遗传性疾病基因治疗临床研究现状
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中华医学遗传学杂志
1999年第16卷第4期vol.16No.4 1999
遗传性疾病基因治疗临床研究现状
王健民 于敏
关键词：遗传病 基因治疗
基因治疗是一种应用基因工程技术和分子遗传学原理对人类疾病进行治疗的新疗法。自1990年9月世界上第1例腺苷脱氨酶缺乏所致的重症联合免疫缺陷病患者接受基因治疗以来，基因治疗临床研究取得了很大进展。我们就近几年遗传病基因治疗临床研究进展及现状作一介绍。
1 临床基因治疗研究的总体情况
截至1997年6月，全世界已批准的临床基因治疗方案有218项[1，2]，其中美国184项，包括基因标记30项，肿瘤基因治疗103项，单基因病27项，人免疫缺陷病毒(HIV)19项，其它疾病5项；其他国家有34项，也多为肿瘤基因治疗。接受基因治疗和基因转移的患者总数近几年呈直线上升，1994年底尚不足500例，至1996年12月已逾2000例。所用的基因转移载体逆转录病毒(retrovirus,RV)占56%，质粒载体占24%，腺病毒(adeno-virus,Ad)占10%，腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)占1%。一个重要的趋势是经体内途径(in vivo)进行基因治疗的比例上升，1994年体内途径和体外途径(ex vivo)分别为41%和59%，而1996年分别为61%和39%。提示体内途径因简便、适用而受到人们的重视。
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2 遗传病基因治疗的概况
遗传性疾病是由于人体内遗传物质改变所引起的疾病，目前大多数单基因遗传病尚无有效的根治方法。理论上，通过基因治疗修正缺陷的基因是治疗单基因遗传病的根本途径。迄今已有12种遗传性疾病(表1)，30余个遗传病临床基因治疗方案被批准[1，2]，约占目前世界上批准进行的临床基因治疗方案的16%，200多个遗传病患者接受了基因治疗，约占接受基因治疗患者总数的10%。
表1 全球遗传病基因治疗临床方案及治疗的病例数
疾病
方案数
病例数
囊性纤维变性
19
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176
ADA缺陷的重症联合
免疫缺陷症
4
13
Gaucher病
3
9
家族性高胆固醇血症
1
5
慢性肉芽肿病
1
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5
血友病B
1
4
Fanconi贫血
1
3
X连锁的重症联合免
疫缺陷病
1
α1-抗胰蛋白酶缺陷症
1
嘌呤核苷酸化酶缺陷症
, 百拇医药
1
Hurler's综合征
1
Hunter综合征
1
1
3 已实施的遗传病基因治疗代表性方案
3.1 T淋巴细胞和(或)造血祖细胞为靶细胞的体外途径 以腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)缺陷所致的重症联合免疫缺陷病(severe combined immune deficient,SCID)基因治疗最具代表性。ADA缺陷症是一种常染色体隐性遗传性疾病，其基因定位于染色体20q13，cDNA长1533bp，编码362个氨基酸残基[3]。ADA缺陷症的基因治疗是最早获得政府机构批准的人类基因治疗研究，目前已有5个临床研究方案正在进行，14个患者得到治疗。
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美国国立卫生研究院Blease等[4]，于1990年9月应用患儿外周血淋巴细胞作为靶细胞，进行了世界上第1例临床基因治疗研究。从患儿外周血分离出单个核细胞，用重组人IL-2和CD3单抗刺激T细胞增殖，以LASN逆转录病毒载体转染，使ADA基因稳定整合，扩增T细胞后回输。治疗后患儿T细胞数上升，细胞和体液免疫功能及临床症状明显改善，随访5年仍可在两名患儿体内T细胞中测得转入的载体序列，其他免疫指标检测也证实其长期作用[4]。Bordignon等[5]应用两个结构不同的逆转录病毒载体DCAl和DCAm分别转染外周血淋巴细胞和骨髓造血干细胞治疗两例ADA缺陷症。例1接受了7.34×108DCAl转导的外周血淋巴细胞和0.35×108DCAm转导的骨髓造血祖细胞。16个月后，患者体内G418抗性T细胞和骨髓前体细胞数分别为4.76%和25%。有趣的是开始时，来源于循环淋巴细胞的DNA和骨髓细胞的DNA扩增，可分别测到DCAl载体和DCAm载体；1年以后，外周血淋巴细胞中可同时测到DCAl和DCAm载体，且表达DCAl载体的淋巴细胞迅速减少，被表达DCAm载体的T细胞所取代。另一患者获类似结果，提示在6～12个月的短期免疫功能重建可能是由外周血淋巴细胞所致，而长期重建则由转基因骨髓细胞引起。此外荷兰、日本的学者也分别进行了造血祖细胞ADA基因治疗[6]。
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3.2 以皮肤成纤维细胞为靶细胞的体外途径基因治疗方案 1991年我国复旦大学遗传学研究所与第二军医大学长海医院血液科合作进行的血友病B基因治疗是这一方案的代表[7，8]。血友病B又称凝血因子Ⅸ(factor Ⅸ,FⅨ)缺乏症，是一种性连锁隐性遗传性出血性疾病，其基因位于Xq26.3-27.1，编码顺序长1383bp[9]。该方案应用XLCIX和N2CMVIXC9逆转录病毒载体转染患者的成纤维细胞，以细胞胶原悬液注射到患者皮下，使患者血浆中FⅨ抗原和FⅨ活性升高1～2倍，并持续2年以上，鼻出血等症状有所好转，每年所需输血次数减少。此后又进行了2例血友病乙基因治疗，随访4～7年未发现与基因治疗相关的毒副反应，但转入的Ⅸ因子表达水平仍有待进一步提高。
3.3 以肝细胞为靶细胞的体外途径基因治疗 Wilson领导的研究组应用这一方案治疗了家族性高胆固醇血症(familial hyperchlesterolaemia,FH)[10，11]。FH是一种由低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)功能或表达异常所致的遗传病，有两种遗传方式，一种为多基因遗传，另一种为常染色体显性遗传。LDLR基因位于染色体19p13.2，编码顺序为2.5kb。该方案经部分肝切除获取原代培养的肝细胞，在体外应用含LDLR cDNA的逆转录病毒载体感染后回输，LDLR cDNA由β-actin启动子和CMV早期基因增强子控制转录，基因转染效率为20%～100%。移植物经门静脉注射植入肝脏，患者血液中LDL水平较治疗前下降约30%，LDL/HDL(高密度脂蛋白)之比从治疗前10～13降至5～8，这一水平维持了18个月以上。由于该方案需要切除患者约1/3的肝脏，目前已经停止研究，认为不经改进不宜进一步扩大治疗患者[10，11]。
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3.4 腺病毒等载体介导的体内基因治疗 体内途径的基因治疗以其方便、实用而越来越受到人们的重视，所用载体以腺病毒为主，在肿瘤性疾病的基因治疗中应用较多，而在遗传病，目前主要见于囊性纤维变性(cystic fibrosis,CF)的基因治疗研究。CF是一种白种人常见的致死性疾病，为常染色体隐性遗传。该病是由于跨膜转导因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因突变，导致上皮细胞氯离子通道异常，肺、肝、胰、肠等多器官功能损害。CFTR基因定位于7q染色体，cDNA长约6.5kb。在CF累及的器官中目前只有肺作为基因治疗的靶器官。在所有的遗传病基因治疗方案中，以CF最多(表1)，均为体内途径。主要用腺病毒载体(9项)，此外尚有脂质体-质粒(3项)和腺相关病毒载体(3项)[1，2，12-14]。
Crystal等[12]应用AdCFTR对4名患者进行治疗时发现，应用较低病毒滴度水平(2×106pfu)即可在呼吸道上皮中测到转入CFTR的表达，随访6～12个月发现慢性炎性副反应。Knowles等[13]应用腺病毒载体将不同滴度Ad5CB-CFTR转入12名患者呼吸道上皮细胞，RT-PCR证实基因转入，所用病毒滴度低时，转基因上皮细胞比例<1%，离子转运功能无明显改善；应用高滴度病毒时，3名患者中有2名出现粘膜炎症。多数研究表明，基因治疗纠正了呼吸道上皮的氯离子转运缺陷，跨上皮基础电位下降，有报道治疗后肺功能有所改善。
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3.5 其它进入临床研究的遗传病及其方案如Gaucher病(葡萄糖脑苷脂酶缺陷症)、Fanconi贫血、Hunter综合征等，见表1和表2。
表2 遗传性疾病临床基因治疗的概况
病名
基因
靶细胞
载体
途径
机构
囊性纤维变性
CFTR
呼吸道上皮细胞
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Ad
AAV
脂质体
体内
美国国立卫生研究院
SCID
ADA
淋巴细胞、CD34+细胞
RV
体外
美国国立卫生研究院
Gaucher病
, http://www.100md.com 葡萄糖脑苷脂酶
CD34+外周血干细胞
RV
体外
美国匹兹堡大学
α1-抗胰蛋白酶缺陷症
α1抗胰蛋白酶
鼻、呼吸道上皮细胞
脂质体
体内
美国范德比尔特大学
Fanconi贫血
, 百拇医药
FACC
CD34+外周血干细胞
RV
体外
美国国立卫生研究院
Hunter综合征
艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶
外周血干细胞
RV
体外
美国密尼苏达大学
慢性肉芽肿病
, 百拇医药
p47/phox
CD34+外周血干细胞
RV
体外
美国国立卫生研究院
血友病B
凝血因子Ⅸ
成纤维细胞
RV
体外
上海复旦大学和长海医院
嘌呤核苷磷酸化酶缺陷
, 百拇医药
嘌呤核苷磷酸化酶
外周血淋巴细胞
RV
体外
美国密尼苏达大学
转氨基甲酰鸟氨酸酶缺陷
转氨基甲酰鸟氨酸酶
肝脏
Ad/5
体内
美国宾州大学
X-连锁SCID
, 百拇医药 细胞因子共同γ链
CD34+细胞
RV
体内
美国洛杉矶儿童医院
4 存在的问题及今后的努力方向
基因治疗进入临床近10年，其发展已经渡过了初期阶段的浮躁，进入了理性发展阶段。成功的基因治疗应以安全、有效、简便、实用为目的。目前已实施的临床基因治疗方案均不够成熟，临床疗效尚不确切，但未发现基因治疗相关的癌变等严重并发症。例如ADA缺陷症的基因治疗虽然使患者的淋巴细胞数增加，免疫功能改善，但由于患儿在接受基因治疗的同时，仍在接受PEG-ADA替代治疗[4，5]，使基因治疗效果的评价欠明确。血友病B基因治疗虽然使患者血浆FⅨ水平增高，出血症状改善，但表达水平和持续时间均有待于进一步提高[7]。同时体外途径基因治疗方案费事、耗时，不够实用。有学者应用重组腺病毒载体进行体内途径FⅨ基因治疗，并应用免疫抑制剂以克服免疫反应，但动物体内FⅨ表达水平在9周后仍渐下降，再次注射无效，可能与产生载体相关抗体有关。CF患者经CFTR基因转移后，呼吸道上皮膜电位改善，但离最终治疗目标即肺功能的改善和疾病的逆转尚有距离[12-14]。
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目前需要进一步研究提高转基因体内表达水平，以提高临床疗效。近年来在载体的研究上有不少突破。例如新近报道用无病毒基因的腺病毒载体插入α1-抗胰蛋白酶全长基因，包括肝细胞特异性启动子，获得了在动物体内长期高水平稳定表达[15]，并在保持腺病毒载体转染效率的基础上增加了安全性。应用杂合病毒载体如Ad/AAV载体，取各病毒之长，也取得了一定的进展。对于脂质体-质粒载体的研究则需进一步明确其理化特性，应用分子粘附连接分子提高脂质体的转染效率，有报道应用受体-脂质体-质粒载体复合物进行转染。其他如AAV已用于CF临床基因治疗，血友病B临床治疗也已申请。选择合适的治疗时机对某些疾病也很重要。例如有人认为，CF的肺损害病程可分为两个阶段，早期为CF阶段，晚期为肺疾病阶段，其间有个转变点(point of no return,PNR)。CFTR功能的恢复只在早期阶段有效，故应以早期患者为治疗对象，治疗目的是推迟或阻断PNR的到来[16]。此外Ⅸ因子基因撬除血友病B小鼠模型的建立及AAV载体在动物体内的高水平持久表达也为FⅨ基因治疗研究带来了新的希望[17，18]。
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总体上说，尽管人类基因治疗目前离成熟的临床治疗技术还有相当的距离，但经过近10年的临床试验，人们已经获得了大量宝贵的临床资料。许多实验室对基因治疗的一些基本问题进行了深入研究，例如基因转移载体的进一步优化，新一代载体的研制和开发，对众多遗传性疾病的病理生理特性及基因表达与调控的研究，已经取得较大进展，必将使基因治疗技术进一步成熟和实用，我们有理由相信，随着人类基因组计划的顺利实施和完成，新的人类疾病基因的发现和克隆，基因治疗基础研究的不断进步，基因治疗技术将在不远的将来取得突破性进展，为人类健康作出重大贡献。
本课题受国家自然科学基金(39370321)和1997年度上海市科委留学回国人员启动基金资助
作者单位：200433上海，第二军医大学附属长海医院血液科
参考文献
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10 Grossman M, Rader DJ,Muller DW,et al.A pilot study of ex vivo gene therapy for homozygous familial hypercho-lesterolaemia. Nat Med,1995,1(11)∶1148-1154.
11 Grossman M, Raper SE, Kozarsky K,et al.Successul ex vivo gene therapy directed to liver in a patient with familial hypercholesterolaemia. Nature Genet,1994,6(4)∶335-341.
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14 Alton EW, Geddes DM, Gill DR,et al.Towards gene therapy for cystic fibrosis. Gene Ther,1998,5(3)∶291-292.
15 Schiedner G, Morral N, Parks RJ,et al.Genomic DNA transfer with a high-capacity adenovirus vector results improved in vivo gene expression and decreased toxicity. Nature Genet,1998,18(2)∶180-183.
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(本文编辑 张谦)
(收稿：1998-10-22 修回：1999-04-10), 百拇医药
遗传性疾病基因治疗临床研究现状
王健民 于敏
关键词：遗传病 基因治疗
基因治疗是一种应用基因工程技术和分子遗传学原理对人类疾病进行治疗的新疗法。自1990年9月世界上第1例腺苷脱氨酶缺乏所致的重症联合免疫缺陷病患者接受基因治疗以来，基因治疗临床研究取得了很大进展。我们就近几年遗传病基因治疗临床研究进展及现状作一介绍。
1 临床基因治疗研究的总体情况
截至1997年6月，全世界已批准的临床基因治疗方案有218项[1，2]，其中美国184项，包括基因标记30项，肿瘤基因治疗103项，单基因病27项，人免疫缺陷病毒(HIV)19项，其它疾病5项；其他国家有34项，也多为肿瘤基因治疗。接受基因治疗和基因转移的患者总数近几年呈直线上升，1994年底尚不足500例，至1996年12月已逾2000例。所用的基因转移载体逆转录病毒(retrovirus,RV)占56%，质粒载体占24%，腺病毒(adeno-virus,Ad)占10%，腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)占1%。一个重要的趋势是经体内途径(in vivo)进行基因治疗的比例上升，1994年体内途径和体外途径(ex vivo)分别为41%和59%，而1996年分别为61%和39%。提示体内途径因简便、适用而受到人们的重视。
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2 遗传病基因治疗的概况
遗传性疾病是由于人体内遗传物质改变所引起的疾病，目前大多数单基因遗传病尚无有效的根治方法。理论上，通过基因治疗修正缺陷的基因是治疗单基因遗传病的根本途径。迄今已有12种遗传性疾病(表1)，30余个遗传病临床基因治疗方案被批准[1，2]，约占目前世界上批准进行的临床基因治疗方案的16%，200多个遗传病患者接受了基因治疗，约占接受基因治疗患者总数的10%。
表1 全球遗传病基因治疗临床方案及治疗的病例数
疾病
方案数
病例数
囊性纤维变性
19
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176
ADA缺陷的重症联合
免疫缺陷症
4
13
Gaucher病
3
9
家族性高胆固醇血症
1
5
慢性肉芽肿病
1
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5
血友病B
1
4
Fanconi贫血
1
3
X连锁的重症联合免
疫缺陷病
1
α1-抗胰蛋白酶缺陷症
1
嘌呤核苷酸化酶缺陷症
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1
Hurler's综合征
1
Hunter综合征
1
1
3 已实施的遗传病基因治疗代表性方案
3.1 T淋巴细胞和(或)造血祖细胞为靶细胞的体外途径 以腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)缺陷所致的重症联合免疫缺陷病(severe combined immune deficient,SCID)基因治疗最具代表性。ADA缺陷症是一种常染色体隐性遗传性疾病，其基因定位于染色体20q13，cDNA长1533bp，编码362个氨基酸残基[3]。ADA缺陷症的基因治疗是最早获得政府机构批准的人类基因治疗研究，目前已有5个临床研究方案正在进行，14个患者得到治疗。
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美国国立卫生研究院Blease等[4]，于1990年9月应用患儿外周血淋巴细胞作为靶细胞，进行了世界上第1例临床基因治疗研究。从患儿外周血分离出单个核细胞，用重组人IL-2和CD3单抗刺激T细胞增殖，以LASN逆转录病毒载体转染，使ADA基因稳定整合，扩增T细胞后回输。治疗后患儿T细胞数上升，细胞和体液免疫功能及临床症状明显改善，随访5年仍可在两名患儿体内T细胞中测得转入的载体序列，其他免疫指标检测也证实其长期作用[4]。Bordignon等[5]应用两个结构不同的逆转录病毒载体DCAl和DCAm分别转染外周血淋巴细胞和骨髓造血干细胞治疗两例ADA缺陷症。例1接受了7.34×108DCAl转导的外周血淋巴细胞和0.35×108DCAm转导的骨髓造血祖细胞。16个月后，患者体内G418抗性T细胞和骨髓前体细胞数分别为4.76%和25%。有趣的是开始时，来源于循环淋巴细胞的DNA和骨髓细胞的DNA扩增，可分别测到DCAl载体和DCAm载体；1年以后，外周血淋巴细胞中可同时测到DCAl和DCAm载体，且表达DCAl载体的淋巴细胞迅速减少，被表达DCAm载体的T细胞所取代。另一患者获类似结果，提示在6～12个月的短期免疫功能重建可能是由外周血淋巴细胞所致，而长期重建则由转基因骨髓细胞引起。此外荷兰、日本的学者也分别进行了造血祖细胞ADA基因治疗[6]。
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3.2 以皮肤成纤维细胞为靶细胞的体外途径基因治疗方案 1991年我国复旦大学遗传学研究所与第二军医大学长海医院血液科合作进行的血友病B基因治疗是这一方案的代表[7，8]。血友病B又称凝血因子Ⅸ(factor Ⅸ,FⅨ)缺乏症，是一种性连锁隐性遗传性出血性疾病，其基因位于Xq26.3-27.1，编码顺序长1383bp[9]。该方案应用XLCIX和N2CMVIXC9逆转录病毒载体转染患者的成纤维细胞，以细胞胶原悬液注射到患者皮下，使患者血浆中FⅨ抗原和FⅨ活性升高1～2倍，并持续2年以上，鼻出血等症状有所好转，每年所需输血次数减少。此后又进行了2例血友病乙基因治疗，随访4～7年未发现与基因治疗相关的毒副反应，但转入的Ⅸ因子表达水平仍有待进一步提高。
3.3 以肝细胞为靶细胞的体外途径基因治疗 Wilson领导的研究组应用这一方案治疗了家族性高胆固醇血症(familial hyperchlesterolaemia,FH)[10，11]。FH是一种由低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)功能或表达异常所致的遗传病，有两种遗传方式，一种为多基因遗传，另一种为常染色体显性遗传。LDLR基因位于染色体19p13.2，编码顺序为2.5kb。该方案经部分肝切除获取原代培养的肝细胞，在体外应用含LDLR cDNA的逆转录病毒载体感染后回输，LDLR cDNA由β-actin启动子和CMV早期基因增强子控制转录，基因转染效率为20%～100%。移植物经门静脉注射植入肝脏，患者血液中LDL水平较治疗前下降约30%，LDL/HDL(高密度脂蛋白)之比从治疗前10～13降至5～8，这一水平维持了18个月以上。由于该方案需要切除患者约1/3的肝脏，目前已经停止研究，认为不经改进不宜进一步扩大治疗患者[10，11]。
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3.4 腺病毒等载体介导的体内基因治疗 体内途径的基因治疗以其方便、实用而越来越受到人们的重视，所用载体以腺病毒为主，在肿瘤性疾病的基因治疗中应用较多，而在遗传病，目前主要见于囊性纤维变性(cystic fibrosis,CF)的基因治疗研究。CF是一种白种人常见的致死性疾病，为常染色体隐性遗传。该病是由于跨膜转导因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因突变，导致上皮细胞氯离子通道异常，肺、肝、胰、肠等多器官功能损害。CFTR基因定位于7q染色体，cDNA长约6.5kb。在CF累及的器官中目前只有肺作为基因治疗的靶器官。在所有的遗传病基因治疗方案中，以CF最多(表1)，均为体内途径。主要用腺病毒载体(9项)，此外尚有脂质体-质粒(3项)和腺相关病毒载体(3项)[1，2，12-14]。
Crystal等[12]应用AdCFTR对4名患者进行治疗时发现，应用较低病毒滴度水平(2×106pfu)即可在呼吸道上皮中测到转入CFTR的表达，随访6～12个月发现慢性炎性副反应。Knowles等[13]应用腺病毒载体将不同滴度Ad5CB-CFTR转入12名患者呼吸道上皮细胞，RT-PCR证实基因转入，所用病毒滴度低时，转基因上皮细胞比例<1%，离子转运功能无明显改善；应用高滴度病毒时，3名患者中有2名出现粘膜炎症。多数研究表明，基因治疗纠正了呼吸道上皮的氯离子转运缺陷，跨上皮基础电位下降，有报道治疗后肺功能有所改善。
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3.5 其它进入临床研究的遗传病及其方案如Gaucher病(葡萄糖脑苷脂酶缺陷症)、Fanconi贫血、Hunter综合征等，见表1和表2。
表2 遗传性疾病临床基因治疗的概况
病名
基因
靶细胞
载体
途径
机构
囊性纤维变性
CFTR
呼吸道上皮细胞
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Ad
AAV
脂质体
体内
美国国立卫生研究院
SCID
ADA
淋巴细胞、CD34+细胞
RV
体外
美国国立卫生研究院
Gaucher病
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CD34+外周血干细胞
RV
体外
美国匹兹堡大学
α1-抗胰蛋白酶缺陷症
α1抗胰蛋白酶
鼻、呼吸道上皮细胞
脂质体
体内
美国范德比尔特大学
Fanconi贫血
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FACC
CD34+外周血干细胞
RV
体外
美国国立卫生研究院
Hunter综合征
艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶
外周血干细胞
RV
体外
美国密尼苏达大学
慢性肉芽肿病
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p47/phox
CD34+外周血干细胞
RV
体外
美国国立卫生研究院
血友病B
凝血因子Ⅸ
成纤维细胞
RV
体外
上海复旦大学和长海医院
嘌呤核苷磷酸化酶缺陷
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嘌呤核苷磷酸化酶
外周血淋巴细胞
RV
体外
美国密尼苏达大学
转氨基甲酰鸟氨酸酶缺陷
转氨基甲酰鸟氨酸酶
肝脏
Ad/5
体内
美国宾州大学
X-连锁SCID
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CD34+细胞
RV
体内
美国洛杉矶儿童医院
4 存在的问题及今后的努力方向
基因治疗进入临床近10年，其发展已经渡过了初期阶段的浮躁，进入了理性发展阶段。成功的基因治疗应以安全、有效、简便、实用为目的。目前已实施的临床基因治疗方案均不够成熟，临床疗效尚不确切，但未发现基因治疗相关的癌变等严重并发症。例如ADA缺陷症的基因治疗虽然使患者的淋巴细胞数增加，免疫功能改善，但由于患儿在接受基因治疗的同时，仍在接受PEG-ADA替代治疗[4，5]，使基因治疗效果的评价欠明确。血友病B基因治疗虽然使患者血浆FⅨ水平增高，出血症状改善，但表达水平和持续时间均有待于进一步提高[7]。同时体外途径基因治疗方案费事、耗时，不够实用。有学者应用重组腺病毒载体进行体内途径FⅨ基因治疗，并应用免疫抑制剂以克服免疫反应，但动物体内FⅨ表达水平在9周后仍渐下降，再次注射无效，可能与产生载体相关抗体有关。CF患者经CFTR基因转移后，呼吸道上皮膜电位改善，但离最终治疗目标即肺功能的改善和疾病的逆转尚有距离[12-14]。
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目前需要进一步研究提高转基因体内表达水平，以提高临床疗效。近年来在载体的研究上有不少突破。例如新近报道用无病毒基因的腺病毒载体插入α1-抗胰蛋白酶全长基因，包括肝细胞特异性启动子，获得了在动物体内长期高水平稳定表达[15]，并在保持腺病毒载体转染效率的基础上增加了安全性。应用杂合病毒载体如Ad/AAV载体，取各病毒之长，也取得了一定的进展。对于脂质体-质粒载体的研究则需进一步明确其理化特性，应用分子粘附连接分子提高脂质体的转染效率，有报道应用受体-脂质体-质粒载体复合物进行转染。其他如AAV已用于CF临床基因治疗，血友病B临床治疗也已申请。选择合适的治疗时机对某些疾病也很重要。例如有人认为，CF的肺损害病程可分为两个阶段，早期为CF阶段，晚期为肺疾病阶段，其间有个转变点(point of no return,PNR)。CFTR功能的恢复只在早期阶段有效，故应以早期患者为治疗对象，治疗目的是推迟或阻断PNR的到来[16]。此外Ⅸ因子基因撬除血友病B小鼠模型的建立及AAV载体在动物体内的高水平持久表达也为FⅨ基因治疗研究带来了新的希望[17，18]。
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总体上说，尽管人类基因治疗目前离成熟的临床治疗技术还有相当的距离，但经过近10年的临床试验，人们已经获得了大量宝贵的临床资料。许多实验室对基因治疗的一些基本问题进行了深入研究，例如基因转移载体的进一步优化，新一代载体的研制和开发，对众多遗传性疾病的病理生理特性及基因表达与调控的研究，已经取得较大进展，必将使基因治疗技术进一步成熟和实用，我们有理由相信，随着人类基因组计划的顺利实施和完成，新的人类疾病基因的发现和克隆，基因治疗基础研究的不断进步，基因治疗技术将在不远的将来取得突破性进展，为人类健康作出重大贡献。
本课题受国家自然科学基金(39370321)和1997年度上海市科委留学回国人员启动基金资助
作者单位：200433上海，第二军医大学附属长海医院血液科
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(本文编辑 张谦)
(收稿：1998-10-22 修回：1999-04-10), 百拇医药