毛木耳多糖对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶C活性的影响
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前卫药学杂志
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王道福 邵林萍* 菊保文** 苑耀明 丁望 (89医院 潍坊261000)
( 山东省潍坊市人民医院 潍坊261021 )
(山东省潍坊市药检所 潍坊261021)
摘要 目的：观察毛木耳多糖(APSP)体外对小鼠腹腔巨噬细胞(Mø)蛋白激酶C(PKC)活性是否有影响。方法：采用反相离子对高效液相色谱法测定PKC活力。结果：APSP(80mgl-1)能引起小鼠腹腔Mφ中PKC活性明显升高，20min达峰值，1.5h恢复到基础水平，并可引起Mφ中PKC发生质膜转位。结论：毛木耳多糖的免疫增强作用与其增强PKC活性有关。
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关键词 毛木耳；多糖；巨噬细胞；蛋白激酶C
毛木耳多糖(Auricularia polytricha Sacc polysaccharide,APSP)系从担子菌纲银耳科毛木耳(Auricularia polytricha Sacc)子实体中提取，具药食两用价值，有滋补强壮、扶正固本之功效。现代药理学研究证明，毛木耳多糖具有免疫增强和抗肿瘤作用，但其作用机制尚未明确。本文采用HPLC法，测定毛木耳多糖均一体组分APSP—A对小鼠腹腔巨噬细胞(Mø)PKC活性的影响，以进一步探讨毛木耳多糖的作用机理。
1 材料和方法
1.1 药品和试剂毛木耳多糖(APSP—A)：按文献方法提取1，化学性质属酸性杂多糖，由甘露糖、葡萄糖、木糖、岩藻糖及少量糠醛酸组成，4种单糖的分子比为3.20：1.0：0.18：0.05，分子量12万，实验时以HEPES缓冲液配成所需浓度，滤膜过滤，消毒，4℃保存。RPMI—640培养基(G；bco生命技术公司产品)。胎牛血清(FCS杭州四季青生物工程公司)。HEPES缓冲液(pH7.2—7.4，批号991122)、Sucrose(批号971001)、DTT(批号990222—1)、Leupetim(批号991231)、Histone(Ⅲ—s，批号990611—2)、PMSF(批号990901)、ATP(批号971021)、ADP(批号991021)、AMP(批号990315)、cAMP(批号9902230)Trion-X100(批号970917)、PS(批号990301)、DAG(批号990712)、EDTA(批号971121)均为Sigma产品。甲醇、PiCA为国产色谱纯。其余皆为国产分析纯。
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1.2 仪器高效液相色谱仪(岛津LC-6A型)
1.3 动物昆明种纯系小鼠，♀♂不限，7—9周龄，体重23.2~25.5g，由昌潍医学院实验动物中心提供(合格证号99—01—4006)。
1.4 巨噬细胞的培养按文献法[2]无菌取小鼠腹腔M，经苔盼蓝染色细胞活率90%以上，调整细胞浓度为10.9~10.9/L，接种于多孔培养板中，置含5%CO2、95%空气孵箱中，37℃孵育24h。对照组皆以RPMI—1640完全培养基替代，实验组中加测试药物等处理因素皆以RPMI—1640完全培养基溶解和稀释。
1.5 PKC活性测定
1.5.1 PKC的制备按文献方法[3]操作。
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1.5.2 PKC活性测定：参考文献[4]以反相离子对高效液相色谱法测定。色谱条件：C19柱、流动相：甲醇：磷酸盐缓冲液(21：79V/V，pH6.9，内含6 mmol/LPiCA)、流速l ml/min、检测波长259nm、柱温为室温、0.01AUFS、进样量10~2μl。
1.5.3 蛋白含量测定：按Lowry法测定。
1.5.4 PKC活力定义：一个酶活力单位相当于每分钟使组蛋白Histone(Ⅲ-s)磷酸化而消耗l nmon ATP所需的酶量。
1.6 统计学处理结果以X±s表示，所有结果显著性差异皆以配对资料t检验处理。
2 结果
2.1 APSP对M中PKC总活力的影响以90mg·L-1 APSP—A与M一起孵育不同时间后，测定PKC总活力。结果显示：APSP—A可明显促进小鼠腹腔Mø中PKC总活力的升高，20min达到峰值，至1.5h恢复到基础水平(表1)。实验测得PKC的基础总活力为(210.46±11.09)nmo1·min-1·mg-1(X±s，n=3)。
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2.2 APSP引起小鼠M中胞浆和胞膜PKC活性的影响APSP—A(90mg·L-1)与Mø一起孵育不同时间后，分别测定Mø中胞浆和膜性组分PKC活力，发现20min时，膜性PKC活性达峰值，而胞浆PKC活性达谷值，至1.5 h皆恢复至基础水平。说明APSP在活化Mø内PKC过程中发生膜浆转位(图1)。胞浆和胞膜基础水平分别为(124.63±7.41)nmol·min-1·mg-1和(76.09±5.91)nmol·min-1·mg-1(X±s，n=3)。
3 讨论
生物反应的根本是蛋白磷酸化，而发生蛋白磷酸化的基础是蛋白激酶的激活。PKC是一种Ca2+和磷脂依赖性激酶，通过催化多种靶蛋白发生磷酸化反应，完成细胞对外源性信号的应答。PKC主要以非活性形式存在于胞浆部分，以活性形式结合于细胞膜。当胞内PKC激活时，会发生质膜转位。PKC的活化有多条途径，最主要的途径是接受外来信息后产生DAG，DAG再活化PKC。PKC活性形式即是PKC、DAG、磷脂和Ca2+组成的复合物。
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本实验中，毛木耳多糖能明显增强小鼠腹腔M中PKC的活力，使之发生质膜转位。从PKC活性的表达时间上看，毛木耳多糖在影响M信号传递过程中，增强PKC活性是其发挥作用的下游事件。PKC的活化是激活M中PKC的必备条件，因此，通过增强Mø中RKC活性，从而激活巨噬细胞，是毛耳多糖发挥免疫增强作用的重要途径。
参 考 文 献
1 吴春敏，陈琼华.毛木耳多糖的分离、分析及免疫药理活性的研究，中国药科大学学报，1991，22(2)；97
2 鄂征主编.组织培养技术.北京：人民卫生出版社，1993；195
3 李明春，梁东升许自明等灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶C活性的影响.中国药理学通报，2000，16(1)；36
4 李明春，梁东升，许自明.等反相离子对HPLC法测定细胞中蛋白激酶活性.中国生化药物杂志，1999，20(5)；233, http://www.100md.com