人细胞色素 P450 2B6的GST融合蛋白及其抗体的制备
作者：林筱洁 罗建红 余应年
单位：林筱洁(浙江省中医院血液病研究室，浙江 杭州 310006)；罗建红 余应年(浙江医科大学病理生理学教研室，浙江 杭州 310031)
关键词：细胞色素p-450；重组融合蛋白质类；抗体
中国病理生理杂志000101
[摘 要] 目的：获得纯化抗原用于制备CYP2B6多克隆抗体。方法： PCR扩增目的基因片段，亚克隆入融合蛋白表达载体pGEX-3b，构建了重组质粒pGEX/2B6。然后将该重组质粒转化大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分离，获纯化融合蛋白GST-2B6。用GST-2B6免疫BALB/C小鼠，自腹水中获取CYP2B6多克隆抗体(2B6pAb)。结果：融合蛋白GST-2B6(CYP2B6 202～352 aa)，并获其特异的多克隆抗体。结论：通过构建融合蛋白重组表达质粒pGEX/2B6，用获得的初步纯化融合蛋白GST-2B6制备了特异的2B6pAb。
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[中图分类号] Q 754 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)01-0003-05
Expression of GST fusion proteins of human cytochrome P 2B6 and preparation of anti-cytochrome P2B6 polyclonal antibody
LIN Xiao-jie, LUO Jian-hong, YU Ying-nian
(Department of Pathophysiology, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310031, China)
[Abstract] AIM: To get large amounts of pure antigens to raise specific antibodies and to perform quantifications.METHODS: CYP2B6 (cytochrome P) cDNA fragments was ligated into BamHI restricted PGEX-3b to generate recombinants PGEX/2B6. We identified recombinants PGEX/2B6 by EcoRI digestion. The expression of fusion proteins were induced by adding isopropyl-thiogalactoside(IPTG). Several clones showed high-level expression of fusion proteins. Insoluble proteins was isolated from the bacteria and the fusion proteins was recovered and purified from a preparative (2mm) SDS-PAGE. The polyarcrylamide gel containing the fusion proteins glutathione S-transferase(GST-2B6) were used to immunize BALB/C mice from which polyclonal ascites fluid was prepared. The purified fusion proteins GST-1A1(GST fusion protein of CYP1A1 cDNA246～386aa expressed in this library ,purified by preparative SDS-PAGE), GST-2B6 were used to test the specificity of 2B6pAb. RESULTS:Fusion proteins constructed between GST and CYP2B6 was expressed in Escherichia coli DH5α. Mouse antibodies are raised against the fusion proteins GST-2B6. 2B6pAb was fond to be specific antibody.CONCLUSION:Recombinant PGEX/2B6 were constructed and purified fusion proteins GST-2B6, and specific 2B6pAb were obtained.
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[MeSH] Cytochrome P-450; Recombinant, fusion proteins; Antibodies
细胞色素P450(cytochrome P, CYP)是由100多个基因组成的超家族氧化还原酶系[1]。哺乳动物中有12个家族,22个亚家族和众多个体基因。CYP介导化学致癌物的代谢活化，这是始动化学致癌的至关重要的第一步。其中CYP1-4家族尤为重要。因而研究CYP1-4家族同功酶及其功能特征是一重要课题。
但CYP2B6在组织中的表达量很低(仅占肝CYP总量的2%)，又有种属、性别、年龄、组织和细胞分布差异，同一亚家族的酶类性质及结构相近，难以直接分离纯化CYP酶蛋白作研究。制备特异性的CYP2B6抗体则为研究CYP2B6表达和功能特征的另一有效手段。
用生化的方法直接从组织中分离纯化CYP酶蛋白往往繁琐而困难，且难以获得足够量的纯化CYP酶蛋白作为抗原。本研究拟体外表达CYP2B6基因片段，以获得足够量的纯化抗原，并制备CYP2B6特异性抗体。曾有人体外表达一组CYP2B6基因片段(长18～33aa)用于制备CYP2B6抗体，也证明了我们选用的包括特异肽段。国内外尚无市售的CYP2B6抗体。
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材 料 和 方 法
一、表达菌株、克隆载体、模板DNA：
DH5α、融合蛋白表达性载体pGEX-3b、PEE-2B6。pGEX-3b ，4966bp，含氨苄青霉素抗性基因和GST的氨基末端基因，由pGEX-3X(Phamacia)改造而来[2]。PEE-2B6为本科室自行构建，为CYP2B6 cDNA(1468bp，PCR产物)与pREP9载体的重组质粒,并命名为PEE-2B6[3]。
二、主要试剂：
工具酶(Gibco/BRL、Promega)，PCR引物(上海细胞所塞尔公司合成)，柱离心式胶回收试剂盒(上海华顺公司)；强化的化学发光检测系统(enhanced chemiluminescence detection system, ECL)自行配制，辣根过氧化物酶(HRP)交联的抗小鼠第二抗体购于华美生物公司。
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三、免疫对象和细胞株：
BALB/C小鼠( 8周，雌性)，小鼠骨髓瘤细胞株NS-1(上海细胞所)。
四、目的基因片段的获取及重组质粒pGEX/2B6的构建：
(1)PCR引物设计策略：据Genbank检索分析选择表达CYP2B6 202～352aa这一特异肽段。据对应的DNA序列(CYP2B6 cDNA 610～1060bp)，并考虑到其BamHI位点(带下划线序列)的阅读框架GAT(方框内序列)与克隆载体pGEX-3b相符而设计引物如下：
(2)PCR扩增反应：反应体系参照文献4。循环94℃变性1 min，65℃退火2 min，72℃聚合3 min。循环25次。
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(3)重组质粒pGEX/2B6的构建： 选用EcoRI酶切来鉴定目的基因片段的插入取向。DNA制备采用碱裂解法。用柱离心式胶回收试剂盒回收纯化目的DNA。酶切、载体DNA的去磷酸化、连接反应、感受态细胞的制备及转化均按常规方法进行[4]。
五、GST-2B6的诱导表达及切胶纯化：
(1)重组质粒pGEX/2B6的诱导表达：将重组质粒pGEX/2B6转化入表达菌株DH5α，过夜菌1：50稀释入新鲜培养基，培养至0D600～0.75,加1 mmol/L IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷酶)诱导表达(37℃，300 r/min剧烈振摇)。分别于诱导表达前、诱导表达后1 h、2 h、3 h、4 h取样，进行0.1%SDS-10%PAGE[5](200V 45min) ，经0.25%考马斯亮兰染色，观察结果。
(2) GST-2B6的切胶纯化：收集诱导表达细菌，加入原体积的缓冲液，反复超声粉碎，离心并定量转移上清至另一管，即为上清样品(S)；用同量的缓冲液悬浮沉淀样品，即为沉淀样品(I)。上述缓冲液均为含1% Triton X-100的MTPBS[150 mmol/L NaCl,16 mmol/L Na2HPO4, 4 mmol/L NaH2PO4(pH 7.3)][ 6]。切胶纯化程序如下：先将溶于加样缓冲液中并煮沸变性的诱导表达细菌经制备型(2 mm)0.1%SDS-10%PAGE分离， 0.3 mol/L CuCl2溶液显色，切取含GST-2B6的PAGE胶块。用脱色液[0.25mol/L EDTA(pH 8.0)，0.25 mol/L Tris-HCl(pH 9.0)]脱色， MTPBS平衡过夜、冷冻干燥，碾磨成胶粉[7]，取适量胶粉即为纯化样品(P)。上述样品经0.%SDS-10%PAGE分离及考马斯亮兰染色，观察结果。
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六、多克隆抗体的制备和初步鉴定：
(1) 多克隆抗体的制备：称取含相应量GST/2B6的胶粉重悬于生理盐水中，直接用于免疫小鼠[8]。以生理盐水作为对照。在加强注射后腹腔注射NS-1细胞以促进腹水生成。收集腹水，获取多克隆抗体2B6pAb。免疫程序如下:
第1、14、28 d腹腔注射50 μg抗原/每只小鼠；第3、17 d腹腔注射0.3 mL弗氏不完全佐剂/每只小鼠； 第31 d腹腔注射NS-1细胞 5×105细胞/每只小鼠； 第42～45 d收集腹水。
(2)用融合蛋白免疫印迹反应初步鉴定2B6pAb的特异性[9]：
①纯化的融合蛋白GST-1A1(本实验室自行制备，为CYP1A1蛋白246～386 aa与GST的融合蛋白，切胶纯化)、GST-2B6均用加样缓冲液重悬，煮沸3 min。高速离心后吸取上清作倍比稀释，使每孔的加样量分别为200、100、50和25 ng。
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②2B6pAb用经切胶纯化的GST-1A1融合蛋白交叉吸收过夜。同时对未经交叉吸收的2B6pAb进行实验。
③按常规方法进行GST-1A1、GST-2B6的0.1%SDS-10%PAGE[5]和电转膜[10]。
④用[含5%脱脂奶粉的TBST(20 mmol/LTris-HCl,140 mmol/L NaCl,0.1% Tween-20)]封闭硝酸纤维素膜上非特异位点。
⑤加2B6pAb (1∶50稀释入封闭液)室温反应2 h，TBST漂洗。
⑥加HRP标记抗小鼠第二抗体(1∶200稀释入封闭液)室温反应2h，TBST漂洗。
⑦最后加ECL溶液，使抗原抗体复合物条带曝光为X光底片相应位置上的条带，经显影、定影后，观察结果。
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结 果
一、目的基因片段的PCR扩增及重组质粒pGEX/2B6的构建：
10 μL PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离、EB染色，在约458bp处可见明亮的DNA条带，与设计产物大小相符，结果见图2(A)Lane 2。重组质粒pGEX/2B6经EcoRI酶切、2%琼脂糖凝胶电泳分离、EB染色，筛选出含226bp,5190bp两个片段的正向插入克隆，如图2(B)Lanes 4,11。也可见含258bp,5158bp两个片段的反向插入克隆，如图2(B) Lanes 2～3,5～10,12。
二、融合蛋白GST-2B6的诱导表达及纯化：
转化入重组质粒pGEX/2B6(正向插入)的DH52菌经IPTG诱导表达，可见诱导表达后在约43 kD处比诱导表达前多了一条深浓的蛋白条带，这与预期的GST-2B6分子量一致，见图3。菌体经超声裂解后，上清样品(S)经考马斯亮兰染色几乎不见融合蛋白，融合蛋白几乎均存在于沉淀样品(I)中，经切胶纯化样品(P)可见纯化的GST-2B6，见图3。
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三、多克隆抗体的初步鉴定：
未经交叉吸收处理，2B6pAb对融合蛋白GST-1A1和GST-2B6均反应，见图4(A)；经GST-1A1融合蛋白抗原交叉吸收后，2B6pAb对GST-2B6融合蛋白反应特异，见图4(B)。
讨 论
CYP在化学致癌物的代谢活化过程中起重要作用。CYP同功酶有广谱的、重叠的底物特异性，其组织学分布既有特异性又有重叠性。研究CYP对特定底物的代谢活化过程及CYP的组织学分布也是对化学致癌的深入研究。制备特异性的CYP抗体是进一步研究化学致癌的有效工具。这样的特异性抗体具有重要的应用价值，可用来检测CYP的组织学分布及其与化学致癌的器官特异性的关系；若用来检测不同人群的CYP的含量差异，则更可评估人群对环境因素的易感性及环境中的化合物的累积诱变活性。若能鉴定所获的抗体具免疫阻滞作用，则可直接监测CYP的代谢过程。
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Fig 1 Map of recombinant pGEX/2B6
图1 重组质粒pGEX/2B6 的图谱
Fig 2 Construction of recombinant pGEX/2B6. (A)PCR amplification of CYP2B6 cDNA fragment(1% agrose gel). Lane1: pGEM 7 zf(+)/HaeIII markers; Lane2: CYP2B6 cDNA 610～1060 bp; (B)Identification of recombinant pGEX/2B6(2% agrose gel). Right orientation of the insert are found in clones 4 and 11. Lane1: 1kb DNA Ladder; Lane 2～12: pGEX/2B6 digested with EcoRI
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图2 重组质粒pGEX/2B6 的构建
Fig 3 Expression and purification of the fusion proteins GST-2B6. (A)Time course of induced expression of GST/2B6.The number on the top indicate hour(s) after induction.(B)Purification of GST-2B6 from preparative SDS-PAGE.The letter indicated at the top were applied: bacterial extract of expression transformant before(B) induction and soluble(S) and insoluble(I) bacterial portion after induction,and purified(P) fusion proteins from insoluble bacterial extract
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图3 融合蛋白GST-2B6 的表达和纯化
Fig 4 Characterization of anti-CYP2B6 polyclonal antibodies on immunoblot with their cognate fusion proteins
For GST/1A1 Lane 1～4: 25,50,100,200ng of purified GST/1A1
For GST/2B6 Lane 1～4: 25,50,100,200ng of purified GST/2B6
Crude and purified anti-CYP2B6 polyclonal antibodies are at a dilution of 1:50
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图4 CYP2B6多克隆抗体的免疫印迹反应
我们选用融合蛋白表达性载体pGEX-3b作为克隆载体，构建重组质粒pGEX/2B6；诱导表达并纯化了融合蛋白 GST-2B6；制备了多克隆抗体2B6pAb。这融合蛋白技术有其优缺点。优点为表达水平高，比较稳定(可防止CYP2B6遭降解，且增强了其免疫原性)，易纯化(可针对GST进行纯化)。但同时也有容易形成包涵体的缺点，我们用切胶纯化的方法获得纯化抗原，克服了该缺点。我们采用PCR技术扩增目的基因片段，由于作为模板的真核表达质粒已导入哺乳细胞获得稳定表达，故省却了测序这一步骤。我们通过分析融合蛋白诱导表达的时相，优化了诱导表达条件，使融合蛋白的表达水平得到提高。
我们将切胶纯化的融合蛋白直接用于免疫小鼠。抗原所含的PAGE胶本身即是良好的免疫佐剂，这更有助于免疫的成功。按照文献6，选用了BALB/C小鼠作为免疫对象，并从腹水中收集多克隆抗体，节省了抗原的用量。
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我们采用融合蛋白的免疫印迹反应初步鉴定了2B6pAb的特异性。同时对未经交叉吸收的2B6pAb进行实验，是为了更好地检测2B6pAb对GST-1A1及GST-2B6的反应性。比较经融合蛋白交叉吸收前后的2B6pAb的免疫印迹反应，表明2B6pAb为特异性抗体。还需经转基因细胞、组织标本的免疫印迹进一步鉴定2B6pAb的特异性。
[基金项目]浙江省自然科学基金资助(N29801)
[参 考 文 献]
[1] Nelson DR,Kamataki T,Waxman DJ,et al.The P450 superfamily:update on new seqences,gene mapping,accession numbers,early trivial names and nomenclature[J].DNA Cell Biol,1993,12:1～51.
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[2] Wang, Y.,Bosy TZ,Yasuda RP,et al .Characterization of NMDA recepter subunit-specific antibodies: Distribution of NR2A and NR2B recepter subunits in rat brain and ontogenic profile in the cerebellum[J]. J Neurochem, 1995, 65:176～183.
[3] 吴健敏，董海涛，余应年等.CYP2B7 cDNA 的克隆、鉴定及真核细胞重组表达载体的构建[J].癌变.畸变.突变，1995,7:1～6.
[4] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular cloning. A laboratory manual[M]. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.
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[5] Laemmli UK, Favre M.Maturation of the head of bacteriophage T4,I DNA packaging events[J]. J Mol Biol,1973, 80:575～599.
[6] Smith D B, Johnson K S.Single-step purification of polypeptide expressed in Escheria coli as fusion with glutathione S-transferase[J]. Gene,1988, 67:31～40.
[7] Luo J, Wang Y, Yasuda RP, et al. The majority of N-Methyl-D-Aspartate receptor complexs in adut rat cerebral cortex contain at least three different subunits (NR1/NR2A/NR2B)[J]. Mol Pharmacol, 1997, 51:79～86.
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[8] Kurpisz M, Gupta SK, Fulghan DL, et al. Production of large amounts of mouse polyclonal antisera[J]. J Immurol Methods, 1988, 115:195～198.
[9] Luo J, Bosy TZ, Wang Y,et al .Oncotogeny of NMDA R1 subunit proteins expression in five regions of rat brain[J]. Dev Brain Res,1996.92:10～17.
[10] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications[J]. Pro Natl Acad Sci USA, 1979, 76:4350～4354.
[收稿日期]1998-11-23 [修回日期]1999-04-30, 百拇医药
单位：林筱洁(浙江省中医院血液病研究室，浙江 杭州 310006)；罗建红 余应年(浙江医科大学病理生理学教研室，浙江 杭州 310031)
关键词：细胞色素p-450；重组融合蛋白质类；抗体
中国病理生理杂志000101
[摘 要] 目的：获得纯化抗原用于制备CYP2B6多克隆抗体。方法： PCR扩增目的基因片段，亚克隆入融合蛋白表达载体pGEX-3b，构建了重组质粒pGEX/2B6。然后将该重组质粒转化大肠杆菌DH5α，IPTG诱导表达，SDS-PAGE分离，获纯化融合蛋白GST-2B6。用GST-2B6免疫BALB/C小鼠，自腹水中获取CYP2B6多克隆抗体(2B6pAb)。结果：融合蛋白GST-2B6(CYP2B6 202～352 aa)，并获其特异的多克隆抗体。结论：通过构建融合蛋白重组表达质粒pGEX/2B6，用获得的初步纯化融合蛋白GST-2B6制备了特异的2B6pAb。
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[中图分类号] Q 754 [文献标识码] A
[文章编号]1000-4718(2000)01-0003-05
Expression of GST fusion proteins of human cytochrome P 2B6 and preparation of anti-cytochrome P2B6 polyclonal antibody
LIN Xiao-jie, LUO Jian-hong, YU Ying-nian
(Department of Pathophysiology, Zhejiang Medical University, Hangzhou 310031, China)
[Abstract] AIM: To get large amounts of pure antigens to raise specific antibodies and to perform quantifications.METHODS: CYP2B6 (cytochrome P) cDNA fragments was ligated into BamHI restricted PGEX-3b to generate recombinants PGEX/2B6. We identified recombinants PGEX/2B6 by EcoRI digestion. The expression of fusion proteins were induced by adding isopropyl-thiogalactoside(IPTG). Several clones showed high-level expression of fusion proteins. Insoluble proteins was isolated from the bacteria and the fusion proteins was recovered and purified from a preparative (2mm) SDS-PAGE. The polyarcrylamide gel containing the fusion proteins glutathione S-transferase(GST-2B6) were used to immunize BALB/C mice from which polyclonal ascites fluid was prepared. The purified fusion proteins GST-1A1(GST fusion protein of CYP1A1 cDNA246～386aa expressed in this library ,purified by preparative SDS-PAGE), GST-2B6 were used to test the specificity of 2B6pAb. RESULTS:Fusion proteins constructed between GST and CYP2B6 was expressed in Escherichia coli DH5α. Mouse antibodies are raised against the fusion proteins GST-2B6. 2B6pAb was fond to be specific antibody.CONCLUSION:Recombinant PGEX/2B6 were constructed and purified fusion proteins GST-2B6, and specific 2B6pAb were obtained.
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[MeSH] Cytochrome P-450; Recombinant, fusion proteins; Antibodies
细胞色素P450(cytochrome P, CYP)是由100多个基因组成的超家族氧化还原酶系[1]。哺乳动物中有12个家族,22个亚家族和众多个体基因。CYP介导化学致癌物的代谢活化，这是始动化学致癌的至关重要的第一步。其中CYP1-4家族尤为重要。因而研究CYP1-4家族同功酶及其功能特征是一重要课题。
但CYP2B6在组织中的表达量很低(仅占肝CYP总量的2%)，又有种属、性别、年龄、组织和细胞分布差异，同一亚家族的酶类性质及结构相近，难以直接分离纯化CYP酶蛋白作研究。制备特异性的CYP2B6抗体则为研究CYP2B6表达和功能特征的另一有效手段。
用生化的方法直接从组织中分离纯化CYP酶蛋白往往繁琐而困难，且难以获得足够量的纯化CYP酶蛋白作为抗原。本研究拟体外表达CYP2B6基因片段，以获得足够量的纯化抗原，并制备CYP2B6特异性抗体。曾有人体外表达一组CYP2B6基因片段(长18～33aa)用于制备CYP2B6抗体，也证明了我们选用的包括特异肽段。国内外尚无市售的CYP2B6抗体。
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材 料 和 方 法
一、表达菌株、克隆载体、模板DNA：
DH5α、融合蛋白表达性载体pGEX-3b、PEE-2B6。pGEX-3b ，4966bp，含氨苄青霉素抗性基因和GST的氨基末端基因，由pGEX-3X(Phamacia)改造而来[2]。PEE-2B6为本科室自行构建，为CYP2B6 cDNA(1468bp，PCR产物)与pREP9载体的重组质粒,并命名为PEE-2B6[3]。
二、主要试剂：
工具酶(Gibco/BRL、Promega)，PCR引物(上海细胞所塞尔公司合成)，柱离心式胶回收试剂盒(上海华顺公司)；强化的化学发光检测系统(enhanced chemiluminescence detection system, ECL)自行配制，辣根过氧化物酶(HRP)交联的抗小鼠第二抗体购于华美生物公司。
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三、免疫对象和细胞株：
BALB/C小鼠( 8周，雌性)，小鼠骨髓瘤细胞株NS-1(上海细胞所)。
四、目的基因片段的获取及重组质粒pGEX/2B6的构建：
(1)PCR引物设计策略：据Genbank检索分析选择表达CYP2B6 202～352aa这一特异肽段。据对应的DNA序列(CYP2B6 cDNA 610～1060bp)，并考虑到其BamHI位点(带下划线序列)的阅读框架GAT(方框内序列)与克隆载体pGEX-3b相符而设计引物如下：
(2)PCR扩增反应：反应体系参照文献4。循环94℃变性1 min，65℃退火2 min，72℃聚合3 min。循环25次。
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(3)重组质粒pGEX/2B6的构建： 选用EcoRI酶切来鉴定目的基因片段的插入取向。DNA制备采用碱裂解法。用柱离心式胶回收试剂盒回收纯化目的DNA。酶切、载体DNA的去磷酸化、连接反应、感受态细胞的制备及转化均按常规方法进行[4]。
五、GST-2B6的诱导表达及切胶纯化：
(1)重组质粒pGEX/2B6的诱导表达：将重组质粒pGEX/2B6转化入表达菌株DH5α，过夜菌1：50稀释入新鲜培养基，培养至0D600～0.75,加1 mmol/L IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷酶)诱导表达(37℃，300 r/min剧烈振摇)。分别于诱导表达前、诱导表达后1 h、2 h、3 h、4 h取样，进行0.1%SDS-10%PAGE[5](200V 45min) ，经0.25%考马斯亮兰染色，观察结果。
(2) GST-2B6的切胶纯化：收集诱导表达细菌，加入原体积的缓冲液，反复超声粉碎，离心并定量转移上清至另一管，即为上清样品(S)；用同量的缓冲液悬浮沉淀样品，即为沉淀样品(I)。上述缓冲液均为含1% Triton X-100的MTPBS[150 mmol/L NaCl,16 mmol/L Na2HPO4, 4 mmol/L NaH2PO4(pH 7.3)][ 6]。切胶纯化程序如下：先将溶于加样缓冲液中并煮沸变性的诱导表达细菌经制备型(2 mm)0.1%SDS-10%PAGE分离， 0.3 mol/L CuCl2溶液显色，切取含GST-2B6的PAGE胶块。用脱色液[0.25mol/L EDTA(pH 8.0)，0.25 mol/L Tris-HCl(pH 9.0)]脱色， MTPBS平衡过夜、冷冻干燥，碾磨成胶粉[7]，取适量胶粉即为纯化样品(P)。上述样品经0.%SDS-10%PAGE分离及考马斯亮兰染色，观察结果。
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六、多克隆抗体的制备和初步鉴定：
(1) 多克隆抗体的制备：称取含相应量GST/2B6的胶粉重悬于生理盐水中，直接用于免疫小鼠[8]。以生理盐水作为对照。在加强注射后腹腔注射NS-1细胞以促进腹水生成。收集腹水，获取多克隆抗体2B6pAb。免疫程序如下:
第1、14、28 d腹腔注射50 μg抗原/每只小鼠；第3、17 d腹腔注射0.3 mL弗氏不完全佐剂/每只小鼠； 第31 d腹腔注射NS-1细胞 5×105细胞/每只小鼠； 第42～45 d收集腹水。
(2)用融合蛋白免疫印迹反应初步鉴定2B6pAb的特异性[9]：
①纯化的融合蛋白GST-1A1(本实验室自行制备，为CYP1A1蛋白246～386 aa与GST的融合蛋白，切胶纯化)、GST-2B6均用加样缓冲液重悬，煮沸3 min。高速离心后吸取上清作倍比稀释，使每孔的加样量分别为200、100、50和25 ng。
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②2B6pAb用经切胶纯化的GST-1A1融合蛋白交叉吸收过夜。同时对未经交叉吸收的2B6pAb进行实验。
③按常规方法进行GST-1A1、GST-2B6的0.1%SDS-10%PAGE[5]和电转膜[10]。
④用[含5%脱脂奶粉的TBST(20 mmol/LTris-HCl,140 mmol/L NaCl,0.1% Tween-20)]封闭硝酸纤维素膜上非特异位点。
⑤加2B6pAb (1∶50稀释入封闭液)室温反应2 h，TBST漂洗。
⑥加HRP标记抗小鼠第二抗体(1∶200稀释入封闭液)室温反应2h，TBST漂洗。
⑦最后加ECL溶液，使抗原抗体复合物条带曝光为X光底片相应位置上的条带，经显影、定影后，观察结果。
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结 果
一、目的基因片段的PCR扩增及重组质粒pGEX/2B6的构建：
10 μL PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离、EB染色，在约458bp处可见明亮的DNA条带，与设计产物大小相符，结果见图2(A)Lane 2。重组质粒pGEX/2B6经EcoRI酶切、2%琼脂糖凝胶电泳分离、EB染色，筛选出含226bp,5190bp两个片段的正向插入克隆，如图2(B)Lanes 4,11。也可见含258bp,5158bp两个片段的反向插入克隆，如图2(B) Lanes 2～3,5～10,12。
二、融合蛋白GST-2B6的诱导表达及纯化：
转化入重组质粒pGEX/2B6(正向插入)的DH52菌经IPTG诱导表达，可见诱导表达后在约43 kD处比诱导表达前多了一条深浓的蛋白条带，这与预期的GST-2B6分子量一致，见图3。菌体经超声裂解后，上清样品(S)经考马斯亮兰染色几乎不见融合蛋白，融合蛋白几乎均存在于沉淀样品(I)中，经切胶纯化样品(P)可见纯化的GST-2B6，见图3。
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三、多克隆抗体的初步鉴定：
未经交叉吸收处理，2B6pAb对融合蛋白GST-1A1和GST-2B6均反应，见图4(A)；经GST-1A1融合蛋白抗原交叉吸收后，2B6pAb对GST-2B6融合蛋白反应特异，见图4(B)。
讨 论
CYP在化学致癌物的代谢活化过程中起重要作用。CYP同功酶有广谱的、重叠的底物特异性，其组织学分布既有特异性又有重叠性。研究CYP对特定底物的代谢活化过程及CYP的组织学分布也是对化学致癌的深入研究。制备特异性的CYP抗体是进一步研究化学致癌的有效工具。这样的特异性抗体具有重要的应用价值，可用来检测CYP的组织学分布及其与化学致癌的器官特异性的关系；若用来检测不同人群的CYP的含量差异，则更可评估人群对环境因素的易感性及环境中的化合物的累积诱变活性。若能鉴定所获的抗体具免疫阻滞作用，则可直接监测CYP的代谢过程。
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Fig 1 Map of recombinant pGEX/2B6
图1 重组质粒pGEX/2B6 的图谱
Fig 2 Construction of recombinant pGEX/2B6. (A)PCR amplification of CYP2B6 cDNA fragment(1% agrose gel). Lane1: pGEM 7 zf(+)/HaeIII markers; Lane2: CYP2B6 cDNA 610～1060 bp; (B)Identification of recombinant pGEX/2B6(2% agrose gel). Right orientation of the insert are found in clones 4 and 11. Lane1: 1kb DNA Ladder; Lane 2～12: pGEX/2B6 digested with EcoRI
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图2 重组质粒pGEX/2B6 的构建
Fig 3 Expression and purification of the fusion proteins GST-2B6. (A)Time course of induced expression of GST/2B6.The number on the top indicate hour(s) after induction.(B)Purification of GST-2B6 from preparative SDS-PAGE.The letter indicated at the top were applied: bacterial extract of expression transformant before(B) induction and soluble(S) and insoluble(I) bacterial portion after induction,and purified(P) fusion proteins from insoluble bacterial extract
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图3 融合蛋白GST-2B6 的表达和纯化
Fig 4 Characterization of anti-CYP2B6 polyclonal antibodies on immunoblot with their cognate fusion proteins
For GST/1A1 Lane 1～4: 25,50,100,200ng of purified GST/1A1
For GST/2B6 Lane 1～4: 25,50,100,200ng of purified GST/2B6
Crude and purified anti-CYP2B6 polyclonal antibodies are at a dilution of 1:50
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图4 CYP2B6多克隆抗体的免疫印迹反应
我们选用融合蛋白表达性载体pGEX-3b作为克隆载体，构建重组质粒pGEX/2B6；诱导表达并纯化了融合蛋白 GST-2B6；制备了多克隆抗体2B6pAb。这融合蛋白技术有其优缺点。优点为表达水平高，比较稳定(可防止CYP2B6遭降解，且增强了其免疫原性)，易纯化(可针对GST进行纯化)。但同时也有容易形成包涵体的缺点，我们用切胶纯化的方法获得纯化抗原，克服了该缺点。我们采用PCR技术扩增目的基因片段，由于作为模板的真核表达质粒已导入哺乳细胞获得稳定表达，故省却了测序这一步骤。我们通过分析融合蛋白诱导表达的时相，优化了诱导表达条件，使融合蛋白的表达水平得到提高。
我们将切胶纯化的融合蛋白直接用于免疫小鼠。抗原所含的PAGE胶本身即是良好的免疫佐剂，这更有助于免疫的成功。按照文献6，选用了BALB/C小鼠作为免疫对象，并从腹水中收集多克隆抗体，节省了抗原的用量。
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我们采用融合蛋白的免疫印迹反应初步鉴定了2B6pAb的特异性。同时对未经交叉吸收的2B6pAb进行实验，是为了更好地检测2B6pAb对GST-1A1及GST-2B6的反应性。比较经融合蛋白交叉吸收前后的2B6pAb的免疫印迹反应，表明2B6pAb为特异性抗体。还需经转基因细胞、组织标本的免疫印迹进一步鉴定2B6pAb的特异性。
[基金项目]浙江省自然科学基金资助(N29801)
[参 考 文 献]
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[收稿日期]1998-11-23 [修回日期]1999-04-30, 百拇医药