交瘤技术成功地制备出1株抗CD34抗原的mAb杂交瘤细胞HI273，经1年多的冻存、复苏和传代，一直保持了稳定分泌抗CD34 mAb的能力。
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1 材料和方法
1.1 材料 免疫原为人髓系细胞系KG-1a细胞。标准的抗CD34 mAb：TüK3，581PE(Pharmingen公司)和HPCA2-PE(B.D公司)，后两株mAb均识别CD34第III类抗原表位。用于 mAb鉴定的靶细胞：①正常人周血单个核细胞(PBMC)、T细胞(T)、B细胞(B)、红细胞(RBC)、血小板(Pt)、扁桃体细胞(Ton)和胸腺细胞(Thy)。②T细胞白血病细胞系MOLT4，CEM，HPB-ALL和HSB2。B细胞白血病细胞系：Nalm-6，Daudi,JIJOYE,Raji,Lyon，CKM和LCL-H。髓系白血病细胞系：KG-1,KG-1a,HL60,U-937,THP-1,K-562和HeL。③基因转染细胞系：CD33基因转染细胞系NFMY-9S和CD34基因转染细胞系EG1CD34及用于转染该两基因的细胞系N+8。
1.2 方法 mAb的制备按本室常规方法，用KG-1a细胞腹腔免疫Balb/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓细胞NS1融合，间接免疫荧光法筛选，将获得的阳性杂交瘤细胞扩大培养，并亚克隆至100%阳性。mAb的特异性鉴定采用了以下4种方法：①间接免疫荧光显微镜法 按本室常规进行，所用荧光显微镜为Opton(德国)产品；②流式细胞仪(FACScan,B.D公司)检测，由美国Pharmingen公司，陈璋、杨希峰协助完成；③免疫组化 APAAP法按本所常规进行；④竞争抑制试验由美国Phamingen公司的陈璋、杨希峰协助用FACScan完成。mAb Ig亚类的检测,采用Pharmingen公司生产的小鼠Ig亚类ELISA检测试剂盒。
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2 结 果
2.1 杂交瘤细胞株的建立 融合8块96孔板，筛选了180个单克隆孔，阳性孔为28个，只有1孔3C2的反应谱与CD34相似。将此孔扩大培养，经两次亚克隆，检测孔达100%阳性。将建立的杂交瘤细胞株，命名为HI273。将其注入经不完全佐剂予处理的Balb/c小鼠腹腔，获得的mAb腹水效价在1∶1000以上。纯化后供进一步研究用。
2.2 mAb的特异性鉴定 ①间接免疫荧光显微镜法：以人的各种造血和非造血组织细胞、人各类白血病细胞系细胞和CD33，CD34基因转染的细胞为靶细胞，鉴定了mAbHI273对上述细胞的反应性。结果表明，mAbHI273与正常人PBMC，T，B，RBC，Pt，以及人扁桃体和胸腺细胞均不起反应，与用于检测的所有T细胞系细胞和B细胞系细胞，以及髓系细胞系细胞HL-60，U937，THP-1，K562和HeL等15株细胞也不起反应。但与髓系细胞系KG-1和KG-1a反应呈阳性，阳性率分别为68%和90%。对于转染细胞，mAb HI273与CD34+的 EG1-CD34细胞反应呈阳性；而与CD33+的转染细胞NFMY-9s和用于转染CD33和CD34基因的细胞系N+8的反应均呈阴性。以标准的抗CD34 mAb Tük3为对照，检测了9例白血病患者的细胞，所获结果基本一致，即与5例完全不起反应，与3例反应的阳性率在10%～30%，1例用标准的和本文制备的抗CD34 mAb的反应性阳性率分别为75%和80%。上述反应性符合抗CD34 mAb的反应谱。②FACS测定：用标准的抗CD34 mAb 581与mAb HI273在FACS上也同时检测了KG-1a，CD34+和CD34-的细胞，所得结果相同。对于人的骨髓细胞，mAb HI273与其CD45+细胞的富干/祖细胞窗口中的细胞反应结果，阳性率为11.3%(581为12.7%)。③免疫组化 染色：用APAAP法检测了人皮肤、胃、肠、肝、脾、肾、心肌、胰腺、甲状腺、脐带和膀胱等15种组织及成纤维细胞，mAb HI273只与其中的血管内皮细胞反应呈阳性，与其它组织细胞全部呈阴性反应。④竞争抑制试验：为进一步说明mAb HI273与CD34的关系，又以KG-1a细胞为靶细胞，用mAb HI273与标准的抗CD34 mAb 581-PE和HPCA-2-PE进行了竞争抑制试验。用FACS检测的结果显示，mAb HI273可完全抑制mAb 581-PE和HPCA-2-PE与KG-1a细胞的结合，从而证实mAb HI273确为抗CD34 mAb，且属于识别CD34抗原第III类表位的抗体。⑤mAb HI273的Ig亚类 用ELISA法测定mAb HI273的重链为IgG2b，轻链为κ链。
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3 讨 论
国际上最早的两株抗CD34 mAb My10和BI-3C5，分别是用髓系细胞系细胞KG-1a和KG1免疫Balb/c小鼠而制备的。本文以KG-1a细胞为抗原，成功地制备出了1株抗CD34 mAb HI273。通过上述一系列鉴定提示，mAb HI273确实是抗CD34抗体，识别的表位可能与581和HPCA-2相同，为CD34抗原的第III类表位。至于为什么未见成纤维细胞阳性，尚需扩大检测的样品进一步观察。
关于CD34抗原表位，现主要根据不同抗CD34 mAb与KG-1a(或KG-1)细胞结合的表位，对神经氨酸酶(Neu)、木瓜蛋白酶(Chy)和溶血性巴斯德菌糖蛋白酶(Gly)敏感性的不同，将CD34抗原分为3类。第I类对Neu,Chy和Gly均敏感(如My10.BI-3C5.12.8等)；第II类对Neu抵抗，对Chy和GLy敏感(如1CH3,QBEnd10,43A1等)；第III类对Neu,Chy和Gly均抵抗(如581，HPCA-2.553等)。最新发现，CD34抗原的不同表位，在正常造血干/祖细胞和白血病母细胞上的分布不均一，有其重要的理论和应用价值〔4，5〕。CD34是一种相对分子质量(Mr)为11×104～12×104的高度糖基化I型穿膜蛋白，但至今其功能尚不十分清楚。最近研究发现，它可参与细胞的粘附和迁移，提示在早期造血过程中起着重要的作用。mAb HI273的研制成功，必将在该领域的基础和临床研究中发挥其应有的作用。目前，我们已将mAb HI273提交给即将在2000年召开的第七届HLDA进一步鉴定命名。
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作者简介：佘鸣，女，42岁，主管技师
天津市南京路288号，Tel.(022)27214653
参考文献：
〔1〕 Schlossman S, Boumsell L,Gilks W, et al. Leucocyte typing V〔M〕 . 1995:840- 871.
〔2〕 Kishimoto T. Kikutaui H, Von dem Borne AEGKr, et al. Leucocyte typing VI〔J〕 . 1997; 974- 984.
〔3〕舒翠玲，孙英勋，于鸣，等.抗CD34单克隆抗体的研制〔J〕.单克隆抗体通讯，1995；11(1)：67-68.
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〔4〕 Steen R, Egeland T. CD34 molecule epitope distribution on cells of hematopoietic origin〔J〕 . Leuk Lymph, 1998;30:23- 30.
〔5〕 Croockewit AJ, Raymakers PAP, Preijers FWMB, et al. The role of the different CD34 epitopes in detection and positive selection of CD34+ bone marrow and peripheral blood stem cells〔J〕 . Scand J Immunol, 1998; 40:82- 90.
收稿日期：1999-05-04
修回日期：1999-06-21, http://www.100md.com
单位：佘鸣 沈德诚 廖晓龙 黄丽华 周立 李洪钊 张金香 郭桂庆 陈辉树(中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所，天津300020)
关键词：CD34；单克隆抗体；免疫组化；ELISA
细胞与分子免疫学杂志000128
中图号：R392.11 文献标识码：B
文章编号:1007-8738(2000)01-0079-80
CD34抗原可选择性地表达于不成熟的造血干/祖细胞、血管内皮细胞和一些组织的成纤维细胞上。这一发现，不仅有利地促进了对造血干/祖细胞识别、发育、增殖和分化的研究，而且大大推动了临床上应用CD34+细胞回输体内治疗某些血液病和恶性肿瘤的开展。目前，抗CD34 mAb已成为研究造血调控、识别、分离富集造血干/祖细胞，以及分析白血病细胞表型的非常有用的工具。国际上，经HLDA命名的抗CD34 mAb近40株〔1，2〕。国内仅于1995年见舒翠玲等〔3〕报道的用表达CD34抗原的重组痘苗病毒为抗原，制备的4株分泌抗CD34抗原的mAb杂交瘤细胞。我们以人髓系细胞KG-1a为抗原，用杂交瘤技术成功地制备出1株抗CD34抗原的mAb杂交瘤细胞HI273，经1年多的冻存、复苏和传代，一直保持了稳定分泌抗CD34 mAb的能力。
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1 材料和方法
1.1 材料 免疫原为人髓系细胞系KG-1a细胞。标准的抗CD34 mAb：TüK3，581PE(Pharmingen公司)和HPCA2-PE(B.D公司)，后两株mAb均识别CD34第III类抗原表位。用于 mAb鉴定的靶细胞：①正常人周血单个核细胞(PBMC)、T细胞(T)、B细胞(B)、红细胞(RBC)、血小板(Pt)、扁桃体细胞(Ton)和胸腺细胞(Thy)。②T细胞白血病细胞系MOLT4，CEM，HPB-ALL和HSB2。B细胞白血病细胞系：Nalm-6，Daudi,JIJOYE,Raji,Lyon，CKM和LCL-H。髓系白血病细胞系：KG-1,KG-1a,HL60,U-937,THP-1,K-562和HeL。③基因转染细胞系：CD33基因转染细胞系NFMY-9S和CD34基因转染细胞系EG1CD34及用于转染该两基因的细胞系N+8。
1.2 方法 mAb的制备按本室常规方法，用KG-1a细胞腹腔免疫Balb/c小鼠。取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓细胞NS1融合，间接免疫荧光法筛选，将获得的阳性杂交瘤细胞扩大培养，并亚克隆至100%阳性。mAb的特异性鉴定采用了以下4种方法：①间接免疫荧光显微镜法 按本室常规进行，所用荧光显微镜为Opton(德国)产品；②流式细胞仪(FACScan,B.D公司)检测，由美国Pharmingen公司，陈璋、杨希峰协助完成；③免疫组化 APAAP法按本所常规进行；④竞争抑制试验由美国Phamingen公司的陈璋、杨希峰协助用FACScan完成。mAb Ig亚类的检测,采用Pharmingen公司生产的小鼠Ig亚类ELISA检测试剂盒。
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2 结 果
2.1 杂交瘤细胞株的建立 融合8块96孔板，筛选了180个单克隆孔，阳性孔为28个，只有1孔3C2的反应谱与CD34相似。将此孔扩大培养，经两次亚克隆，检测孔达100%阳性。将建立的杂交瘤细胞株，命名为HI273。将其注入经不完全佐剂予处理的Balb/c小鼠腹腔，获得的mAb腹水效价在1∶1000以上。纯化后供进一步研究用。
2.2 mAb的特异性鉴定 ①间接免疫荧光显微镜法：以人的各种造血和非造血组织细胞、人各类白血病细胞系细胞和CD33，CD34基因转染的细胞为靶细胞，鉴定了mAbHI273对上述细胞的反应性。结果表明，mAbHI273与正常人PBMC，T，B，RBC，Pt，以及人扁桃体和胸腺细胞均不起反应，与用于检测的所有T细胞系细胞和B细胞系细胞，以及髓系细胞系细胞HL-60，U937，THP-1，K562和HeL等15株细胞也不起反应。但与髓系细胞系KG-1和KG-1a反应呈阳性，阳性率分别为68%和90%。对于转染细胞，mAb HI273与CD34+的 EG1-CD34细胞反应呈阳性；而与CD33+的转染细胞NFMY-9s和用于转染CD33和CD34基因的细胞系N+8的反应均呈阴性。以标准的抗CD34 mAb Tük3为对照，检测了9例白血病患者的细胞，所获结果基本一致，即与5例完全不起反应，与3例反应的阳性率在10%～30%，1例用标准的和本文制备的抗CD34 mAb的反应性阳性率分别为75%和80%。上述反应性符合抗CD34 mAb的反应谱。②FACS测定：用标准的抗CD34 mAb 581与mAb HI273在FACS上也同时检测了KG-1a，CD34+和CD34-的细胞，所得结果相同。对于人的骨髓细胞，mAb HI273与其CD45+细胞的富干/祖细胞窗口中的细胞反应结果，阳性率为11.3%(581为12.7%)。③免疫组化 染色：用APAAP法检测了人皮肤、胃、肠、肝、脾、肾、心肌、胰腺、甲状腺、脐带和膀胱等15种组织及成纤维细胞，mAb HI273只与其中的血管内皮细胞反应呈阳性，与其它组织细胞全部呈阴性反应。④竞争抑制试验：为进一步说明mAb HI273与CD34的关系，又以KG-1a细胞为靶细胞，用mAb HI273与标准的抗CD34 mAb 581-PE和HPCA-2-PE进行了竞争抑制试验。用FACS检测的结果显示，mAb HI273可完全抑制mAb 581-PE和HPCA-2-PE与KG-1a细胞的结合，从而证实mAb HI273确为抗CD34 mAb，且属于识别CD34抗原第III类表位的抗体。⑤mAb HI273的Ig亚类 用ELISA法测定mAb HI273的重链为IgG2b，轻链为κ链。
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3 讨 论
国际上最早的两株抗CD34 mAb My10和BI-3C5，分别是用髓系细胞系细胞KG-1a和KG1免疫Balb/c小鼠而制备的。本文以KG-1a细胞为抗原，成功地制备出了1株抗CD34 mAb HI273。通过上述一系列鉴定提示，mAb HI273确实是抗CD34抗体，识别的表位可能与581和HPCA-2相同，为CD34抗原的第III类表位。至于为什么未见成纤维细胞阳性，尚需扩大检测的样品进一步观察。
关于CD34抗原表位，现主要根据不同抗CD34 mAb与KG-1a(或KG-1)细胞结合的表位，对神经氨酸酶(Neu)、木瓜蛋白酶(Chy)和溶血性巴斯德菌糖蛋白酶(Gly)敏感性的不同，将CD34抗原分为3类。第I类对Neu,Chy和Gly均敏感(如My10.BI-3C5.12.8等)；第II类对Neu抵抗，对Chy和GLy敏感(如1CH3,QBEnd10,43A1等)；第III类对Neu,Chy和Gly均抵抗(如581，HPCA-2.553等)。最新发现，CD34抗原的不同表位，在正常造血干/祖细胞和白血病母细胞上的分布不均一，有其重要的理论和应用价值〔4，5〕。CD34是一种相对分子质量(Mr)为11×104～12×104的高度糖基化I型穿膜蛋白，但至今其功能尚不十分清楚。最近研究发现，它可参与细胞的粘附和迁移，提示在早期造血过程中起着重要的作用。mAb HI273的研制成功，必将在该领域的基础和临床研究中发挥其应有的作用。目前，我们已将mAb HI273提交给即将在2000年召开的第七届HLDA进一步鉴定命名。
, 百拇医药
作者简介：佘鸣，女，42岁，主管技师
天津市南京路288号，Tel.(022)27214653
参考文献：
〔1〕 Schlossman S, Boumsell L,Gilks W, et al. Leucocyte typing V〔M〕 . 1995:840- 871.
〔2〕 Kishimoto T. Kikutaui H, Von dem Borne AEGKr, et al. Leucocyte typing VI〔J〕 . 1997; 974- 984.
〔3〕舒翠玲，孙英勋，于鸣，等.抗CD34单克隆抗体的研制〔J〕.单克隆抗体通讯，1995；11(1)：67-68.
, http://www.100md.com
〔4〕 Steen R, Egeland T. CD34 molecule epitope distribution on cells of hematopoietic origin〔J〕 . Leuk Lymph, 1998;30:23- 30.
〔5〕 Croockewit AJ, Raymakers PAP, Preijers FWMB, et al. The role of the different CD34 epitopes in detection and positive selection of CD34+ bone marrow and peripheral blood stem cells〔J〕 . Scand J Immunol, 1998; 40:82- 90.
收稿日期：1999-05-04
修回日期：1999-06-21, http://www.100md.com