抗角蛋白mAbAK37轻重链可变区基因的克隆及序列分析
作者：王琳 刘玉峰 阎岩
单位：王琳(第四军医大学1西京医院皮肤科2微生物学教研室，陕西西安710032)；刘玉峰(第四军医大学1西京医院皮肤科2微生物学教研室，陕西西安710032)；阎岩(第四军医大学1西京医院皮肤科2微生物学教研室，陕西西安710032)
关键词：角蛋白；单克隆抗体；基因克隆；序列分析
细胞与分子免疫学杂志000119
中图号：Q78 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0058-61
一些表皮过度增殖性皮肤病(银屑病和基底细胞癌等)[1，2]，常发生角蛋白组分的异常变化。本室以往的研究表明，抗角蛋白自身抗体(AKautoAb)及抗角蛋白的单克隆抗体(mAb)对这些疾病具有良好的疗效。但由于鼠源性mAb用于人体时能诱导人体产生抗鼠抗体(HAMA)[8]，且易引起过敏反应，因而限制了其临床应用，有必要对其进行人源化改造。为此，我们采用反转录PCR(RT-PCR)方法，从分泌抗角蛋白mAb的鼠源性杂交瘤细胞中，克隆了该mAb的轻、重链可变区基因，并做了序列分析，为进一步研制基因工程抗体奠定了基础。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料杂交瘤细胞株5G5由我科张亮硕士制备。其分泌的mAb为IgG2b，活性良好，可特异地结合于正常人表皮基底细胞层，识别相对分子质量(Mr)为50000和48000两条角蛋白带，对角蛋白反应的敏感性及特异性较高[3]。轻、重链可变区基因的克隆中所用的载体均是在pUC18的基础上构建[4]的，含有 Hind III， Pst I， Sal I， Xbal I， Nco I， Xho I， BstE II， Sal I和 EcoR I等酶切位点。反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、各种限制性核酸内切酶及核酸分子标记物，分别购自Progema,Clontech和Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取及反转录采用TRIzoL[5]试剂，从培养的杂交瘤细胞中提取细胞总RNA后，按反转录试剂盒要求合成cDNA第1链。
, 百拇医药
1.2.2 可变区基因的扩增及酶切位点的引入以反转录产物为模板，分别用下列A、B两对引物进行PCR扩增VH和VL基因。再以PCR产物为模板，分别用下列C，D两对引物对VH，VL基因进行第2次扩增引入克隆位点。PCR反应的条件：94℃60s，55℃60s和72℃60s，共35次循环。
1.2.3 DNA重组及序列测定将VH和VL基因按文献〔6〕的方法，分别重组入载体pUC181A8VHSfi及pUC18-1A8VHXho中，鉴定后用本校中心实验室的自动测序仪测序并进行计算机分析。
2 结果
2.1 RNA的提取和逆转录将干燥后的细胞总RNA溶于11μL水中，取1μL做10g/L琼脂糖凝胶电泳。电泳后出现3条带，28s和18s带较清晰，且28s带的亮度高于18s带，5s带较弱，说明RNA的质量较好(且降解少)，其含量约为0.1g/L。将其余的10μLRNA进行逆转录。
, 百拇医药
2.2 VH，VL基因的扩增和克隆以A，B引物扩增的产物，经20g/L琼脂糖凝胶电泳后观察，VH基因片段约为360bp(图1A)，VL基因片段约为320bp(图1B)，未见其它非特异性产物，与预计的结果相符。再以PCR产物为模板，在同样条件下换用引物C，D分别于VH和VL基因片段中引入克隆位点。经2g/L琼脂糖凝胶电泳后观察，VH和VL基因片段大小未变。VH基因经NcoI和BstEII酶切消化、回收、纯化后，与相应酶切位点进行双酶切并回收、纯化的载体pUC18-1A8VHSfi相连接；VL基因经NcoI和XhoI酶切消化、回收、纯化后，与相应酶切位点进行双酶切并回收、纯化的载体pUC18-1A8VHXho连接。分别用电穿孔法转化大肠杆菌JM109，随机挑取菌落提取质粒并酶切鉴定。鉴定时，VH基因用EcoRI和HindIII酶切；VL基因用XhoI和HindIII酶切。结果从VH基因中可切出约为480bp的插入片段(含载体及linker)；VL基因中可切出约为380bp(含部分载体)的插入片段(图2)。
, 百拇医药
图 1 小鼠mAbAK37VH,VL基因的扩增
A：a为Marker:PGEM7Zf(+)HaeIII;b为VH基因的扩增产物；B：a见A中的a；c为VL基因的扩增产物.
图 2 小鼠mAbAK37VL、VH基因的酶切鉴定
a：同图1B中的a；b:VH基因用EcoRI和HindIII双酶切结果;c：VL基因用XhoI和HindIII双酶切结果.
2.3 VH，VL基因的序列测定及分析将酶切鉴定正确的重组体进行计算机测序，并将所获结果与EMBL1997基因数据库中已发表的基因序列相比较，未发现有与所克隆的VH和VL基因序列相同的基因，表明两者均为新发现的基因序列。对照Kabat1991年抗体基因库，VH基因隶属于鼠Ig重链可变区第II(B)家族成员，全长351bp，为单一开放读框，可编码117个氨基酸(图3)；VL基因隶属于鼠Igк轻链第IV家族成员，全长306bp，亦为单一开放读框，可编码102个氨基酸(图4)。
, 百拇医药
图3mAbAK37VH基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
注：粗斜体代表引物的序列
图 4 mAb AK37VL基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
注：粗斜体代表引物的序列
VH和VL基因序列的两端均有所使用的PCR引物及正确的酶切位点，均有明确的4个FR区和3个CDR区，并有维持抗体可变区结构所必需的特征性半胱氨酸残基且位置正确[7]。表明所获VH和VL基因的序列符合鼠抗体可变区的特征，且同源性大于80%。
3 讨论
, 百拇医药
抗角蛋白自身抗体(AKautoAb)作为机体免疫调节网络的一部分，在免疫状态的稳定和衰老组织的清除等方面发挥着重要的作用。我科的系列基础研究表明，AKautoAb具有以下活性：抑制无血清培养的角朊细胞增殖，降低其代谢活性；可沉积于角蛋白暴露的部位，抑制表皮细胞的过度增殖，起保护作用；抑制IL-6，IL-8的生物学活性；抑制肿瘤细胞的增殖；对正常角朊细胞和肿瘤细胞的凋亡有一定的促进作用。在临床研究方面，含有AKautoAb的人血丙种球蛋白在银屑病等皮肤病的治疗中取得了良好的疗效，但由于血液制品中尚含有许多其它不利成分，使临床应用受到一定的限制。随后的研究表明，抗角蛋白mAb对角朊细胞的增殖也有抑制作用，与AKautoAb的作用相似。由于不同的皮肤病可出现不同的角蛋白组分的变化，故以应用mAb为好。但鉴于鼠源性mAb的诸多缺点，将其应用于临床前，必须进行人源化改造。
我们从分泌抗角蛋白mAbAK37的杂交瘤细胞5G5中提取总RNA，应用RT-PCR法扩增出抗体的VH和VL基因，并将其克隆进行了序列分析。我们认为成功与否的关键有：①杂交瘤细胞的培养和RNA的提取：杂交瘤细胞质量的好坏直接影响到RNA提取的质量，因此，我们选用了mAb产量高的杂交瘤细胞。提取RNA时，应避免RNA酶的污染，我们采用了TRIzoLReagentkit一步法提取细胞总RNA，省时、简便而且效果好，不失为一种提取RNA的好方法。②引物设计：扩增mAbVH和VL基因所用引物的设计，是成功地获得所需目的基因片段的另一关键因素。我们所用扩增VL基因的引物是根据参考文献[9]并与Kabat抗体库进行比较而设计的扩增人抗体Vк基因的引物，用于扩增鼠源性mAb的VL基因，也取得了满意的结果；扩增VH基因的引物为Orlandi等[10]设计,5′端使用含简并码的引物可最大限度地提高引物与模板的匹配，并可节约一定的费用。为引入酶切位点，我们所用引物C的序列中在NcoI位点的上游有较长的一段无关序列，在酶切过程中可自动被除去。并由于酶切位点的引入，使推导的VL氨基酸序列的两头共缺少了5个氨基酸，因此VL基因的序列应为321bp。我们已将VH基因克隆入含linker的载体pUC18-1A8VHSfi中，可很容易地构建单链抗体。
, 百拇医药
总之，对于一些角蛋白组分发生改变的皮肤病(如前面提到的银屑病、扁平苔藓和基底细胞癌等)，应用抗角蛋白抗体进行治疗很可能是一种有效、先进的方法。我科的系列研究发现，含有抗角蛋白自身抗体的丙种球蛋白对银屑病的治疗有较好的疗效。抗角蛋白mAb的制备为基础研究提供了有用的试剂。但为了使其更好地应用于临床，我们克隆了抗角蛋白mAbAK37的可变区基因并进行了序列分析，为进一步构建基因工程抗体打下了基础。
基金项目：国家1035课题资助,No96-901-01-38
作者简介：王琳，女，33岁，主治医师，硕士
西安市长乐西路15号.Tel.(029)3373382
参考文献：
〔1〕 Thewes M, Stadler R, Korge B, et al. Normal psoriatic epidermis expression of hyperproliferation associated keratins〔J〕 . Arch Dermatol Res,1991;283:465- 471.
, http://www.100md.com
〔2〕 Markey AC, Lane EB, Macdonald DM, et al. Keratin expression in basal cell carcinomas〔J〕 . Br J Dermatol,1992;126:154- 160.
〔3〕张亮、刘玉峰、刘彦仿，等.分泌抗人角蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,1998；14(4)：292-293.
〔4〕阎岩，徐志凯，姜绍谆，等.抗HFRS病毒McAb1A8单链抗体基因的构建及表达产物的检测〔J〕.中华实验和临床病毒学杂志,1997；11(Suppl.)：138-40.
〔5〕姜泊，张亚历，周殿元.真核细胞总RNA的制备与分析:分子生物学常用实验方法〔M〕.北京：人民军医出版社,1996:58-59.
〔6〕 Sambrook J, Fritson EF, Maniatis T. Molecular Cloning〔M〕 . New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:16- 852.
, 百拇医药
〔7〕 Kabat EA, Wu TT, Perry HM, et al. Sequences of proteins of immunological interest〔M〕 . 5th ed.Washington DC: United States Department of Health and Human Services,1991:1000- 1500.
〔8〕 Schroff W, Foon KA, Beatty SM, et al. Human anti- murine immunoglobulin responses in patients receiving monoclonal antibody therapy〔J〕 . Cancer Res,1985;45:879- 885.
〔9〕 Marks JD, Tristem M, Karpas A, et al. Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immumoglobulin variable genes and design of family spceific oligonucleotide probes〔J〕 . Eur J Immumol,1991;21:985- 991.
〔10〕 Orlandi R, Gussow DH, Jones PT, et al. Cloning immunoglobulin variable domains gene for exprossion by the polymerase chain reaction〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA,1989;86:3833- 3867.
收稿日期：1999-04-26
修回日期：1999-08-18, http://www.100md.com
单位：王琳(第四军医大学1西京医院皮肤科2微生物学教研室，陕西西安710032)；刘玉峰(第四军医大学1西京医院皮肤科2微生物学教研室，陕西西安710032)；阎岩(第四军医大学1西京医院皮肤科2微生物学教研室，陕西西安710032)
关键词：角蛋白；单克隆抗体；基因克隆；序列分析
细胞与分子免疫学杂志000119
中图号：Q78 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0058-61
一些表皮过度增殖性皮肤病(银屑病和基底细胞癌等)[1，2]，常发生角蛋白组分的异常变化。本室以往的研究表明，抗角蛋白自身抗体(AKautoAb)及抗角蛋白的单克隆抗体(mAb)对这些疾病具有良好的疗效。但由于鼠源性mAb用于人体时能诱导人体产生抗鼠抗体(HAMA)[8]，且易引起过敏反应，因而限制了其临床应用，有必要对其进行人源化改造。为此，我们采用反转录PCR(RT-PCR)方法，从分泌抗角蛋白mAb的鼠源性杂交瘤细胞中，克隆了该mAb的轻、重链可变区基因，并做了序列分析，为进一步研制基因工程抗体奠定了基础。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 材料杂交瘤细胞株5G5由我科张亮硕士制备。其分泌的mAb为IgG2b，活性良好，可特异地结合于正常人表皮基底细胞层，识别相对分子质量(Mr)为50000和48000两条角蛋白带，对角蛋白反应的敏感性及特异性较高[3]。轻、重链可变区基因的克隆中所用的载体均是在pUC18的基础上构建[4]的，含有 Hind III， Pst I， Sal I， Xbal I， Nco I， Xho I， BstE II， Sal I和 EcoR I等酶切位点。反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、各种限制性核酸内切酶及核酸分子标记物，分别购自Progema,Clontech和Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 RNA的提取及反转录采用TRIzoL[5]试剂，从培养的杂交瘤细胞中提取细胞总RNA后，按反转录试剂盒要求合成cDNA第1链。
, 百拇医药
1.2.2 可变区基因的扩增及酶切位点的引入以反转录产物为模板，分别用下列A、B两对引物进行PCR扩增VH和VL基因。再以PCR产物为模板，分别用下列C，D两对引物对VH，VL基因进行第2次扩增引入克隆位点。PCR反应的条件：94℃60s，55℃60s和72℃60s，共35次循环。
1.2.3 DNA重组及序列测定将VH和VL基因按文献〔6〕的方法，分别重组入载体pUC181A8VHSfi及pUC18-1A8VHXho中，鉴定后用本校中心实验室的自动测序仪测序并进行计算机分析。
2 结果
2.1 RNA的提取和逆转录将干燥后的细胞总RNA溶于11μL水中，取1μL做10g/L琼脂糖凝胶电泳。电泳后出现3条带，28s和18s带较清晰，且28s带的亮度高于18s带，5s带较弱，说明RNA的质量较好(且降解少)，其含量约为0.1g/L。将其余的10μLRNA进行逆转录。
, 百拇医药
2.2 VH，VL基因的扩增和克隆以A，B引物扩增的产物，经20g/L琼脂糖凝胶电泳后观察，VH基因片段约为360bp(图1A)，VL基因片段约为320bp(图1B)，未见其它非特异性产物，与预计的结果相符。再以PCR产物为模板，在同样条件下换用引物C，D分别于VH和VL基因片段中引入克隆位点。经2g/L琼脂糖凝胶电泳后观察，VH和VL基因片段大小未变。VH基因经NcoI和BstEII酶切消化、回收、纯化后，与相应酶切位点进行双酶切并回收、纯化的载体pUC18-1A8VHSfi相连接；VL基因经NcoI和XhoI酶切消化、回收、纯化后，与相应酶切位点进行双酶切并回收、纯化的载体pUC18-1A8VHXho连接。分别用电穿孔法转化大肠杆菌JM109，随机挑取菌落提取质粒并酶切鉴定。鉴定时，VH基因用EcoRI和HindIII酶切；VL基因用XhoI和HindIII酶切。结果从VH基因中可切出约为480bp的插入片段(含载体及linker)；VL基因中可切出约为380bp(含部分载体)的插入片段(图2)。
, 百拇医药
图 1 小鼠mAbAK37VH,VL基因的扩增
A：a为Marker:PGEM7Zf(+)HaeIII;b为VH基因的扩增产物；B：a见A中的a；c为VL基因的扩增产物.
图 2 小鼠mAbAK37VL、VH基因的酶切鉴定
a：同图1B中的a；b:VH基因用EcoRI和HindIII双酶切结果;c：VL基因用XhoI和HindIII双酶切结果.
2.3 VH，VL基因的序列测定及分析将酶切鉴定正确的重组体进行计算机测序，并将所获结果与EMBL1997基因数据库中已发表的基因序列相比较，未发现有与所克隆的VH和VL基因序列相同的基因，表明两者均为新发现的基因序列。对照Kabat1991年抗体基因库，VH基因隶属于鼠Ig重链可变区第II(B)家族成员，全长351bp，为单一开放读框，可编码117个氨基酸(图3)；VL基因隶属于鼠Igк轻链第IV家族成员，全长306bp，亦为单一开放读框，可编码102个氨基酸(图4)。
, 百拇医药
图3mAbAK37VH基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
注：粗斜体代表引物的序列
图 4 mAb AK37VL基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
注：粗斜体代表引物的序列
VH和VL基因序列的两端均有所使用的PCR引物及正确的酶切位点，均有明确的4个FR区和3个CDR区，并有维持抗体可变区结构所必需的特征性半胱氨酸残基且位置正确[7]。表明所获VH和VL基因的序列符合鼠抗体可变区的特征，且同源性大于80%。
3 讨论
, 百拇医药
抗角蛋白自身抗体(AKautoAb)作为机体免疫调节网络的一部分，在免疫状态的稳定和衰老组织的清除等方面发挥着重要的作用。我科的系列基础研究表明，AKautoAb具有以下活性：抑制无血清培养的角朊细胞增殖，降低其代谢活性；可沉积于角蛋白暴露的部位，抑制表皮细胞的过度增殖，起保护作用；抑制IL-6，IL-8的生物学活性；抑制肿瘤细胞的增殖；对正常角朊细胞和肿瘤细胞的凋亡有一定的促进作用。在临床研究方面，含有AKautoAb的人血丙种球蛋白在银屑病等皮肤病的治疗中取得了良好的疗效，但由于血液制品中尚含有许多其它不利成分，使临床应用受到一定的限制。随后的研究表明，抗角蛋白mAb对角朊细胞的增殖也有抑制作用，与AKautoAb的作用相似。由于不同的皮肤病可出现不同的角蛋白组分的变化，故以应用mAb为好。但鉴于鼠源性mAb的诸多缺点，将其应用于临床前，必须进行人源化改造。
我们从分泌抗角蛋白mAbAK37的杂交瘤细胞5G5中提取总RNA，应用RT-PCR法扩增出抗体的VH和VL基因，并将其克隆进行了序列分析。我们认为成功与否的关键有：①杂交瘤细胞的培养和RNA的提取：杂交瘤细胞质量的好坏直接影响到RNA提取的质量，因此，我们选用了mAb产量高的杂交瘤细胞。提取RNA时，应避免RNA酶的污染，我们采用了TRIzoLReagentkit一步法提取细胞总RNA，省时、简便而且效果好，不失为一种提取RNA的好方法。②引物设计：扩增mAbVH和VL基因所用引物的设计，是成功地获得所需目的基因片段的另一关键因素。我们所用扩增VL基因的引物是根据参考文献[9]并与Kabat抗体库进行比较而设计的扩增人抗体Vк基因的引物，用于扩增鼠源性mAb的VL基因，也取得了满意的结果；扩增VH基因的引物为Orlandi等[10]设计,5′端使用含简并码的引物可最大限度地提高引物与模板的匹配，并可节约一定的费用。为引入酶切位点，我们所用引物C的序列中在NcoI位点的上游有较长的一段无关序列，在酶切过程中可自动被除去。并由于酶切位点的引入，使推导的VL氨基酸序列的两头共缺少了5个氨基酸，因此VL基因的序列应为321bp。我们已将VH基因克隆入含linker的载体pUC18-1A8VHSfi中，可很容易地构建单链抗体。
, 百拇医药
总之，对于一些角蛋白组分发生改变的皮肤病(如前面提到的银屑病、扁平苔藓和基底细胞癌等)，应用抗角蛋白抗体进行治疗很可能是一种有效、先进的方法。我科的系列研究发现，含有抗角蛋白自身抗体的丙种球蛋白对银屑病的治疗有较好的疗效。抗角蛋白mAb的制备为基础研究提供了有用的试剂。但为了使其更好地应用于临床，我们克隆了抗角蛋白mAbAK37的可变区基因并进行了序列分析，为进一步构建基因工程抗体打下了基础。
基金项目：国家1035课题资助,No96-901-01-38
作者简介：王琳，女，33岁，主治医师，硕士
西安市长乐西路15号.Tel.(029)3373382
参考文献：
〔1〕 Thewes M, Stadler R, Korge B, et al. Normal psoriatic epidermis expression of hyperproliferation associated keratins〔J〕 . Arch Dermatol Res,1991;283:465- 471.
, http://www.100md.com
〔2〕 Markey AC, Lane EB, Macdonald DM, et al. Keratin expression in basal cell carcinomas〔J〕 . Br J Dermatol,1992;126:154- 160.
〔3〕张亮、刘玉峰、刘彦仿，等.分泌抗人角蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及鉴定〔J〕.细胞与分子免疫学杂志,1998；14(4)：292-293.
〔4〕阎岩，徐志凯，姜绍谆，等.抗HFRS病毒McAb1A8单链抗体基因的构建及表达产物的检测〔J〕.中华实验和临床病毒学杂志,1997；11(Suppl.)：138-40.
〔5〕姜泊，张亚历，周殿元.真核细胞总RNA的制备与分析:分子生物学常用实验方法〔M〕.北京：人民军医出版社,1996:58-59.
〔6〕 Sambrook J, Fritson EF, Maniatis T. Molecular Cloning〔M〕 . New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989:16- 852.
, 百拇医药
〔7〕 Kabat EA, Wu TT, Perry HM, et al. Sequences of proteins of immunological interest〔M〕 . 5th ed.Washington DC: United States Department of Health and Human Services,1991:1000- 1500.
〔8〕 Schroff W, Foon KA, Beatty SM, et al. Human anti- murine immunoglobulin responses in patients receiving monoclonal antibody therapy〔J〕 . Cancer Res,1985;45:879- 885.
〔9〕 Marks JD, Tristem M, Karpas A, et al. Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immumoglobulin variable genes and design of family spceific oligonucleotide probes〔J〕 . Eur J Immumol,1991;21:985- 991.
〔10〕 Orlandi R, Gussow DH, Jones PT, et al. Cloning immunoglobulin variable domains gene for exprossion by the polymerase chain reaction〔J〕 . Proc Natl Acad Sci USA,1989;86:3833- 3867.
收稿日期：1999-04-26
修回日期：1999-08-18, http://www.100md.com