肾移植供受者DR4-DRB1等位基因的分型
作者：曹建平 李萍 刘亚革 蒲菲菲 孟露露 安天义
单位：曹建平(沈阳军区总医院医学实验科，辽宁沈阳110015)；李萍(中国医科大学第一临床学院 中国医科大学第一临床学院)；刘亚革(沈阳军区总医院医学实验科，辽宁沈阳110015)；蒲菲菲(沈阳军区总医院医学实验科，辽宁沈阳110015)；孟露露(沈阳军区总医院医学实验科，辽宁沈阳110015)；安天义(沈阳军区总医院医学实验科，辽宁沈阳110015)
关键词：PCR-RFLP；DR4-DRB1等位基因；HLA-DRB1基因分型
细胞与分子免疫学杂志000118
摘要:目的研究HLADRB1等位基因的分型配合，因为相配的肾移植，其急性排斥反应的发生率明显降低，移植肾的存活时间明显延长。方法我们合成了一对DR4特异性引物，对DR4阳性的肾移植供受者的DNA样品进行PCR扩增后，将PCR产物分别用限制性核酸内切酶SacII,AvaII，HinfI,HaeII，HphI和MnlI进行酶切。结果根据酶切结果及RFLP图型，可将DR4进一步分为DR4DRB10401～0411。结论本方法快速、简便、精确，可为肾移植中DR4阳性供受者HLADRB1等位基因的配型提供可靠的方法。
, 百拇医药
中图号：R392.2 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0054-57
DR4-DRB1 allele typing in donors and recipients of kidney transplantation
CAO Jian-ping LIU Ya-ge PU Fei-fei MONG Lu-lu AN Tian-yi
(Department of Experimental Medicine, Chinese PLA General Hospital of Shenyang Military Command Area, Shenyang 110015, Liaoning Province, China )
, 百拇医药
LI Ping
(Clinical College of Chinese Medical University )
Abstract:Aim To study HLA-DRB1 alleles in renal allograft which are most important in match-typing. Methods A pair of primers specific for DR4 were synthesized and DR4 positive DNA samples from donors and recipients of renal allografts were amplified by PCR with the primers. Then, amplified PCR products were digested with restriction endonucleases Sac II,Ava II, Hinf I, Hac II, Hph I and Mnl I, respectively. Results In accocding to the cleaved rusults and RFLP patterns, DR4 alleles can be subdivided into eleven alleles(DR4- DRB1 0401～ DR4-DRB1 0411). Conclusion This method is rapid, simple and accurate and is useful for matching type of HLA-DRB1 alleles of DR4 positive donor and recipient in renal allograft.
, 百拇医药
Keywords:PCR-RFLP;DRB1 alleles;HLA-DRB1 genotyping
移植排斥反应是影响移植肾存活的主要因素之一。许多研究表明，肾移植供受者HLA-DR位点的相配，对于移植肾的长期存活有重要意义〔1-4〕。Kobayashi等〔5，6〕的研究显示，肾移植供受者HLA-DRB1位点完全相配时，移植肾五年存活率为97%～100%；而供受者HLA-DRB1位点有1点或2点失配，则移植肾五年存活率为63%～76%。因此，肾移植供受者HLA-DRB1位点的相配，对于降低急性排斥反应的发生率和延长移植肾的存活时间具有重要的意义。为探索一种简便、快速、准确的HLADRB1分型方法，我们合成了一对DR4特异性引物，应用PCR-RFLP技术，对40名DR4阳性的肾移植供受者进行了DR4DRB1等位基因的分型。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 材料 391DNA合成仪为美国ABS公司产品；9600热循环仪，为美国PE公司产品。电泳仪、紫外透射仪、台式高速离心机及恒温水浴箱均为国产。DNA合成及纯化试剂，均为美国ABS公司产品；Taq DNA聚合酶，为上海复华公司产品；dNTP，PBR322 Hae III Marker，均购于华美北京分公司；限制性内切酶Sac II，Hph I，Mnl I(Biolads公司)，Ava II，Hae II(Gibco公司)和Hinf I(Promega公司)。DR1DR10分型PCR试剂盒及标准DR1DR10阳性DNA，购于中国医学科学院基础医学研究所。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取及分型 抽取肾移植供受者静脉血3 mL，加20 g/L EDTA抗凝，用淋巴细胞分离液离心法分离外周血单个核细胞。生理盐水洗细胞1次。按文献〔7〕的方法提取DNA。应用DR1-DR10分型试剂盒，对我院1995-03/1997-03的肾移植供受者进行了DR1-DR10的初步分型。分型方法按产品说明书进行。对DR4阳性的供受者，再对其DNA样品进一步做DR4DRB1分型。
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1.2.2 引物的合成及纯化 根据第十届国际HLA工作会议推荐的引物序列，合成了两条引物。5′端引物的序列为：GTT TCT TGG AGC AGG TTA AAC；3′端引物的序列为：CCG CTG CAC TGT GAA GCT CT。引物的合成方法按产品说明书进行。这对引物可选择性地扩增DR4DRB1区的第2个外显子。
1.2.3 PCR反应体系及扩增产物的鉴定 DR4阳性DNA 50～100 ng，Taq DNA聚合酶0.5 U，5′端和3′端引物各250 nmol，dNTP各200 μmol/L，10×buffer 2.5 μL〔25 mmol/L TrisHCL pH8.2，2.0 mmol/L MgCl，25 mmol/L NH4SO2，100 mg/L明胶，50 g/L甲酰胺〕，总体积25 μL。于94℃ 2 min预变性后，循环温度为：94℃ 30s，66℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环，最后于72℃延伸3 min。取PCR扩增产物5 μL做20 g/L琼脂糖凝胶电泳。取DR4阳性的PCR扩增产物7 μL，加限制性内切酶1～2 U，10×buffer 1.5 μL，总体积15 μL。于37℃水浴3 h后，用Sac II，Ava II, Hae II和Hinf I 消化PCR扩增产物，并做20 g/L琼脂糖凝胶电泳。同时用Hph I和Mnl I消化PCR产物并120 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳毕，用EB染色凝胶，于紫外透射仪上观察结果并照相。
, 百拇医药
2 结 果
2.1 DR4阳性肾移植供受者的筛选 用分型试剂盒，对我院1995-03/199703的供受者进行了分型，用PCR法筛选出DR4阳性受者34例，供者6例。对DR4阳性的DNA再进一步做DR4-DRB1分型。
2.2 DR4-DRB1片段的扩增 用PCR扩增DR4- DRB1区第2外显子片段的结果见图1，扩增片段为263 bp。应用我们合成的引物扩增，经DR1-DR10分型试剂盒筛选出的DR4阳性DNA结果均为阳性，而非DR4阳性的DNA均呈阴性。
图1 DR4DRB 1区第2外显子片段的PCR扩增
Fig 1 Amplification of second exon of DR4DRB1 fragment
, 百拇医药
by PCR
1:Renal transplantation patient; 2:Standard DR4+DNA.
2.3 PCR产物的鉴定 将DR4阳性的PCR扩增产物，分别用Sac II，Ava II, Hinf I, Hae II，Hph I和 Mnl I进行酶切(图2～4)。DR4阳性的PCR扩增产物，根据6种限制性内切酶裂解和RFLP图形，可被进一步分为DR4-DRB10401～DR4-DRB10411共11种亚型。6种酶对各种DR4-DRB1等位基因的酶切结果和RFLP见表1。
图 2 DR4-DRB1 基因 PCR 扩增产物的酶切图谱
Fig 2 Cleavage patterns of polymorphic restriction fragments in PCR amplified DR4-DRB1 gene digested with restriction endonucleases
, 百拇医药
a.SacII 1:Cleavage,2:No cleavage;b.AvaII1,2:Cleavage;c.HinfI1:Cleavage,2:No cleavege;d.HaeII1:Nocleavage,2:Cleavege.
图3 DR4-DRB1基因PCR产物Hph I酶切的RFLP图谱
Fig 3 RFLP pattern of PCR products of DR4-DRB1 gene di
gested with Hph I
1,2:109bp fragment; 3,4:120bp fragment.
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图4 DR4DRB1基因PCR产物Mnl I酶切的RFLP图谱
Fig 4 RFLP pattern of PCR products of DR4DRB1 gene di
gested with Mnl I
1-3:107bp fragment;4,5:113bp fragment.
表1 各种DR4DRB1等位基因的酶切结果和RFLP
Tab 1 Cleavage products and RFLP patterns of DR4DRB1
alleles obtained by six restriction endonucleases
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Group
DR4-DRB1
alleles
Restriction site
Hph I(bp) Mnl I(bp)
SacII
AvaII
HinfI
HaeII
120
109
113
, 百拇医药
107
A
0401
1
1
0
0
-
+
+
-
0404
1
1
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0
0
+
-
-
+
0408
1
1
0
0
-
+
-
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+
B
0402
1
0
0
0
C
0403
0
1
0
0
+
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-
0407
0
1
0
0
-
+
D
0405
1
1
0
1
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-
+
-
+
0409
1
1
0
1
-
+
+
-
0410
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1
1
0
1
+
-
-
+
E
0406
0
1
1
0
, 百拇医药
F
0411
0
1
0
1
“0”：No cleavage;“1”:Cleavage;“+”:Positive,“-”:Negative.
DR4-DRB1 alleles of each DR4 positive fragments can be checked up from the Tab 1 according to the cleavage results of the six restriction endonucleases.
, 百拇医药 3 讨 论
HLA-DR位点在肾移植中的作用比HLA-A，B位点更重要，这已被许多临床及实验室研究所证实。但是，HLA-DR基因由DRA和DRB两个亚基因组成，而DRB又分为DRB1～DRB5 5个亚区，其中以DRB1位点的多态性最强。研究表明，DRB1位点完全相配合的肾移植，急性排斥反应的发生率明显低于DRB1位点不相配合者，且移植肾存活时间明显延长。由于不同的DRB1等位基因只有几个核苷酸的差异，用一般的PCR-SSP方法不能将其分开。Ota等〔8〕根据不同的DR4-DRB1等位基因在其核苷酸序列中某些位置的核苷酸不同，通过计算机分析，筛选出6种限制性内切酶。进行PCRRFLP后，可清晰地将11种DR4- DRB1等位基因分开。我们的实验证实了这一设计是可行的。我们在Ota等报道的方法的基础上做了改进，首先将PCR扩增的3温度循环时间从1 min改为30 s，使扩增时间缩短了1 h，而实验结果同样很理想。Ota等所用的复性温度是60℃，我们在实验中发现，复性温度为60℃时非特异性扩增带较多，若将复性温度升至66℃时非特异性扩增带消失，而263 bp条带依然存在。这种差异的原因，可能与我们所用的Taq DNA聚合酶、缓冲液，以及引物的合成及纯化方法与Ota等的报道不同有关。在电泳方面，Ota等对所有酶切产物都做120 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，而我们在实验中发现，Sac II，Ava II，Hinf I和Hae II酶切产物做20 g/L琼脂糖凝胶电泳，即可得到清晰可辩的图形，并可在1 h内完成；而PAGE则需要5～6 h。Hph I和Mnl I 酶切产物必须做120 g/L PAGE，因为这两种酶的RFLP相差6～11 bp，琼脂糖凝胶电泳不能分辩。经过改进后，全部实验可在24 h内完成，因此，该方法具有简单、快速、精确、重复性好和结果可靠等优点。
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JuLY等〔9〕报道了用PCR-RFLP法，对DR4- DRB1等位基因的分型研究。该研究使用了5种限制性内切酶区分DR4-DRB1-0401～DR4-DRB1-0408，其分型原理与本研究相同，而我们的研究尚能区分DR4DRB1-0401～DR4 DRB10411。国内有报道，采用PCRRFLP对HLA-DRB1基因位点多态性进行了分析〔10〕，但该研究没有对DR4进一步分型，对其它位点的分型也不太精细。郭实士等〔11〕应用PCR/SSO法，对HLADR亚区进行了分型，该法准确、灵敏度高、特异性强，但需要严格的杂交和洗涤条件，以保证反应的特异性。另外，需合成许多探针，操作也较繁琐困难。
本方法的建立对于进一步研究HLADRB1位点在延长移植肾的存活时间及降低移植排斥反应的发生率中的作用，以及HLA-DRB1分型在肾移植配型中的应用都具有重要的意义。
作者简介：曹建平，男，42岁，主治医师，硕士
, 百拇医药
沈阳市沈河区文化路83号，Tel.02423051426军线：0301514226
参考文献：
〔1〕 Opelz G, Mytilineos J, Scherer S, et al. Analysis of HLA-DR matching in DNA-typed cadaver kidney transplants 〔J〕 . Transplant,1993;55(4):782- 785.
〔2〕 Mytilineos J, Scherer S, Dunckley N, et al. DNA HLA-DR typing results of 4000 kidney transplants〔J〕 .Transplant,1993;55(4):778- 781.
〔3〕 Papda F, Canossi A, Valeri M, et al. Genotyping analysis of HLA class II genes in donor-recipient kidney transplant pairs〔J〕 . Transplant Proc,1993; 25(6):3267- 3270.
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〔4〕 Bryan CF, Harrell K, Aeder, MI, et al.Impact of HLA-DR typing by polymerase chain reaction amplification with DRβ 1 sequence-specific primers on cadaverie renal allocation〔J〕 . Transplant Proc, 1993;25(6):3060- 3063.
〔5〕 Kofgyashi T, Negita M, Yokoyama I,et al. Clinical value of HLA-DRB1, typing in cadaveric renal transplantation〔J〕 . Transplant Proc, 1993;25(6):3271- 3272.
〔6〕 Nojima M, Ichikawa Y, Ihara H, et al.Long-term success rate of HLA-DRB1, compatible kidney transplants〔J〕 . Transplant Proc,1993;25(6):3056- 3059.
, 百拇医药
〔7〕萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南〔M〕.第2版.北京：科学出版社，1992；464-467.
〔8〕 Ota M, SekiT, Fukushima H, et al. HLA-DRB1 genotying by modified PCR-RFLP method combined with group-specific primers〔J〕 . Tissue Antigens,1992;39:187- 202.
〔9〕 Ju LY J, Xue-fan G, Rafika B, et al. A Simple nonradioactive method of DNA typing for subsets of HLA-DR4; Prevalance data on HLA-DR4 subsets in three diabetic population groups〔J〕 . Hum Immunol, 1991; 31: 251- 258.
〔10〕黄啸宇，王亚新，王福庆，等.HLA-DRB1基因位点多态性的PCRRFLP分析〔J〕.生物化学杂志，1996；12(6)：674-680.
〔11〕郭实士，张修武.应用PCR/SSO方法对湖南籍汉族人HLADR亚区的DNA分型〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志，1993；13(1)：47-52.
收稿日期：1999-03-29
修回日期：1999-06-21, 百拇医药
单位：曹建平(沈阳军区总医院医学实验科，辽宁沈阳110015)；李萍(中国医科大学第一临床学院 中国医科大学第一临床学院)；刘亚革(沈阳军区总医院医学实验科，辽宁沈阳110015)；蒲菲菲(沈阳军区总医院医学实验科，辽宁沈阳110015)；孟露露(沈阳军区总医院医学实验科，辽宁沈阳110015)；安天义(沈阳军区总医院医学实验科，辽宁沈阳110015)
关键词：PCR-RFLP；DR4-DRB1等位基因；HLA-DRB1基因分型
细胞与分子免疫学杂志000118
摘要:目的研究HLADRB1等位基因的分型配合，因为相配的肾移植，其急性排斥反应的发生率明显降低，移植肾的存活时间明显延长。方法我们合成了一对DR4特异性引物，对DR4阳性的肾移植供受者的DNA样品进行PCR扩增后，将PCR产物分别用限制性核酸内切酶SacII,AvaII，HinfI,HaeII，HphI和MnlI进行酶切。结果根据酶切结果及RFLP图型，可将DR4进一步分为DR4DRB10401～0411。结论本方法快速、简便、精确，可为肾移植中DR4阳性供受者HLADRB1等位基因的配型提供可靠的方法。
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中图号：R392.2 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0054-57
DR4-DRB1 allele typing in donors and recipients of kidney transplantation
CAO Jian-ping LIU Ya-ge PU Fei-fei MONG Lu-lu AN Tian-yi
(Department of Experimental Medicine, Chinese PLA General Hospital of Shenyang Military Command Area, Shenyang 110015, Liaoning Province, China )
, 百拇医药
LI Ping
(Clinical College of Chinese Medical University )
Abstract:Aim To study HLA-DRB1 alleles in renal allograft which are most important in match-typing. Methods A pair of primers specific for DR4 were synthesized and DR4 positive DNA samples from donors and recipients of renal allografts were amplified by PCR with the primers. Then, amplified PCR products were digested with restriction endonucleases Sac II,Ava II, Hinf I, Hac II, Hph I and Mnl I, respectively. Results In accocding to the cleaved rusults and RFLP patterns, DR4 alleles can be subdivided into eleven alleles(DR4- DRB1 0401～ DR4-DRB1 0411). Conclusion This method is rapid, simple and accurate and is useful for matching type of HLA-DRB1 alleles of DR4 positive donor and recipient in renal allograft.
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Keywords:PCR-RFLP;DRB1 alleles;HLA-DRB1 genotyping
移植排斥反应是影响移植肾存活的主要因素之一。许多研究表明，肾移植供受者HLA-DR位点的相配，对于移植肾的长期存活有重要意义〔1-4〕。Kobayashi等〔5，6〕的研究显示，肾移植供受者HLA-DRB1位点完全相配时，移植肾五年存活率为97%～100%；而供受者HLA-DRB1位点有1点或2点失配，则移植肾五年存活率为63%～76%。因此，肾移植供受者HLA-DRB1位点的相配，对于降低急性排斥反应的发生率和延长移植肾的存活时间具有重要的意义。为探索一种简便、快速、准确的HLADRB1分型方法，我们合成了一对DR4特异性引物，应用PCR-RFLP技术，对40名DR4阳性的肾移植供受者进行了DR4DRB1等位基因的分型。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 材料 391DNA合成仪为美国ABS公司产品；9600热循环仪，为美国PE公司产品。电泳仪、紫外透射仪、台式高速离心机及恒温水浴箱均为国产。DNA合成及纯化试剂，均为美国ABS公司产品；Taq DNA聚合酶，为上海复华公司产品；dNTP，PBR322 Hae III Marker，均购于华美北京分公司；限制性内切酶Sac II，Hph I，Mnl I(Biolads公司)，Ava II，Hae II(Gibco公司)和Hinf I(Promega公司)。DR1DR10分型PCR试剂盒及标准DR1DR10阳性DNA，购于中国医学科学院基础医学研究所。
1.2 方法
1.2.1 DNA提取及分型 抽取肾移植供受者静脉血3 mL，加20 g/L EDTA抗凝，用淋巴细胞分离液离心法分离外周血单个核细胞。生理盐水洗细胞1次。按文献〔7〕的方法提取DNA。应用DR1-DR10分型试剂盒，对我院1995-03/1997-03的肾移植供受者进行了DR1-DR10的初步分型。分型方法按产品说明书进行。对DR4阳性的供受者，再对其DNA样品进一步做DR4DRB1分型。
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1.2.2 引物的合成及纯化 根据第十届国际HLA工作会议推荐的引物序列，合成了两条引物。5′端引物的序列为：GTT TCT TGG AGC AGG TTA AAC；3′端引物的序列为：CCG CTG CAC TGT GAA GCT CT。引物的合成方法按产品说明书进行。这对引物可选择性地扩增DR4DRB1区的第2个外显子。
1.2.3 PCR反应体系及扩增产物的鉴定 DR4阳性DNA 50～100 ng，Taq DNA聚合酶0.5 U，5′端和3′端引物各250 nmol，dNTP各200 μmol/L，10×buffer 2.5 μL〔25 mmol/L TrisHCL pH8.2，2.0 mmol/L MgCl，25 mmol/L NH4SO2，100 mg/L明胶，50 g/L甲酰胺〕，总体积25 μL。于94℃ 2 min预变性后，循环温度为：94℃ 30s，66℃ 30 s，72℃ 30 s，共30个循环，最后于72℃延伸3 min。取PCR扩增产物5 μL做20 g/L琼脂糖凝胶电泳。取DR4阳性的PCR扩增产物7 μL，加限制性内切酶1～2 U，10×buffer 1.5 μL，总体积15 μL。于37℃水浴3 h后，用Sac II，Ava II, Hae II和Hinf I 消化PCR扩增产物，并做20 g/L琼脂糖凝胶电泳。同时用Hph I和Mnl I消化PCR产物并120 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳。泳毕，用EB染色凝胶，于紫外透射仪上观察结果并照相。
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2 结 果
2.1 DR4阳性肾移植供受者的筛选 用分型试剂盒，对我院1995-03/199703的供受者进行了分型，用PCR法筛选出DR4阳性受者34例，供者6例。对DR4阳性的DNA再进一步做DR4-DRB1分型。
2.2 DR4-DRB1片段的扩增 用PCR扩增DR4- DRB1区第2外显子片段的结果见图1，扩增片段为263 bp。应用我们合成的引物扩增，经DR1-DR10分型试剂盒筛选出的DR4阳性DNA结果均为阳性，而非DR4阳性的DNA均呈阴性。
图1 DR4DRB 1区第2外显子片段的PCR扩增
Fig 1 Amplification of second exon of DR4DRB1 fragment
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by PCR
1:Renal transplantation patient; 2:Standard DR4+DNA.
2.3 PCR产物的鉴定 将DR4阳性的PCR扩增产物，分别用Sac II，Ava II, Hinf I, Hae II，Hph I和 Mnl I进行酶切(图2～4)。DR4阳性的PCR扩增产物，根据6种限制性内切酶裂解和RFLP图形，可被进一步分为DR4-DRB10401～DR4-DRB10411共11种亚型。6种酶对各种DR4-DRB1等位基因的酶切结果和RFLP见表1。
图 2 DR4-DRB1 基因 PCR 扩增产物的酶切图谱
Fig 2 Cleavage patterns of polymorphic restriction fragments in PCR amplified DR4-DRB1 gene digested with restriction endonucleases
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a.SacII 1:Cleavage,2:No cleavage;b.AvaII1,2:Cleavage;c.HinfI1:Cleavage,2:No cleavege;d.HaeII1:Nocleavage,2:Cleavege.
图3 DR4-DRB1基因PCR产物Hph I酶切的RFLP图谱
Fig 3 RFLP pattern of PCR products of DR4-DRB1 gene di
gested with Hph I
1,2:109bp fragment; 3,4:120bp fragment.
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图4 DR4DRB1基因PCR产物Mnl I酶切的RFLP图谱
Fig 4 RFLP pattern of PCR products of DR4DRB1 gene di
gested with Mnl I
1-3:107bp fragment;4,5:113bp fragment.
表1 各种DR4DRB1等位基因的酶切结果和RFLP
Tab 1 Cleavage products and RFLP patterns of DR4DRB1
alleles obtained by six restriction endonucleases
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Group
DR4-DRB1
alleles
Restriction site
Hph I(bp) Mnl I(bp)
SacII
AvaII
HinfI
HaeII
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107
A
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1
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0
0
-
+
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0404
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+
-
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+
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B
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C
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D
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-
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“0”：No cleavage;“1”:Cleavage;“+”:Positive,“-”:Negative.
DR4-DRB1 alleles of each DR4 positive fragments can be checked up from the Tab 1 according to the cleavage results of the six restriction endonucleases.
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HLA-DR位点在肾移植中的作用比HLA-A，B位点更重要，这已被许多临床及实验室研究所证实。但是，HLA-DR基因由DRA和DRB两个亚基因组成，而DRB又分为DRB1～DRB5 5个亚区，其中以DRB1位点的多态性最强。研究表明，DRB1位点完全相配合的肾移植，急性排斥反应的发生率明显低于DRB1位点不相配合者，且移植肾存活时间明显延长。由于不同的DRB1等位基因只有几个核苷酸的差异，用一般的PCR-SSP方法不能将其分开。Ota等〔8〕根据不同的DR4-DRB1等位基因在其核苷酸序列中某些位置的核苷酸不同，通过计算机分析，筛选出6种限制性内切酶。进行PCRRFLP后，可清晰地将11种DR4- DRB1等位基因分开。我们的实验证实了这一设计是可行的。我们在Ota等报道的方法的基础上做了改进，首先将PCR扩增的3温度循环时间从1 min改为30 s，使扩增时间缩短了1 h，而实验结果同样很理想。Ota等所用的复性温度是60℃，我们在实验中发现，复性温度为60℃时非特异性扩增带较多，若将复性温度升至66℃时非特异性扩增带消失，而263 bp条带依然存在。这种差异的原因，可能与我们所用的Taq DNA聚合酶、缓冲液，以及引物的合成及纯化方法与Ota等的报道不同有关。在电泳方面，Ota等对所有酶切产物都做120 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳，而我们在实验中发现，Sac II，Ava II，Hinf I和Hae II酶切产物做20 g/L琼脂糖凝胶电泳，即可得到清晰可辩的图形，并可在1 h内完成；而PAGE则需要5～6 h。Hph I和Mnl I 酶切产物必须做120 g/L PAGE，因为这两种酶的RFLP相差6～11 bp，琼脂糖凝胶电泳不能分辩。经过改进后，全部实验可在24 h内完成，因此，该方法具有简单、快速、精确、重复性好和结果可靠等优点。
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JuLY等〔9〕报道了用PCR-RFLP法，对DR4- DRB1等位基因的分型研究。该研究使用了5种限制性内切酶区分DR4-DRB1-0401～DR4-DRB1-0408，其分型原理与本研究相同，而我们的研究尚能区分DR4DRB1-0401～DR4 DRB10411。国内有报道，采用PCRRFLP对HLA-DRB1基因位点多态性进行了分析〔10〕，但该研究没有对DR4进一步分型，对其它位点的分型也不太精细。郭实士等〔11〕应用PCR/SSO法，对HLADR亚区进行了分型，该法准确、灵敏度高、特异性强，但需要严格的杂交和洗涤条件，以保证反应的特异性。另外，需合成许多探针，操作也较繁琐困难。
本方法的建立对于进一步研究HLADRB1位点在延长移植肾的存活时间及降低移植排斥反应的发生率中的作用，以及HLA-DRB1分型在肾移植配型中的应用都具有重要的意义。
作者简介：曹建平，男，42岁，主治医师，硕士
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收稿日期：1999-03-29
修回日期：1999-06-21, 百拇医药