南瓜多糖的组成及摩尔比测定
作者：孔庆胜 蒋滢
单位：孔庆胜(济宁医学院生化教研室 济宁 272013)；蒋滢(苏州医学院)
关键词：南瓜；多糖
中国现代应用药学000222 摘要 目的：研究南瓜多糖的单糖组成及摩尔比。方法：南瓜(Pumpkin)干粉经热水提取,Sevag法弃蛋白，透析，乙醇沉淀，沉 淀干燥物再经Sephadex G-100柱层析纯化，即得南瓜多糖纯品(Pumpkin Polysaccharide, 简称PP)。用聚丙烯酰胺凝胶电泳证明为均一体。结果：凝胶过滤法测其 分子量为1.6×104。PP用酸完全水解，经纸层析表明由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉 伯糖、木糖和D-葡萄糖醛酸组成。其摩尔比分别为0.181∶0.083∶0.069∶0.031∶0.175。 结论：南瓜多糖将有可能作为一种新的高效低毒的降血糖药物。
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Isolation purification of polysaccharide from the pumpkin and the study of its monosaccharide composition
Kong Qingsheng(Kong QS),Jian g Ying(Jiang Y)
(Department of Biochemicstry,Jining Medical Colle ge,Jining′s 272013)
ABSTRACT OBJECTIVE：To investigate PP monosaccharide composition an d determine its molar ratio.METHODS:Form the pumpkin,growing in Shan dong,polysaccharide(PP) was isolated by the methods of hot water extraction,depr oteinization,removal of lipid and Sephadx G-100 chromatography.Some chemical an d physical propoerties of the polysaccharide were examined.The PP was judged to be homogeneous by electrophoresis and its molecular weight was estimated to be 1 .6×104 based on analyses of paper chromatography.RESULTS:The PP w as composed mainly of D-glacose,D-galactose,L-arabinose,xylose and D-glucuro nic aicd in the molar ratios of 0.181∶0.083∶0.069∶0031∶0.175 respectively.CONCLUSION:PP is a prospective drug to lower blood sugar level.
, 百拇医药
KEY WORDS pumpkin,polysaccharide
近10年来，人们发现 从植物中提取多糖具有多方面的生物功能，其中包括对中草药提取的酸性杂多糖的研究。南 瓜作为消渴药在祖国医学典籍中早有记载。但有关其生物活性和化学分析均未见报道。本文 报告了南瓜多糖的提取、纯化和理化分析。
1 方法和结果
1.1 仪器和试剂
岛津双波长薄层扫描仪CS-930,自带DR-2数据处理机，岛津UV -3000型紫外分光光度计，冷冻干燥机。Dextran标准品,Sephadex G-75,Sephadex G-100 和Sephadex G-200(Pharmacia产品)。L-阿拉伯糖，L-鼠李糖和D-葡萄糖醛酸(Sigma产 品)。木糖(E. Merck产品)。岩藻糖(Colnbrook Berks England产品)，D-半乳糖，D-甘露 糖和D-葡萄糖(上海试剂二厂)。
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1.2 PP的提取、分离和纯化
取南瓜 (产自山东济宁，收获期在10月份)干品，粉碎，经甲醇回流，再用热水搅拌煮沸6h，离心后 ，上清液用Sevag法除蛋白，反复数10次，以常水透析48h。适当浓缩，浓缩液加95%乙醇搅 匀，冰箱放置过夜，离心得沉淀物。此沉淀物以水溶解重复醇析一次，然后将沉淀物用75% 乙醇，无水乙醇，乙醚洗涤，冷冻干燥即得南瓜多糖粗品，收率为6.0%。把多糖粗品溶于 0.1mol/L NaCl溶液中，经Sephadex G-100柱层析(4.5×80cm),用0.1mol/L NaCl溶液洗 脱，流速0.7ml/min,用硫酸苯酚法部分收集检测，结果见图1。
图1 Sephadex G-100柱层析分离和纯化PP
收集糖反应阳性高峰部分，扎袋透析72h。透析液减压浓缩至适当体积，再经Sephadex G -100柱层析，用硫酸苯酸法检测，将收集到的多糖单一峰部对蒸馏水透析72h,冰冻干燥， 得南瓜多糖纯品。
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1.3 PP的纯度鉴定
聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度检查 ：聚丙烯胺凝胶浓度为7.5%,缓冲液pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。样品浓度为3.0%，每管进 样30μl,电压110V,电流每管约1mA,电泳1.5和2h。用阿利新蓝8GX染色，结果表明为单一区 带。见图2。
图2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)电泳
A-1.5h；B-3.0h
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度检查，证明PP的纯度 较高。
1.4 PP的理化性质及其组成定量分析
理化性质：PP为棕色粉 末，溶于水，尤易溶于热水。不溶于高浓度的乙醇，丙酮，乙酸乙酯等有机溶剂。其水溶液 呈透明粘稠状，可被2%的CTAB络合沉淀，与碘-碘化钾反应，茚三酮和氨基黑10B反应均为 阴性。
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含量分析：PP用硫酸苯酚法测糖含量为65.4%,硫酸咔唑法测糖醛酸含量为18.6%,PP 的水份为8.4%,灰分为3.8%,紫外光谱在260和280nm处无蛋白质和核酸吸收峰。
1.5 PP的分子量测定
采用凝胶过滤法测定分子量。用0.1mol/L NaCl, 流速3.0ml/h,平衡Sephadex G-200层析柱3d。先用乙知分子量的多糖标准品Dextran T10,T 40,T70,T90各5mg分别流速0.12ml/min,分别相继上柱，用0.1mol/L NaCl洗脱，分部收集， 每管收集1.0ml,用硫酸-苯酚法测定各管糖含量，分别求得洗脱体积Ve。然后再用蓝色葡聚 糖(Dextran T-2000)上柱，求得柱空体积V0,根据Ve/V0值，查标准曲线，测得多糖 的平均分子量为16000。
1.6 PP单糖组分种类分析
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PP中单糖的种类： 称取PP 10.0mg,以1.0mol/L硫酸2.0ml封管，于100℃水解6h,饱和Ba(OH)2水溶液中和，离 心后上清液浓缩供点样用。采用美国Whatman NO.I慢速定性层析滤纸，纸长40cm,展开系统 为醋酸乙酯-吡啶-水=10∶4∶3(V:V:V),上行法展开18h。用标准单糖对照，硝酸银-氢氧 化钠试剂显色，显色后，于80℃加热10min观察，发现PP含有D-葡萄糖，D-半乳糖，L-阿 拉伯糖，木糖，D-葡萄糖醛酸。若以葡萄糖的Rf值为1，则它们的相对Rf值之比为半乳糖-葡萄糖-阿拉伯糖-木糖-葡萄糖酸酸(0.82∶1.00∶1.21 ∶1.53∶2.59)。
PP单糖组分的摩尔比测定：用Shimadzu Dual-Wave Length TLC Sc anner Model CS-930扫描层析图。波长500nm,线性化因子sx=1,色谱，正常直线扫描，选择 吸光度反射法，背景校正，低敏感性，狭缝7×1mm,扫描方向与展开方面平行。得5种单糖的 峰面积。其比值为半乳糖-葡萄糖-阿拉伯糖-木糖-葡萄糖醛酸=15.09∶40.18∶10.73∶ 6.56∶26.44，摩尔比为0.083∶0.181∶0.069∶0.031∶0.175。
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2 讨 论
用本文所述方法提取的PP，收率高，纯度纯 。PP属酸性杂多糖，根据杂多糖的聚阴离子和电离性质，我们选用了Sephadex G-100对PP 进行了分离，纯化，并且用电泳方法对PP的纯度进行了鉴定，证明是单一多糖。大多数杂多 糖是由葡萄糖，甘露糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖和鼠李糖等中的几种单糖组成。PP中含有 半乳糖，葡萄糖，阿拉伯糖，木糖和葡萄糖醛酸，与报道比较符合。南瓜的杂多糖还未见报 道，有关其生物学活性有待今后进一步探讨。
参考文献
1，张岚，任丽娟，顾玉诚.山豆要中性多糖SSA的分离，纯 化和性质.中草药，1993，24(1)∶8.
2，王丁刚，王淑红.茶叶多糖的分离，纯化分析及降血脂作 用.中国药科大学学报，1991，22(4)∶225.
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3，Hikino H,Yoshxana M,Suzuki Y,et al.Is oation and hypoglycemic activity of trichosans A,B,C,D and E,glycans of trichosa nthes kirilowii roots.Planta Med,1989,55(4)∶349.
4，Kiho T,TsWjimura Y,Sakushima M,et al. Polysaccharides in fungi.ⅩⅩⅩⅢ. Hypoglycemic activtyof a n acidicpolyaccharides(AC) from tremella fuciformis.Yakugaku Zasshi,1994,114(5) ∶308.
收稿日期：1999-03-18, http://www.100md.com
单位：孔庆胜(济宁医学院生化教研室 济宁 272013)；蒋滢(苏州医学院)
关键词：南瓜；多糖
中国现代应用药学000222 摘要 目的：研究南瓜多糖的单糖组成及摩尔比。方法：南瓜(Pumpkin)干粉经热水提取,Sevag法弃蛋白，透析，乙醇沉淀，沉 淀干燥物再经Sephadex G-100柱层析纯化，即得南瓜多糖纯品(Pumpkin Polysaccharide, 简称PP)。用聚丙烯酰胺凝胶电泳证明为均一体。结果：凝胶过滤法测其 分子量为1.6×104。PP用酸完全水解，经纸层析表明由D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉 伯糖、木糖和D-葡萄糖醛酸组成。其摩尔比分别为0.181∶0.083∶0.069∶0.031∶0.175。 结论：南瓜多糖将有可能作为一种新的高效低毒的降血糖药物。
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Isolation purification of polysaccharide from the pumpkin and the study of its monosaccharide composition
Kong Qingsheng(Kong QS),Jian g Ying(Jiang Y)
(Department of Biochemicstry,Jining Medical Colle ge,Jining′s 272013)
ABSTRACT OBJECTIVE：To investigate PP monosaccharide composition an d determine its molar ratio.METHODS:Form the pumpkin,growing in Shan dong,polysaccharide(PP) was isolated by the methods of hot water extraction,depr oteinization,removal of lipid and Sephadx G-100 chromatography.Some chemical an d physical propoerties of the polysaccharide were examined.The PP was judged to be homogeneous by electrophoresis and its molecular weight was estimated to be 1 .6×104 based on analyses of paper chromatography.RESULTS:The PP w as composed mainly of D-glacose,D-galactose,L-arabinose,xylose and D-glucuro nic aicd in the molar ratios of 0.181∶0.083∶0.069∶0031∶0.175 respectively.CONCLUSION:PP is a prospective drug to lower blood sugar level.
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KEY WORDS pumpkin,polysaccharide
近10年来，人们发现 从植物中提取多糖具有多方面的生物功能，其中包括对中草药提取的酸性杂多糖的研究。南 瓜作为消渴药在祖国医学典籍中早有记载。但有关其生物活性和化学分析均未见报道。本文 报告了南瓜多糖的提取、纯化和理化分析。
1 方法和结果
1.1 仪器和试剂
岛津双波长薄层扫描仪CS-930,自带DR-2数据处理机，岛津UV -3000型紫外分光光度计，冷冻干燥机。Dextran标准品,Sephadex G-75,Sephadex G-100 和Sephadex G-200(Pharmacia产品)。L-阿拉伯糖，L-鼠李糖和D-葡萄糖醛酸(Sigma产 品)。木糖(E. Merck产品)。岩藻糖(Colnbrook Berks England产品)，D-半乳糖，D-甘露 糖和D-葡萄糖(上海试剂二厂)。
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1.2 PP的提取、分离和纯化
取南瓜 (产自山东济宁，收获期在10月份)干品，粉碎，经甲醇回流，再用热水搅拌煮沸6h，离心后 ，上清液用Sevag法除蛋白，反复数10次，以常水透析48h。适当浓缩，浓缩液加95%乙醇搅 匀，冰箱放置过夜，离心得沉淀物。此沉淀物以水溶解重复醇析一次，然后将沉淀物用75% 乙醇，无水乙醇，乙醚洗涤，冷冻干燥即得南瓜多糖粗品，收率为6.0%。把多糖粗品溶于 0.1mol/L NaCl溶液中，经Sephadex G-100柱层析(4.5×80cm),用0.1mol/L NaCl溶液洗 脱，流速0.7ml/min,用硫酸苯酚法部分收集检测，结果见图1。
图1 Sephadex G-100柱层析分离和纯化PP
收集糖反应阳性高峰部分，扎袋透析72h。透析液减压浓缩至适当体积，再经Sephadex G -100柱层析，用硫酸苯酸法检测，将收集到的多糖单一峰部对蒸馏水透析72h,冰冻干燥， 得南瓜多糖纯品。
, 百拇医药
1.3 PP的纯度鉴定
聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度检查 ：聚丙烯胺凝胶浓度为7.5%,缓冲液pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。样品浓度为3.0%，每管进 样30μl,电压110V,电流每管约1mA,电泳1.5和2h。用阿利新蓝8GX染色，结果表明为单一区 带。见图2。
图2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)电泳
A-1.5h；B-3.0h
通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度检查，证明PP的纯度 较高。
1.4 PP的理化性质及其组成定量分析
理化性质：PP为棕色粉 末，溶于水，尤易溶于热水。不溶于高浓度的乙醇，丙酮，乙酸乙酯等有机溶剂。其水溶液 呈透明粘稠状，可被2%的CTAB络合沉淀，与碘-碘化钾反应，茚三酮和氨基黑10B反应均为 阴性。
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含量分析：PP用硫酸苯酚法测糖含量为65.4%,硫酸咔唑法测糖醛酸含量为18.6%,PP 的水份为8.4%,灰分为3.8%,紫外光谱在260和280nm处无蛋白质和核酸吸收峰。
1.5 PP的分子量测定
采用凝胶过滤法测定分子量。用0.1mol/L NaCl, 流速3.0ml/h,平衡Sephadex G-200层析柱3d。先用乙知分子量的多糖标准品Dextran T10,T 40,T70,T90各5mg分别流速0.12ml/min,分别相继上柱，用0.1mol/L NaCl洗脱，分部收集， 每管收集1.0ml,用硫酸-苯酚法测定各管糖含量，分别求得洗脱体积Ve。然后再用蓝色葡聚 糖(Dextran T-2000)上柱，求得柱空体积V0,根据Ve/V0值，查标准曲线，测得多糖 的平均分子量为16000。
1.6 PP单糖组分种类分析
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PP中单糖的种类： 称取PP 10.0mg,以1.0mol/L硫酸2.0ml封管，于100℃水解6h,饱和Ba(OH)2水溶液中和，离 心后上清液浓缩供点样用。采用美国Whatman NO.I慢速定性层析滤纸，纸长40cm,展开系统 为醋酸乙酯-吡啶-水=10∶4∶3(V:V:V),上行法展开18h。用标准单糖对照，硝酸银-氢氧 化钠试剂显色，显色后，于80℃加热10min观察，发现PP含有D-葡萄糖，D-半乳糖，L-阿 拉伯糖，木糖，D-葡萄糖醛酸。若以葡萄糖的Rf值为1，则它们的相对Rf值之比为半乳糖-葡萄糖-阿拉伯糖-木糖-葡萄糖酸酸(0.82∶1.00∶1.21 ∶1.53∶2.59)。
PP单糖组分的摩尔比测定：用Shimadzu Dual-Wave Length TLC Sc anner Model CS-930扫描层析图。波长500nm,线性化因子sx=1,色谱，正常直线扫描，选择 吸光度反射法，背景校正，低敏感性，狭缝7×1mm,扫描方向与展开方面平行。得5种单糖的 峰面积。其比值为半乳糖-葡萄糖-阿拉伯糖-木糖-葡萄糖醛酸=15.09∶40.18∶10.73∶ 6.56∶26.44，摩尔比为0.083∶0.181∶0.069∶0.031∶0.175。
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用本文所述方法提取的PP，收率高，纯度纯 。PP属酸性杂多糖，根据杂多糖的聚阴离子和电离性质，我们选用了Sephadex G-100对PP 进行了分离，纯化，并且用电泳方法对PP的纯度进行了鉴定，证明是单一多糖。大多数杂多 糖是由葡萄糖，甘露糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖和鼠李糖等中的几种单糖组成。PP中含有 半乳糖，葡萄糖，阿拉伯糖，木糖和葡萄糖醛酸，与报道比较符合。南瓜的杂多糖还未见报 道，有关其生物学活性有待今后进一步探讨。
参考文献
1，张岚，任丽娟，顾玉诚.山豆要中性多糖SSA的分离，纯 化和性质.中草药，1993，24(1)∶8.
2，王丁刚，王淑红.茶叶多糖的分离，纯化分析及降血脂作 用.中国药科大学学报，1991，22(4)∶225.
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3，Hikino H,Yoshxana M,Suzuki Y,et al.Is oation and hypoglycemic activity of trichosans A,B,C,D and E,glycans of trichosa nthes kirilowii roots.Planta Med,1989,55(4)∶349.
4，Kiho T,TsWjimura Y,Sakushima M,et al. Polysaccharides in fungi.ⅩⅩⅩⅢ. Hypoglycemic activtyof a n acidicpolyaccharides(AC) from tremella fuciformis.Yakugaku Zasshi,1994,114(5) ∶308.
收稿日期：1999-03-18, http://www.100md.com