克隆人胸腺素α原cDNA及RNA二级结构分析和带Xa因子的融合表达
作者：郭葆玉 余建国 张淑英 道书艳 苗红 邱磊
单位：郭葆玉(第二军医大学药学院生化药学 200433)；道书艳(第二军医大学药学院生化药学 200433)；苗红(第二军医大学药学院生化药学 200433)；邱磊(第二军医大学药学院生化药学 200433)；余建国(济南军区第88医院肝病研究中心)；张淑英(第二军医大学基础医学部卫生毒理学教研室)
关键词：胸腺素α原；二级结构；RNA；融合表达；克隆；
第二军医大学学报000112 摘 要：目的：克隆表达具有重要生物功能的胸腺素α原cDNA(human prothymosinα, huPTMAα)。方法：从健康中国人PBMC poly(A)+ RNA中采用RT-PCR法克隆huPTMAα cDNA，并作RNA二级结构分析。结果：克隆出长度为300 bp，编码100个氨基酸的huPTMAα cDNA，经氨基酸序列分析发现在37～41位缺失Asn37-Gly38-Asn39-Ala40-Glu41和65～68位缺失Glu65-Glu66-Glu67-Glu68，与国际基因库连接检索证明是与huPTMAα有86.4%同源性的一个新亚型，融合表达蛋白的相对分子质量为3.7×104，有促进IFN和TNF产生的生物学活性。结论：本研究克隆的huPTMAα cDNA是中国人中新发现的一个多态型基因序列，它的克隆并表达成功为今后该基因的免疫功能研究及中国人基因型研究分析提供了有用的材料。
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中图分类号：Q 786 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0034-04
Cloning of prothymosin αcDNA，analysis of RNA secondary structure and fusion expression with Xa factor
GUO Bao-Yu
(Department of Biochemical Drug, College of Pharmacy, Second Military Medical University， Shanghai 200433，China)
DAO Shu-Yan
(Department of Biochemical Drug, College of Pharmacy, Second Military Medical University， Shanghai 200433，China)
, 百拇医药
MIAO Hong
(Department of Biochemical Drug, College of Pharmacy, Second Military Medical University， Shanghai 200433，China)
QIU Lei
(Department of Biochemical Drug, College of Pharmacy, Second Military Medical University， Shanghai 200433，China)
YU Jian-Guo
(Contre of Hepatopathy Research, Hospital No. 88, Jinan Military Area Command)
, 百拇医药
ZHANG Shu-Ying
(Department of Health Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University)
ABSTRACT：Objective: To clone and express human prothymosin α (huPTMAα) which has important biological functions. Methods: A huPTMA α cDNA was cloned from poly(A)+ RNA of the healthy Chinese peripheral blood monocyte cells by RT-PCR and the RNA second structure was analysed. Results: A huPTMA α cDNA sequence of 300 bp coding 100 amino acids was cloned. Two deletion domains were found. One was Asn37-Gly38-Asn39-Ala40-Glu41, the other was Glu65-Glu66-Glu67-Glu68. It was a new subtype of huPTMA α and has 86.4% homology with GenBank data. The molecular weight 3.7×104 fusion protein bond was shown by SDS-PAGE, also, an increased TNF and IFN production bioactivity was found. Conclusion: A new huPTMAα multitype sequence is identified from Chinese people. This material might be useful in studying immunology function and Chinese gene type.
, 百拇医药
KEY WORDS：human prothymosin α; second structure, RNA; fusion expression;cloning▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 34-37]
人胸腺素α原 ( human prothymosin α, huPTMAα) 是一个在人体中分布广泛，进化上高度保守，相对分子质量为1.3×104的高度酸性蛋白质，其基因定位于第2号染色体上，目前已有6个亚家族成员被克隆和测序。huPTMAα作为免疫调节因子具有多种生理功能，如抑制肿瘤细胞的生长，延长荷瘤小鼠的寿命， 提高NK， LAK细胞的活性；提高细胞毒功能较弱的CD16+，CD2的活性，增强MHC限制的细胞免疫，抑制系统性红斑狼疮，促进IL-2，MIF的分泌和TNF-α，IFN的合成；促进IL-2受体的表达，刺激外周血单核细胞(PBMC)产生超氧化物阴离子，提高人体免疫系统的自稳性[1]；治疗乙型、丙型肝炎和其他病毒性疾病；而且，huPTMAα的作用远远高于胸腺素α1[2]。考虑到人种的基因差异和该基因的多态性，我们拟从中国人本身克隆出汉族人的huPTMAα，以期研究它的功能。结果发现，我们克隆的基因除了一些位点突变外,有两处共缺失9个氨基酸。本文报道这一新的发现，并就其二级结构与功能的关系作一分析。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 细胞与载体 人PBMC系由中国汉族健康成年男性外周血获得。RNAzol B购自Cinn生物技术公司; Oligo(dT) Latex 30 购自JSR公司; 各种限制性内切酶均购自华美公司; T4 DNA连接酶、X-gal, 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等购自Promega公司; 反转录Kit盒购自美国PE公司; Taq酶、PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜公司。pGEXIN载体及其宿主菌TG-1由本室构建和保存。
1.2 寡核苷酸引物 据文献[3]设计出huPTMAα引物序列。上游引物Pty1为：5′-GCGAATTCATGTCAGACGCAGCCGTA-3′，为便于分离纯化，5′端除加保护性核苷酸和一个EcoR Ⅰ酶切位点外，又加了一个Ⅹa因子。下游引物Pty2序列为5′-GCGGATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3′，在5′端外加一个BamH Ⅰ酶切位点。
, 百拇医药
1.3 总RNA及poly(A)+RNA提取 见参考文献[4]。
1.4 反转录合成cDNA第一链及PCR反应 见参考文献[4]，PCR反应在PE9600型(USA)扩增仪中进行。1%琼脂糖电泳检查特异条带，按华舜公司试剂盒纯化PCR反应产物。
1.5 DNA重组与鉴定 重组DNA技术按细胞分子生物学实验操作指南[5] 进行。
1.6 DNA序列分析 在ABI377型DNA自动序列分析仪上完成(上海基康公司)测序，并重复3次。DNA 和推导的氨基酸序列及其与GenBank中的发表序列比较和氨基酸二级结构分析用DNasis 微软处理完成。
1.7 诱导huPTMA 基因表达 重组表达质粒转化大肠杆菌TG-1，接种于 LB/Amp培养基，37℃培养3～4 h至D(600)为0.5～0.6时，加IPTG终浓度为1 mmol/L诱导表达。
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1.8 SDS-PAGE 分离胶浓度15%，样品中加上样缓冲液，煮沸5 min，取15 μl上样，1%考马斯亮蓝R-250染色。
1.9 促进IFN，TNF产生 按本室方法进行。
2 结果
2.1 引物设计与合成 编码huPTMAα的基因及其对应的核苷酸顺序见文献[3]。为了保证PCR扩增准确,避免错配，我们将模板用poly(A)+RNA而不用总RNA，PCR用高严谨退火温度，为了避免所谓“通读”，又加了一个TGA，载体采用了一个本室改进的载体pGEXIN。
2.2 huPTMAα的PCR扩增及序列测定 以设计的两个引物Pty1和Pty2为引物。在高严谨条件下经35个循环后得到约300 bp的扩增产物(图1)。初步鉴定后的PCR产物经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，用T4 DNA连接酶与pGEXIN连接，转化大肠杆菌TG-1，挑取克隆，经酶切鉴定阳性后(图2)，进行序列分析。 结果表明，克隆的cDNA片段与已报道的huPTMAα序列[3] 在DNA 水平有90%的同源性，在推导的氨基酸序列只有86.4%的同源性 (图3)，其中43位核苷酸由A→G，81位由A→G，106位由A→G，141位由G→A，156位由G→A，162位由C→T，169位由G→C，242位由A→G，289位由G→A,同时110位缺失GGAATGCTGAGAATG序列和192～203位缺失GGAGGAGGAAGA序列。不同的氨基酸为：Lys15→Glu,Glu57→Gln,Glu81→Gly,Gly87→Asp,Asp97→Asn,缺失的氨基酸序列为Asn-Gly-Asn-Ala-Glu-Asn和Glu-Glu-Glu-Glu。
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图1 RT-PCR扩增huPTMAα
Fig 1 RT-PCR amplification of huPTMAα
Line 1: huPTMAα; Line 2: Marker
图2 huPTMAα的酶切图谱
Fig 2 Result of enzyme digestion of huPTMAα
Line 1:PCR marker;Line 2:huPTMAα/pGEXIN;Line 3:Marker
, 百拇医药
图3 PTMA α原的氨基酸序列分析
Fig 3 Alignment of huPTMAα amino acid sequence
Thy/hu/aa:From GenBank;Ptyguo14/aa:From our laboratory;
Black alphabet:Mutation amino acid
2.3 重组质粒在大肠杆菌中的表达 pGEXIN/ huPTMAα质粒转化的大肠杆菌TG-1经1 mmol/L IPTG诱导后做诱导表达SDS-PAGE分析，在3.7×104处出现一条浓染的表达蛋白条带(图4)和GST(相对分子质量2.6×104 )。
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图4 SDS-PAGE结果
Fig 4 Result of SDS-PAGE
Line 1:Marker;Line 2:Without inducing;Line 3:IPTG induced
GST;Line 4:Without inducing;Line 5:IPTG induced huPTMAα
2.4 生物学活性测定 经重复测定发现，该表达重组蛋白可促进IFN和TNF的产生(另文发表)。
3 讨论
pGEXIN是本室改建的原核细胞高表达载体,本实验中于PTMA5′加上Ⅹa因子，从而可以获得纯的融合蛋白，简化了目的蛋白的分离纯化步骤。
, 百拇医药
从分子进化和基因剪切及结构域与功能的关系分析，基因的多样化是由于编码蛋白质的DNA上的一些位点的点突变并经过连续地选择而造成，但是，许多蛋白质表象的结构特征说明，一些结构域的特性是通过基因剪切而组成相似结构域的多重拷贝，其中每个结构域都能组成某些蛋白质整体或部分的功能。我们克隆的huPTMAα经3次测序证明是一个新的亚型，某些氨基酸突变和缺失说明该基因区段在进化中可能发生受到免疫压力和环境因素的影响而易于突变，而该突变又发生在RNA二级结构热力学不稳定的大噜朴(large toop)区域(图5A,150～200处)，或许这种突变与人群的基因型有关。从氨基酸结构比较分析来看，我们克隆的huPTMAα与国外发表的高加索人huPTMA的N端30个氨基酸和C端的20个氨基酸有非常相似的螺旋和转角组成(图5A 1～306和图5B 1～300处)，而该处与有生理功能的人工合成胸腺素α1[6]序列完全一样，因此，推测该基因的这两个区段与huPTMAα的重要生物学活性有关。我们克隆的huPTMAα中段从60～70位氨基酸出现了转角，从而形成一些小的折叠，70～80位氨基酸处出现了反平行的一折叠简筒，这种结构的功能有待进一步研究。两处缺失部位可能提示该处结构域无重要生理功能而在进化中废退。本文报道的结果是一个新的中国人huPTMAα基因型，对其进行了结构分析和融合表达，这为进一步研究其生物学活性，结构与功能的关系，不同的基因型及其抗肿瘤作用机制提供了有用的材料。■
, 百拇医药
图5 huPTMAα RNA二级结构分析
Fig 5 Analysis of huPTMAα RNA secondary structure
A:The huPTMAα RNA secondary structure from GenBank； B:The huPTMAα RNA secondary structure from our laboratory
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770689)
作者简介：郭葆玉(1951～)，男(汉族)，博士，副教授
参考文献：
[1]Eschenfeldt WH, Berger SL. The human prothymosin α gene is polymorphic and induced upon growth stimulation:evidence using a cloned cDNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1986，83(24):9403-9407.
, 百拇医药
[2]Watts JD,Cary PD,Sautiere P, et al. Thymosins:both nuclear and cytoplasmic proteins[J]. Eur J Biochem,1990,192(3):643-651.
[3]Evstafieva AG, Chichkova NV, Makarova TN， et al. Overproduction in Escherichia coli, purification and properties of human prothymosin α [J]. Eur J Biochem,1995，231(3):639-643.
[4]Guo BY, Zhang SY, Mukaida N， et al.CCR5 gene expression in fulminant hepatitis and DTH in mice[J]. World J Gastroenterol,1998，4(1):14-17.
, 百拇医药
[5]郭葆玉 主编. 细胞分子生物学实验操作指南[M]. 上海：第二军医大学出版社，1998. 74-80.
[6]Wetzel R, Heyneker HL, Goeddel DV, et al. Production of biologically active Nα-desacetylthy mosin a1 in Escherichia coli through expression of a chemically synthesized gene[J]. Biochemistry,1980，19(26):6096-6104.
收稿日期：1999-08-17
修回日期：1999-12-27, 百拇医药
单位：郭葆玉(第二军医大学药学院生化药学 200433)；道书艳(第二军医大学药学院生化药学 200433)；苗红(第二军医大学药学院生化药学 200433)；邱磊(第二军医大学药学院生化药学 200433)；余建国(济南军区第88医院肝病研究中心)；张淑英(第二军医大学基础医学部卫生毒理学教研室)
关键词：胸腺素α原；二级结构；RNA；融合表达；克隆；
第二军医大学学报000112 摘 要：目的：克隆表达具有重要生物功能的胸腺素α原cDNA(human prothymosinα, huPTMAα)。方法：从健康中国人PBMC poly(A)+ RNA中采用RT-PCR法克隆huPTMAα cDNA，并作RNA二级结构分析。结果：克隆出长度为300 bp，编码100个氨基酸的huPTMAα cDNA，经氨基酸序列分析发现在37～41位缺失Asn37-Gly38-Asn39-Ala40-Glu41和65～68位缺失Glu65-Glu66-Glu67-Glu68，与国际基因库连接检索证明是与huPTMAα有86.4%同源性的一个新亚型，融合表达蛋白的相对分子质量为3.7×104，有促进IFN和TNF产生的生物学活性。结论：本研究克隆的huPTMAα cDNA是中国人中新发现的一个多态型基因序列，它的克隆并表达成功为今后该基因的免疫功能研究及中国人基因型研究分析提供了有用的材料。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q 786 文献标识码：A
文章编号：0258-879X(2000)01-0034-04
Cloning of prothymosin αcDNA，analysis of RNA secondary structure and fusion expression with Xa factor
GUO Bao-Yu
(Department of Biochemical Drug, College of Pharmacy, Second Military Medical University， Shanghai 200433，China)
DAO Shu-Yan
(Department of Biochemical Drug, College of Pharmacy, Second Military Medical University， Shanghai 200433，China)
, 百拇医药
MIAO Hong
(Department of Biochemical Drug, College of Pharmacy, Second Military Medical University， Shanghai 200433，China)
QIU Lei
(Department of Biochemical Drug, College of Pharmacy, Second Military Medical University， Shanghai 200433，China)
YU Jian-Guo
(Contre of Hepatopathy Research, Hospital No. 88, Jinan Military Area Command)
, 百拇医药
ZHANG Shu-Ying
(Department of Health Toxicology, Department of Basic Medicine, Second Military Medical University)
ABSTRACT：Objective: To clone and express human prothymosin α (huPTMAα) which has important biological functions. Methods: A huPTMA α cDNA was cloned from poly(A)+ RNA of the healthy Chinese peripheral blood monocyte cells by RT-PCR and the RNA second structure was analysed. Results: A huPTMA α cDNA sequence of 300 bp coding 100 amino acids was cloned. Two deletion domains were found. One was Asn37-Gly38-Asn39-Ala40-Glu41, the other was Glu65-Glu66-Glu67-Glu68. It was a new subtype of huPTMA α and has 86.4% homology with GenBank data. The molecular weight 3.7×104 fusion protein bond was shown by SDS-PAGE, also, an increased TNF and IFN production bioactivity was found. Conclusion: A new huPTMAα multitype sequence is identified from Chinese people. This material might be useful in studying immunology function and Chinese gene type.
, 百拇医药
KEY WORDS：human prothymosin α; second structure, RNA; fusion expression;cloning▲
[Acad J Sec Mil Med Univ, 2000, 21(1): 34-37]
人胸腺素α原 ( human prothymosin α, huPTMAα) 是一个在人体中分布广泛，进化上高度保守，相对分子质量为1.3×104的高度酸性蛋白质，其基因定位于第2号染色体上，目前已有6个亚家族成员被克隆和测序。huPTMAα作为免疫调节因子具有多种生理功能，如抑制肿瘤细胞的生长，延长荷瘤小鼠的寿命， 提高NK， LAK细胞的活性；提高细胞毒功能较弱的CD16+，CD2的活性，增强MHC限制的细胞免疫，抑制系统性红斑狼疮，促进IL-2，MIF的分泌和TNF-α，IFN的合成；促进IL-2受体的表达，刺激外周血单核细胞(PBMC)产生超氧化物阴离子，提高人体免疫系统的自稳性[1]；治疗乙型、丙型肝炎和其他病毒性疾病；而且，huPTMAα的作用远远高于胸腺素α1[2]。考虑到人种的基因差异和该基因的多态性，我们拟从中国人本身克隆出汉族人的huPTMAα，以期研究它的功能。结果发现，我们克隆的基因除了一些位点突变外,有两处共缺失9个氨基酸。本文报道这一新的发现，并就其二级结构与功能的关系作一分析。
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1 材料和方法
1.1 细胞与载体 人PBMC系由中国汉族健康成年男性外周血获得。RNAzol B购自Cinn生物技术公司; Oligo(dT) Latex 30 购自JSR公司; 各种限制性内切酶均购自华美公司; T4 DNA连接酶、X-gal, 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等购自Promega公司; 反转录Kit盒购自美国PE公司; Taq酶、PCR产物纯化试剂盒购自上海华舜公司。pGEXIN载体及其宿主菌TG-1由本室构建和保存。
1.2 寡核苷酸引物 据文献[3]设计出huPTMAα引物序列。上游引物Pty1为：5′-GCGAATTCATGTCAGACGCAGCCGTA-3′，为便于分离纯化，5′端除加保护性核苷酸和一个EcoR Ⅰ酶切位点外，又加了一个Ⅹa因子。下游引物Pty2序列为5′-GCGGATCCCTAGTCATCCTCGTCGGTC-3′，在5′端外加一个BamH Ⅰ酶切位点。
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1.3 总RNA及poly(A)+RNA提取 见参考文献[4]。
1.4 反转录合成cDNA第一链及PCR反应 见参考文献[4]，PCR反应在PE9600型(USA)扩增仪中进行。1%琼脂糖电泳检查特异条带，按华舜公司试剂盒纯化PCR反应产物。
1.5 DNA重组与鉴定 重组DNA技术按细胞分子生物学实验操作指南[5] 进行。
1.6 DNA序列分析 在ABI377型DNA自动序列分析仪上完成(上海基康公司)测序，并重复3次。DNA 和推导的氨基酸序列及其与GenBank中的发表序列比较和氨基酸二级结构分析用DNasis 微软处理完成。
1.7 诱导huPTMA 基因表达 重组表达质粒转化大肠杆菌TG-1，接种于 LB/Amp培养基，37℃培养3～4 h至D(600)为0.5～0.6时，加IPTG终浓度为1 mmol/L诱导表达。
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1.8 SDS-PAGE 分离胶浓度15%，样品中加上样缓冲液，煮沸5 min，取15 μl上样，1%考马斯亮蓝R-250染色。
1.9 促进IFN，TNF产生 按本室方法进行。
2 结果
2.1 引物设计与合成 编码huPTMAα的基因及其对应的核苷酸顺序见文献[3]。为了保证PCR扩增准确,避免错配，我们将模板用poly(A)+RNA而不用总RNA，PCR用高严谨退火温度，为了避免所谓“通读”，又加了一个TGA，载体采用了一个本室改进的载体pGEXIN。
2.2 huPTMAα的PCR扩增及序列测定 以设计的两个引物Pty1和Pty2为引物。在高严谨条件下经35个循环后得到约300 bp的扩增产物(图1)。初步鉴定后的PCR产物经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，用T4 DNA连接酶与pGEXIN连接，转化大肠杆菌TG-1，挑取克隆，经酶切鉴定阳性后(图2)，进行序列分析。 结果表明，克隆的cDNA片段与已报道的huPTMAα序列[3] 在DNA 水平有90%的同源性，在推导的氨基酸序列只有86.4%的同源性 (图3)，其中43位核苷酸由A→G，81位由A→G，106位由A→G，141位由G→A，156位由G→A，162位由C→T，169位由G→C，242位由A→G，289位由G→A,同时110位缺失GGAATGCTGAGAATG序列和192～203位缺失GGAGGAGGAAGA序列。不同的氨基酸为：Lys15→Glu,Glu57→Gln,Glu81→Gly,Gly87→Asp,Asp97→Asn,缺失的氨基酸序列为Asn-Gly-Asn-Ala-Glu-Asn和Glu-Glu-Glu-Glu。
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图1 RT-PCR扩增huPTMAα
Fig 1 RT-PCR amplification of huPTMAα
Line 1: huPTMAα; Line 2: Marker
图2 huPTMAα的酶切图谱
Fig 2 Result of enzyme digestion of huPTMAα
Line 1:PCR marker;Line 2:huPTMAα/pGEXIN;Line 3:Marker
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图3 PTMA α原的氨基酸序列分析
Fig 3 Alignment of huPTMAα amino acid sequence
Thy/hu/aa:From GenBank;Ptyguo14/aa:From our laboratory;
Black alphabet:Mutation amino acid
2.3 重组质粒在大肠杆菌中的表达 pGEXIN/ huPTMAα质粒转化的大肠杆菌TG-1经1 mmol/L IPTG诱导后做诱导表达SDS-PAGE分析，在3.7×104处出现一条浓染的表达蛋白条带(图4)和GST(相对分子质量2.6×104 )。
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图4 SDS-PAGE结果
Fig 4 Result of SDS-PAGE
Line 1:Marker;Line 2:Without inducing;Line 3:IPTG induced
GST;Line 4:Without inducing;Line 5:IPTG induced huPTMAα
2.4 生物学活性测定 经重复测定发现，该表达重组蛋白可促进IFN和TNF的产生(另文发表)。
3 讨论
pGEXIN是本室改建的原核细胞高表达载体,本实验中于PTMA5′加上Ⅹa因子，从而可以获得纯的融合蛋白，简化了目的蛋白的分离纯化步骤。
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从分子进化和基因剪切及结构域与功能的关系分析，基因的多样化是由于编码蛋白质的DNA上的一些位点的点突变并经过连续地选择而造成，但是，许多蛋白质表象的结构特征说明，一些结构域的特性是通过基因剪切而组成相似结构域的多重拷贝，其中每个结构域都能组成某些蛋白质整体或部分的功能。我们克隆的huPTMAα经3次测序证明是一个新的亚型，某些氨基酸突变和缺失说明该基因区段在进化中可能发生受到免疫压力和环境因素的影响而易于突变，而该突变又发生在RNA二级结构热力学不稳定的大噜朴(large toop)区域(图5A,150～200处)，或许这种突变与人群的基因型有关。从氨基酸结构比较分析来看，我们克隆的huPTMAα与国外发表的高加索人huPTMA的N端30个氨基酸和C端的20个氨基酸有非常相似的螺旋和转角组成(图5A 1～306和图5B 1～300处)，而该处与有生理功能的人工合成胸腺素α1[6]序列完全一样，因此，推测该基因的这两个区段与huPTMAα的重要生物学活性有关。我们克隆的huPTMAα中段从60～70位氨基酸出现了转角，从而形成一些小的折叠，70～80位氨基酸处出现了反平行的一折叠简筒，这种结构的功能有待进一步研究。两处缺失部位可能提示该处结构域无重要生理功能而在进化中废退。本文报道的结果是一个新的中国人huPTMAα基因型，对其进行了结构分析和融合表达，这为进一步研究其生物学活性，结构与功能的关系，不同的基因型及其抗肿瘤作用机制提供了有用的材料。■
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图5 huPTMAα RNA二级结构分析
Fig 5 Analysis of huPTMAα RNA secondary structure
A:The huPTMAα RNA secondary structure from GenBank； B:The huPTMAα RNA secondary structure from our laboratory
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39770689)
作者简介：郭葆玉(1951～)，男(汉族)，博士，副教授
参考文献：
[1]Eschenfeldt WH, Berger SL. The human prothymosin α gene is polymorphic and induced upon growth stimulation:evidence using a cloned cDNA[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1986，83(24):9403-9407.
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[2]Watts JD,Cary PD,Sautiere P, et al. Thymosins:both nuclear and cytoplasmic proteins[J]. Eur J Biochem,1990,192(3):643-651.
[3]Evstafieva AG, Chichkova NV, Makarova TN， et al. Overproduction in Escherichia coli, purification and properties of human prothymosin α [J]. Eur J Biochem,1995，231(3):639-643.
[4]Guo BY, Zhang SY, Mukaida N， et al.CCR5 gene expression in fulminant hepatitis and DTH in mice[J]. World J Gastroenterol,1998，4(1):14-17.
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[5]郭葆玉 主编. 细胞分子生物学实验操作指南[M]. 上海：第二军医大学出版社，1998. 74-80.
[6]Wetzel R, Heyneker HL, Goeddel DV, et al. Production of biologically active Nα-desacetylthy mosin a1 in Escherichia coli through expression of a chemically synthesized gene[J]. Biochemistry,1980，19(26):6096-6104.
收稿日期：1999-08-17
修回日期：1999-12-27, 百拇医药