癫痫患儿脑脊液中TNF-α、IL-6含量改变*
作者：方敏 龚非力 白欣立 李震中 李卓娅 阮旭中 熊平 冯纬 姜晓丹 徐勇
单位：方敏 龚非力 李卓娅 熊平 冯纬 姜晓丹 徐勇(同济医科大学基础医学院免疫学教研，武汉 430030)；白欣立(河北医科大学第二医院儿科，石家庄 050000)；李震中 阮旭中(同济医科大学附属同济医院神经内科，武汉 430030)
关键词：癫痫；脑脊液；TNF-α；IL-6
同济医科大学学报000206 摘要：应用免疫PCR方法，对17例癫痫病患儿及39例对照组儿童脑脊液中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)与白细胞介素-6(IL-6)的含量进行了检测。结果发现，癫痫患儿组脑脊液 中TNF-α和IL-6的水平均比对照组明显升高(P<0.01)。结果提示，TNF-α和IL- 6可能参与癫痫的免疫学发病机制。
中图法分类号：R742.1, Q592.5
, 百拇医药
Change of the Levels of Tumor Necrosis Factor-α and the Interleukin-6 in Cerebrospinal Fluid of Epileptic Children
Fang Min Gong Feili
(Department of Immunology，Tongji Medical Universi ty，Wuhan 430030)
Bai Xinli
(Department of Pediatrics, Second Hospital，Hebei Medica l University，Shijiazhuang 050000)
Abstract：By using immuno-PCR technique, the levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-6(1L-6) in cerebrospinal fluid were determined in 17 epileptic children and 39 control children.It was found that the levels of TNF-α and IL-6 in epileptic group were signif icantly lighter than those in control group (P<0.01).The results suggested that TNF-α and IL-6 may play roles in the immunological etiology of epilepsy .
, 百拇医药
Key words：epilepsy； cerebrospinal fluid； TNF-α； IL-6
癫痫是一种病因十分复杂的神经系统临床综合征，其特征为反复发作的大脑神经元异常放电 所致的大脑功能失调。Walk[1]于l969年提出免疫学机制参与癫痫的发病机理。此 后，国内外学者通过建立动物模型，发现癫痫发病与机体的免疫系统功能紊乱有密切关系， 并在鼠、猫等动物体内证实，癫痫发作与抗脑抗体有关。然而，免疫学异常参与癫痫发生的 确切机制尚不清楚。已知通过神经递质和细胞因子介导，中枢神经系统(CNS)和免疫系统 之间存在广泛联系。CNS不仅能产生多种细胞因子，而且CNS内各类组织细胞表面也广泛表达 多种细胞因子受体，如IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-6R、TNF-αR、IFN-γR等。因此， 细胞因子可通过与相应受体结合而影响CNS的功能，并参与某些CNS疾病的发生。
在前期研究中，本课题组借助组织化学与组织原位杂交法，检测癫痫患者手术切除的脑组织 中TNF-α和IL-6的表达水平，发现癫痫患者脑组织中TNF-α、IL-6的表达水平与对照组 相比有明显升高，提示TNF-α、IL-6等细胞因子与癫痫的发生有一定的联系。临床上儿童 期癫痫发生率较高，为观察癫痫患儿脑脊液中TNF-α、IL-6含量是否异常，并探讨细胞因 子参与儿童癫痫发生的机制，本文借助灵敏度极高的免疫PCR方法[2]，检测癫痫患 儿和对照组儿童脑脊液中TNF-α、IL-6水平。结果发现：癫痫患儿与对照组比较，脑脊液 中TNF-α和IL-6水平发生异常改变，从而为阐明癫痫的免疫学发生机制提供了实验依据。
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1 材料与方法
1.1 实验对象
17例癫痫患儿(年龄为1～9岁；男12名，女5名)脑脊液由河北医科大学第二医院儿科提 供；对照组儿童39例均为血液病(无鞘内白血病)鞘内注射时所取脑脊液。
1.2 检测方法
采用免疫PCR(immuno-PCR)方法，检测脑脊液中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor -α，TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)水平，具体方法参照文献[2 ]。
具体实验步骤简述如下：将待测脑脊液样品以及不同稀释度的细跑因子(TNF-α或IL-6) 标准品用碳酸盐缓冲液50 μl(pH 9.6)包被于0.5 ml的Eppendorf管 (4℃过夜)，弃 包 被液，用TBS缓冲液洗3次；再用封闭液300 μl于37 ℃封闭2 h；弃除封闭液，加入抗待测 细胞因子的单克隆抗体(1∶10 000)50 μl，37 ℃孵育1 h后弃除，用TBS洗3次；加生物 素化的兔抗鼠IgG(1∶10 000)50 μl，37℃孵育1 h后弃除，用TBS洗3次；加50 μl链亲 和素(1 ng/ml)，37℃孵育1 h，用TBS洗3次；加50 μl Bio-AdAT(腺病毒六联体基因质 粒)，室温放置3 min，用TBS洗5次；最后每管加25 μl双蒸水和25 μl PCR反应体系及矿物 油，进行PCR扩增反应。
, 百拇医药
PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，71℃ 2 min 25个循环；71℃ 5 m in。扩增产物为300 bp的特异DNA片段。取15 μl PCR产物，在20 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴 化乙锭染色。在紫外灯下用成像仪摄像并借助计算机进行PCR产物定量分析：以细胞因子浓 度为横坐标，PCR产物浓度百分比为纵坐标，作出标准曲线。脑脊液中待测细胞因子浓度依 据PCR结果由标准曲线查出。
1.3 统计学分析
采用t检验分析方法。
2 结果
见表1。
表1 两组脑脊液中TNF-α和IL-6含量
TNF-α(pg/ml)
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IL-6(pg/ml)
n
癫痫患儿组
10.74±1.56**
17.09±3.88**
17
对照组
5.95±1.97
9.2±1.65
39
与对照组相比较 **P<0.01
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由表1可见，癫痫患儿组脑脊液中TNF-α和IL-6均比对照组儿童升高，经统计学分析 ，差异有显著性意义。
3 讨论
免疫系统与神经系统之间存在十分复杂的相互作用：神经系统通过所产生的神经调节因 子(神经递质和神经肽)，能对免疫系统的功能发挥调节作用；同样地，免疫系统所分泌的 免疫调节因子(如细胞因子等)亦能调节特定的神经系统功能。从而，二者构成机体的神经 -免疫系统双相调节网络[3]。存在于脑组织和脑脊液(cerebrospinal fluid，CS F)的免疫调节子(immunoregulator)，可以来源于脑组织本身的小神经胶质细胞(microg lia)和星形胶质细胞(astrocyte)、血液来源的巨噬细胞、穿过血脑屏障的活化T细胞以 及脑血管内皮细胞等。文献报道[4]，在中枢神经系统发生感染性疾病时(如乙型 脑炎、化脓性脑膜炎等)，TNF-α和IL-6的表达水平显著升高，并伴随一系列的神经功能 紊乱。本研究发现，癫痫患儿脑脊液中TNF-α和IL-6水平均较对照组儿童明显升高，提示 此二种细胞因子在癫痫的免疫学发病机制中发挥一定的作用。
, 百拇医药
TNF-α是一种具有广泛生物学效应的细胞因子，除与肿瘤和炎症密切相关外，近年发现 ，TNF-α也可作用于外周与中枢神经系统。Sorkin[4]等的研究表明：应用低浓度 (0.001～0.01 ng/ml)的TNF-α作用于大鼠外周神经，可引起剂量依赖性的快速放电；而T NF-α对中枢神经系统的作用可以是直接的，如引起发热、抑制摄食中枢、促进星形胶质细 胞增殖和分化。另外，TNF-α可通过促进前列腺素PGE2和IL-1的合成而间接发挥作用。 TNF-α在癫痫发病机制中的作用虽不十分清楚，但可以推测：一方面，由于癫痫患者产生 的抗脑抗体导致免疫损伤，引起TNF-α表达和分泌；另一方面，TNF-α水平升高又能促进 神经元的异常放电。
IL-6(亦称B细胞刺激因子-2或B细胞分化因子)可由单核/巨噬细胞等多种细胞产生 ，具有多种重要生物学活性。已发现，IL-6可刺激B细跑分化，促进胸腺T增生及细胞毒性T 细胞分化，增强细胞免疫及体液免疫功能。己证实，IL-6的异常表达和失控与某些自身免 疫病的发生有密切关系。中枢神经系统(CNS)内多种细胞均可产生IL-6。用原位杂交技术 可在大鼠海马区检出IL-6，提示CNS中某些神经元或者胶质细胞具有合成IL-6的能力 [5]，但其 表达水平一般较低。许多病理过程也可影响IL-6的产生。己发现，急性CNS感染时脊液中IL -6的浓度是血清浓度的10～100倍[6]。A1zheimer病及HIV感染时[7]，IL -1及TNF-α可使 小胶质细胞及星型胶质细胞产生IL-6。在癫痫发病中，IL-6的过量表达可能与自身抗脑抗 体 的产生有关。在IL-6转基因小鼠中，IL-6基因过量表达可促进小鼠CNS海马和小脑部位的 星 型胶质细胞明显增生，并出现癫痫发作震颤等征候[8]。本实验结果发现，与对照 组比较，癫痫患儿脑脊液中IL-6含量明显升高，提示IL-6可能参与人类癫痫的发生。
, 百拇医药
总之，本研究借助灵敏度极高的免疫PCR技术，发现癫痫患儿脑脊液中TNF-α和IL-6 水 平较对照组儿童明显升高，提示该二种细胞因子可能参与人类癫痫的发生。本文的研究结果 为Walker提出的癫痫免疫学发病机制学说提供了进一步的实验依据。
国家自然科学基金资助项目(No.3933021)
方敏，男，1966年生，讲师
参考文献
1，Walker A R. Basic mechanism of the epilepsies.Churchill London，196 9, 6:812
2，方敏，龚非力，李卓娅等. 人肿瘤坏死因子-α的免疫PCR检测方法. 同济医 科大学学报，1998, 27(5):35
, http://www.100md.com
3，Carlos R P. Immunoregulators in the nervous system.Neuroscience＆Bi obehavioral Reviews, 1991, 15:185
4，Sorkin L S，Xiao W H，Wanger R et al.Tumor necrosis factor-α induces ectopic activity in nociceptive primary afferent fibers.Neuroscience, 1 992，81: 255
5，Schobitz B，Dorthy A M，Avoorhui S et al.Location of IL-6 RNA and receptor in rat brain. Neurosci Lett， 1992, 136: 189
6，Helfgott D C，Tatter S B，Santhanam U et al. Multiple forms of I FN-β and IL-6 in serum and body fluids during acute bacterial infection. Immu nol, 1989,142:948
, http://www.100md.com
7，Merroll J E， Chen I S. HIV-1，macrophages，glia cells and cytokine s in AIDS nervous system disease. FASEB J，1991,5:2301
8，Campell I L, Oldstone M B A， Mucke L et al. Neurologic disease induced in transgenic mice by the astrocyte-specific expression of IL-6. Soc N eurosci Abstr, 1992,18:206
(收稿：1999-01-13), 百拇医药
单位：方敏 龚非力 李卓娅 熊平 冯纬 姜晓丹 徐勇(同济医科大学基础医学院免疫学教研，武汉 430030)；白欣立(河北医科大学第二医院儿科，石家庄 050000)；李震中 阮旭中(同济医科大学附属同济医院神经内科，武汉 430030)
关键词：癫痫；脑脊液；TNF-α；IL-6
同济医科大学学报000206 摘要：应用免疫PCR方法，对17例癫痫病患儿及39例对照组儿童脑脊液中肿瘤坏死因子-α (TNF-α)与白细胞介素-6(IL-6)的含量进行了检测。结果发现，癫痫患儿组脑脊液 中TNF-α和IL-6的水平均比对照组明显升高(P<0.01)。结果提示，TNF-α和IL- 6可能参与癫痫的免疫学发病机制。
中图法分类号：R742.1, Q592.5
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Change of the Levels of Tumor Necrosis Factor-α and the Interleukin-6 in Cerebrospinal Fluid of Epileptic Children
Fang Min Gong Feili
(Department of Immunology，Tongji Medical Universi ty，Wuhan 430030)
Bai Xinli
(Department of Pediatrics, Second Hospital，Hebei Medica l University，Shijiazhuang 050000)
Abstract：By using immuno-PCR technique, the levels of tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interleukin-6(1L-6) in cerebrospinal fluid were determined in 17 epileptic children and 39 control children.It was found that the levels of TNF-α and IL-6 in epileptic group were signif icantly lighter than those in control group (P<0.01).The results suggested that TNF-α and IL-6 may play roles in the immunological etiology of epilepsy .
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Key words：epilepsy； cerebrospinal fluid； TNF-α； IL-6
癫痫是一种病因十分复杂的神经系统临床综合征，其特征为反复发作的大脑神经元异常放电 所致的大脑功能失调。Walk[1]于l969年提出免疫学机制参与癫痫的发病机理。此 后，国内外学者通过建立动物模型，发现癫痫发病与机体的免疫系统功能紊乱有密切关系， 并在鼠、猫等动物体内证实，癫痫发作与抗脑抗体有关。然而，免疫学异常参与癫痫发生的 确切机制尚不清楚。已知通过神经递质和细胞因子介导，中枢神经系统(CNS)和免疫系统 之间存在广泛联系。CNS不仅能产生多种细胞因子，而且CNS内各类组织细胞表面也广泛表达 多种细胞因子受体，如IL-1R、IL-2R、IL-3R、IL-6R、TNF-αR、IFN-γR等。因此， 细胞因子可通过与相应受体结合而影响CNS的功能，并参与某些CNS疾病的发生。
在前期研究中，本课题组借助组织化学与组织原位杂交法，检测癫痫患者手术切除的脑组织 中TNF-α和IL-6的表达水平，发现癫痫患者脑组织中TNF-α、IL-6的表达水平与对照组 相比有明显升高，提示TNF-α、IL-6等细胞因子与癫痫的发生有一定的联系。临床上儿童 期癫痫发生率较高，为观察癫痫患儿脑脊液中TNF-α、IL-6含量是否异常，并探讨细胞因 子参与儿童癫痫发生的机制，本文借助灵敏度极高的免疫PCR方法[2]，检测癫痫患 儿和对照组儿童脑脊液中TNF-α、IL-6水平。结果发现：癫痫患儿与对照组比较，脑脊液 中TNF-α和IL-6水平发生异常改变，从而为阐明癫痫的免疫学发生机制提供了实验依据。
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1 材料与方法
1.1 实验对象
17例癫痫患儿(年龄为1～9岁；男12名，女5名)脑脊液由河北医科大学第二医院儿科提 供；对照组儿童39例均为血液病(无鞘内白血病)鞘内注射时所取脑脊液。
1.2 检测方法
采用免疫PCR(immuno-PCR)方法，检测脑脊液中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor -α，TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)水平，具体方法参照文献[2 ]。
具体实验步骤简述如下：将待测脑脊液样品以及不同稀释度的细跑因子(TNF-α或IL-6) 标准品用碳酸盐缓冲液50 μl(pH 9.6)包被于0.5 ml的Eppendorf管 (4℃过夜)，弃 包 被液，用TBS缓冲液洗3次；再用封闭液300 μl于37 ℃封闭2 h；弃除封闭液，加入抗待测 细胞因子的单克隆抗体(1∶10 000)50 μl，37 ℃孵育1 h后弃除，用TBS洗3次；加生物 素化的兔抗鼠IgG(1∶10 000)50 μl，37℃孵育1 h后弃除，用TBS洗3次；加50 μl链亲 和素(1 ng/ml)，37℃孵育1 h，用TBS洗3次；加50 μl Bio-AdAT(腺病毒六联体基因质 粒)，室温放置3 min，用TBS洗5次；最后每管加25 μl双蒸水和25 μl PCR反应体系及矿物 油，进行PCR扩增反应。
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PCR反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，71℃ 2 min 25个循环；71℃ 5 m in。扩增产物为300 bp的特异DNA片段。取15 μl PCR产物，在20 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴 化乙锭染色。在紫外灯下用成像仪摄像并借助计算机进行PCR产物定量分析：以细胞因子浓 度为横坐标，PCR产物浓度百分比为纵坐标，作出标准曲线。脑脊液中待测细胞因子浓度依 据PCR结果由标准曲线查出。
1.3 统计学分析
采用t检验分析方法。
2 结果
见表1。
表1 两组脑脊液中TNF-α和IL-6含量
TNF-α(pg/ml)
, http://www.100md.com
IL-6(pg/ml)
n
癫痫患儿组
10.74±1.56**
17.09±3.88**
17
对照组
5.95±1.97
9.2±1.65
39
与对照组相比较 **P<0.01
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由表1可见，癫痫患儿组脑脊液中TNF-α和IL-6均比对照组儿童升高，经统计学分析 ，差异有显著性意义。
3 讨论
免疫系统与神经系统之间存在十分复杂的相互作用：神经系统通过所产生的神经调节因 子(神经递质和神经肽)，能对免疫系统的功能发挥调节作用；同样地，免疫系统所分泌的 免疫调节因子(如细胞因子等)亦能调节特定的神经系统功能。从而，二者构成机体的神经 -免疫系统双相调节网络[3]。存在于脑组织和脑脊液(cerebrospinal fluid，CS F)的免疫调节子(immunoregulator)，可以来源于脑组织本身的小神经胶质细胞(microg lia)和星形胶质细胞(astrocyte)、血液来源的巨噬细胞、穿过血脑屏障的活化T细胞以 及脑血管内皮细胞等。文献报道[4]，在中枢神经系统发生感染性疾病时(如乙型 脑炎、化脓性脑膜炎等)，TNF-α和IL-6的表达水平显著升高，并伴随一系列的神经功能 紊乱。本研究发现，癫痫患儿脑脊液中TNF-α和IL-6水平均较对照组儿童明显升高，提示 此二种细胞因子在癫痫的免疫学发病机制中发挥一定的作用。
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TNF-α是一种具有广泛生物学效应的细胞因子，除与肿瘤和炎症密切相关外，近年发现 ，TNF-α也可作用于外周与中枢神经系统。Sorkin[4]等的研究表明：应用低浓度 (0.001～0.01 ng/ml)的TNF-α作用于大鼠外周神经，可引起剂量依赖性的快速放电；而T NF-α对中枢神经系统的作用可以是直接的，如引起发热、抑制摄食中枢、促进星形胶质细 胞增殖和分化。另外，TNF-α可通过促进前列腺素PGE2和IL-1的合成而间接发挥作用。 TNF-α在癫痫发病机制中的作用虽不十分清楚，但可以推测：一方面，由于癫痫患者产生 的抗脑抗体导致免疫损伤，引起TNF-α表达和分泌；另一方面，TNF-α水平升高又能促进 神经元的异常放电。
IL-6(亦称B细胞刺激因子-2或B细胞分化因子)可由单核/巨噬细胞等多种细胞产生 ，具有多种重要生物学活性。已发现，IL-6可刺激B细跑分化，促进胸腺T增生及细胞毒性T 细胞分化，增强细胞免疫及体液免疫功能。己证实，IL-6的异常表达和失控与某些自身免 疫病的发生有密切关系。中枢神经系统(CNS)内多种细胞均可产生IL-6。用原位杂交技术 可在大鼠海马区检出IL-6，提示CNS中某些神经元或者胶质细胞具有合成IL-6的能力 [5]，但其 表达水平一般较低。许多病理过程也可影响IL-6的产生。己发现，急性CNS感染时脊液中IL -6的浓度是血清浓度的10～100倍[6]。A1zheimer病及HIV感染时[7]，IL -1及TNF-α可使 小胶质细胞及星型胶质细胞产生IL-6。在癫痫发病中，IL-6的过量表达可能与自身抗脑抗 体 的产生有关。在IL-6转基因小鼠中，IL-6基因过量表达可促进小鼠CNS海马和小脑部位的 星 型胶质细胞明显增生，并出现癫痫发作震颤等征候[8]。本实验结果发现，与对照 组比较，癫痫患儿脑脊液中IL-6含量明显升高，提示IL-6可能参与人类癫痫的发生。
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总之，本研究借助灵敏度极高的免疫PCR技术，发现癫痫患儿脑脊液中TNF-α和IL-6 水 平较对照组儿童明显升高，提示该二种细胞因子可能参与人类癫痫的发生。本文的研究结果 为Walker提出的癫痫免疫学发病机制学说提供了进一步的实验依据。
国家自然科学基金资助项目(No.3933021)
方敏，男，1966年生，讲师
参考文献
1，Walker A R. Basic mechanism of the epilepsies.Churchill London，196 9, 6:812
2，方敏，龚非力，李卓娅等. 人肿瘤坏死因子-α的免疫PCR检测方法. 同济医 科大学学报，1998, 27(5):35
, http://www.100md.com
3，Carlos R P. Immunoregulators in the nervous system.Neuroscience＆Bi obehavioral Reviews, 1991, 15:185
4，Sorkin L S，Xiao W H，Wanger R et al.Tumor necrosis factor-α induces ectopic activity in nociceptive primary afferent fibers.Neuroscience, 1 992，81: 255
5，Schobitz B，Dorthy A M，Avoorhui S et al.Location of IL-6 RNA and receptor in rat brain. Neurosci Lett， 1992, 136: 189
6，Helfgott D C，Tatter S B，Santhanam U et al. Multiple forms of I FN-β and IL-6 in serum and body fluids during acute bacterial infection. Immu nol, 1989,142:948
, http://www.100md.com
7，Merroll J E， Chen I S. HIV-1，macrophages，glia cells and cytokine s in AIDS nervous system disease. FASEB J，1991,5:2301
8，Campell I L, Oldstone M B A， Mucke L et al. Neurologic disease induced in transgenic mice by the astrocyte-specific expression of IL-6. Soc N eurosci Abstr, 1992,18:206
(收稿：1999-01-13), 百拇医药