Parasight-F法检测滤纸干血滴恶性疟原虫
作者：杨亚明 刘惠 李春富 张国森
单位：杨亚明(云南省疟疾防治研究所，思茅 665000)；刘惠(云南省疟疾防治研究所，思茅 665000)；李春富(云南省疟疾防治研究所，思茅 665000)；张国森(云南省疟疾防治研究所，思茅 665000)
关键词：
实用寄生虫病杂志000110 中图分类号：R392-33；R382.3+1 文献标识码：B
文章编号：1005-2534(2000)01-0027-01
疟疾滤纸干血滴检查法是以检测干血滴中抗体、抗原或DNA等特异成份而评估流行态势。
Parasight-F法是以检测红细胞中恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ(HRP-Ⅱ)来诊断恶性疟。有报道该法能从恶性疟患者尿中检出富组氨酸蛋白Ⅱ，来诊断疟原虫阳性。但尚未见Parasight-F法从滤纸干血滴中快速检出恶性疟的报道。因此，我们根据滤纸干血滴能保持疟原虫抗原成分活性和Parasight-F法诊断恶性疟的原理，用Parasight-F法快速简便地检测滤纸干血滴中恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ，从而判定疟疾感染，以期扩展该法应用，为疟疾流行病学调查提供适用的方法。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 Parasight-F试剂盒
美国Becton Dickinson公司产品，批号0442046-0。
1.2 样本收集
勐腊县医院门诊镜检确诊的恶性疟病人，常规涂制滤纸(新华定性滤纸)干血滴一式三份(血滴直径1.2cm，约含20μl血)，干燥保存，带回统一测试。同时涂制厚薄血膜以备复查，计算红细胞原虫感染率。
1.3 PCR检测滤纸干血滴
1.3.1 PCR引物制备及试剂 根据Jason Wooden[1]推荐的引物MSA-2，5′-GAG TAT AAG GAG AAG TAT GG-3′，5′-GCA TAT TGT GAC CTT GTC CA-3′。委托北京赛百盛(美国)生物工程公司合成。所有PCR反应试剂购自上海复华实业股份有限公司生物技术中心。
, 百拇医药
1.3.2 滤纸干血滴的处理 参照张龙兴[2]等方法进行，简述如下：剪碎一份滤纸干血滴置微量离心管中，加入1mol/L冰PBS液，轻摇，溶解10min，室温下12 000g离心2min，去上清，加入100℃预热的5%Chelex-100悬液180μl，煮沸10min，再离心一次，取上清保存于4℃冰箱，直接用于PCR扩增。
1.3.3 PCR扩增 将上述提取的DNA作为模板加10μl于40μlPCR反应混合物(10mmol/L Tris-HCl pH8.3,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2，0.01% gelatin)，dNTPS各0.2mmol/L,引物终浓度各0.1μmol/L)中，置于基因扩增仪上(美国PE公司产)，按下列条件进行：首先94℃ 5min预变性后，加入1μl TagDNA聚合酶(1U)；而后94℃ 30See,55℃ 1min，72℃ 1min循环35次，最后72℃温育10min。
, 百拇医药
1.3.4 扩增产物分析 取PCR扩增液10μl于1%琼酯糖凝胶(含溴乙锭)上电泳(55V，1h)，在ZF-3型紫外透射仪(上海产)上观察扩增条带。
1.4 Parasight-F法检测滤纸干血滴方法
参照试剂盒说明，略有改进。剪碎滤纸血滴，置于凹反应板内，加1号反应液1～2滴，浸泡滤纸血约3min，其间轻振助溶；之后放Parasight试纸条于浸出液中，让其液体浸湿整个反应区段，再加入2号反应液1滴，待反应控制线出现时，再滴入3号液2滴。若控制线清晰可辨，则按说明判定结果，否则重试。
2 结果
41份滤纸干血滴都经血涂片镜检确诊为恶性疟原虫感染者，其红细胞原虫感染率3～1 510/万。病人年龄9～48岁，均有症状。
Parasight-F法检测41份，36份阳性，其检出率87.8%，其中4份呈弱阳性。同时与PCR法配对检测39份，31份显示480～510bp的预期带条(多态分析另文报道)，判定为阳性，其检出率79.5%，两法均呈阴性的有3份，PCR阴性而Parasight-F法阳性的有7份，反之仅1份。另有4份Parasight-F法呈弱阳性者，但PCR仅出现2份阳性。
, 百拇医药
3 讨论
Parasight-F法是以检测血液中恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ(HRPⅡ)为基础，直接快速诊断恶性疟的一种方法，采用本法检测滤纸干血滴中的恶性疟原虫技术，尚未见有文献报道。该法与PCR检测滤纸干血滴法相比较，效果较好，操作简便，无需特殊设备及辅助器材，7～10min可得到诊断结果。这将有利于散在性的恶性疟点状暴发流行病学的快速调查。暴发流行点通常是些交通落后，各种医疗条件差的边远山区，所以该法的快速、简便调查，对迅速控制暴发流行有其重要的作用。
基金项目：WHO西太区资助(ID.NO.MAL/CHN/96/02)
参考文献
1，Jason Wooden, et al. Plasmodium falciparum: A simple polymerase chain reaction method for differentiating strains〔J〕. Exp Parasitol 1992;75∶207
2，张龙兴，詹斌，王聚君，等.滤纸干血滴抽提恶性疟原虫DNA用于PCR扩增〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1995；13(2)∶120, http://www.100md.com
单位：杨亚明(云南省疟疾防治研究所，思茅 665000)；刘惠(云南省疟疾防治研究所，思茅 665000)；李春富(云南省疟疾防治研究所，思茅 665000)；张国森(云南省疟疾防治研究所，思茅 665000)
关键词：
实用寄生虫病杂志000110 中图分类号：R392-33；R382.3+1 文献标识码：B
文章编号：1005-2534(2000)01-0027-01
疟疾滤纸干血滴检查法是以检测干血滴中抗体、抗原或DNA等特异成份而评估流行态势。
Parasight-F法是以检测红细胞中恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ(HRP-Ⅱ)来诊断恶性疟。有报道该法能从恶性疟患者尿中检出富组氨酸蛋白Ⅱ，来诊断疟原虫阳性。但尚未见Parasight-F法从滤纸干血滴中快速检出恶性疟的报道。因此，我们根据滤纸干血滴能保持疟原虫抗原成分活性和Parasight-F法诊断恶性疟的原理，用Parasight-F法快速简便地检测滤纸干血滴中恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ，从而判定疟疾感染，以期扩展该法应用，为疟疾流行病学调查提供适用的方法。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 Parasight-F试剂盒
美国Becton Dickinson公司产品，批号0442046-0。
1.2 样本收集
勐腊县医院门诊镜检确诊的恶性疟病人，常规涂制滤纸(新华定性滤纸)干血滴一式三份(血滴直径1.2cm，约含20μl血)，干燥保存，带回统一测试。同时涂制厚薄血膜以备复查，计算红细胞原虫感染率。
1.3 PCR检测滤纸干血滴
1.3.1 PCR引物制备及试剂 根据Jason Wooden[1]推荐的引物MSA-2，5′-GAG TAT AAG GAG AAG TAT GG-3′，5′-GCA TAT TGT GAC CTT GTC CA-3′。委托北京赛百盛(美国)生物工程公司合成。所有PCR反应试剂购自上海复华实业股份有限公司生物技术中心。
, 百拇医药
1.3.2 滤纸干血滴的处理 参照张龙兴[2]等方法进行，简述如下：剪碎一份滤纸干血滴置微量离心管中，加入1mol/L冰PBS液，轻摇，溶解10min，室温下12 000g离心2min，去上清，加入100℃预热的5%Chelex-100悬液180μl，煮沸10min，再离心一次，取上清保存于4℃冰箱，直接用于PCR扩增。
1.3.3 PCR扩增 将上述提取的DNA作为模板加10μl于40μlPCR反应混合物(10mmol/L Tris-HCl pH8.3,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl2，0.01% gelatin)，dNTPS各0.2mmol/L,引物终浓度各0.1μmol/L)中，置于基因扩增仪上(美国PE公司产)，按下列条件进行：首先94℃ 5min预变性后，加入1μl TagDNA聚合酶(1U)；而后94℃ 30See,55℃ 1min，72℃ 1min循环35次，最后72℃温育10min。
, 百拇医药
1.3.4 扩增产物分析 取PCR扩增液10μl于1%琼酯糖凝胶(含溴乙锭)上电泳(55V，1h)，在ZF-3型紫外透射仪(上海产)上观察扩增条带。
1.4 Parasight-F法检测滤纸干血滴方法
参照试剂盒说明，略有改进。剪碎滤纸血滴，置于凹反应板内，加1号反应液1～2滴，浸泡滤纸血约3min，其间轻振助溶；之后放Parasight试纸条于浸出液中，让其液体浸湿整个反应区段，再加入2号反应液1滴，待反应控制线出现时，再滴入3号液2滴。若控制线清晰可辨，则按说明判定结果，否则重试。
2 结果
41份滤纸干血滴都经血涂片镜检确诊为恶性疟原虫感染者，其红细胞原虫感染率3～1 510/万。病人年龄9～48岁，均有症状。
Parasight-F法检测41份，36份阳性，其检出率87.8%，其中4份呈弱阳性。同时与PCR法配对检测39份，31份显示480～510bp的预期带条(多态分析另文报道)，判定为阳性，其检出率79.5%，两法均呈阴性的有3份，PCR阴性而Parasight-F法阳性的有7份，反之仅1份。另有4份Parasight-F法呈弱阳性者，但PCR仅出现2份阳性。
, 百拇医药
3 讨论
Parasight-F法是以检测血液中恶性疟原虫富组氨酸蛋白Ⅱ(HRPⅡ)为基础，直接快速诊断恶性疟的一种方法，采用本法检测滤纸干血滴中的恶性疟原虫技术，尚未见有文献报道。该法与PCR检测滤纸干血滴法相比较，效果较好，操作简便，无需特殊设备及辅助器材，7～10min可得到诊断结果。这将有利于散在性的恶性疟点状暴发流行病学的快速调查。暴发流行点通常是些交通落后，各种医疗条件差的边远山区，所以该法的快速、简便调查，对迅速控制暴发流行有其重要的作用。
基金项目：WHO西太区资助(ID.NO.MAL/CHN/96/02)
参考文献
1，Jason Wooden, et al. Plasmodium falciparum: A simple polymerase chain reaction method for differentiating strains〔J〕. Exp Parasitol 1992;75∶207
2，张龙兴，詹斌，王聚君，等.滤纸干血滴抽提恶性疟原虫DNA用于PCR扩增〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1995；13(2)∶120, http://www.100md.com