肾上腺素能受体及其亚型在海马调节机体细胞免疫功能中的作用*
作者：邹飞 王阿敬 胡谋先 杨渝珍 张玉芹
单位：邹飞 王阿敬 胡谋先 杨渝珍(同济医科大学实验医学研究中心， 武汉 430030)；张玉芹(武汉冶金科技大学医学院生理教研室，武汉 430030)
关键词：海马；去甲肾上腺素；神经免疫调节
同济医科大学学报000203 摘要：用MTT法测定Con A刺激脾淋巴细胞的增殖活性，研究了在大鼠海马中微量注射去甲肾上腺素(NE)对细胞免疫功能的影响，探讨了α及β受体在此影响中的作用。发现：①海马内微量注射NE对ConA刺激的脾淋巴细胞增殖反应产生抑制效应，此效应能被α及β受体阻断剂酚妥拉明、心得安所阻断。②β、β1及β2受体激动剂异丙基肾上腺素(ISO)、Dobutamine、Metaproterenol均能抑制ConA刺激的脾淋巴细胞增殖反应。心得安可阻断β2受体激动剂的免疫抑制效应。提示：海马内的NE对大鼠细胞免疫功能有抑制效应，此效应由肾上腺素能α及β受体共同介导。
, http://www.100md.com
中图法分类号：R322.81， R972， R338.2
The Role of Adrenoceptor and Its Subtype s of Hippocampus in Regulating Cellular Immune Function
Zou Fei, Wang Ajing, Hu Mouxian et al
Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medic al University, Wuhan 430030
Abstract：The effects of intrahippocampal micro-injection of noradrenaline (NE) on cellul a r immune function was studied in rats and the roles of Alpha and Beta receptors were further investigated by determining the proliferative activity of Con A-st i mulated splenic lymphocytes by using MTT method. The results showed: (1) The pro liferative reaction of Con-stimulated splenic lymphocytes was significantly inh ibited by injection of NE into both sides of hippocampus, which could be inhibit ed by phentolamine and propranolol; (2) ISO, Dobutamine and Metaproterenol all c oud inhibit the proliferation of Con A-stimulated splenic lymphocytes. Proprano lol could blocked the immune inhibitory response caused by β2 receptor excita nt. The results suggested that NE in hippocampus can distinctly inhibit the cell ular immune function, which was mediated by Alpha and Beta adrenoceptors.
, 百拇医药
Key words：hippocampus; noradrenaline; neuroimmunomodulation
自Besedovsky[1]提出神经内分泌免疫网络以来，有关神经与免疫之间的相互影响 得到越来越多理论和实践的证实。海马为边缘系统的主要成分，它除了与情感、情绪、记忆 等有关外，在神经免疫调节中也具有重要的功能[2]。在神经系统与免疫系统的调 控中，神经肽、细胞因子与免疫的关系研究较多，而神经递质，特别是NE与免疫的关系研究 较少，且结果相互矛盾。本实验通过观察在大鼠海马内微量注射NE及其受体阻断剂和激动剂 对大鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响，以明确海马内NE对细胞免疫功能的调节作用及其可能的 作用途径。
1 材料与方法
1.1 材料
实验动物：Wistar大鼠，体重(200±50) g，雌雄不拘，由本校实验动物学部提供。
, 百拇医药
主要试剂：培养液：RPIM1640 (GIBCO，含青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml及10 %灭活的 新生小牛血清)；噻唑蓝(MTT，5 mg/ml， Serva,德国)；二甲亚枫(DMSO，郑州市化学试剂 三厂)；Con A、NE、酚妥拉明、心得安、ISO、Dobutamine、Metaproterenol均为美国Sigma公司产品。
1.2 方法
海马内药物微量注射：100 ml/L水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，将动物置于脑立体定位 仪上，按Pellegrim鼠脑坐标图谱，海马定位为前囟后3.2 mm，中线旁开2.5 mm，颅骨下3 .5 mm，用微量进样器于10 min内双侧海马各注入2 μl下述药物，留针5 min。
注射药物分组：生理盐水(NS) (4 μl)；NE (8 μg/4 μl)；酚妥拉明(10 μg/4 μl)；酚 妥拉明(10 μg/2 μl)+NE(8 μg/2 μl)；心得安(10 μg/4 μl)；ISO(4 μg/4 μl)； 心得安(10 μg/2 μl)+ISO(4 μg/2 μl)，其中注射两种药物时，先注入受体阻断剂，两 药注射相隔5 min。
, 百拇医药
Con A刺激脾淋巴细胞增殖活性的检测：注药后60 min，断头处死动物，无菌取脾，制细胞 悬液，以密度梯度法分离脾单个核细胞，用1640培养液洗2～3遍，计数、调整细胞数至2×1 06个/ml后，加入96孔细胞培养板，100 μl/孔，再加入含10 %小牛血清的1640培养液，50 μl/孔。其中Con A刺激组加入含Con A的1640培养液50 μl/孔(Con A终浓度为10 μ g/ml)，自发增殖对照组加1640培养液50 μl/孔。摇匀，置于含5 % CO2的培养箱中，37 ℃培养48 h后，小心吸弃上清，每孔加入浓度为5 mg/ml的MTT 20 μl，再培养8 h后，离心 (2000 r/min，20 min)，弃上清，每孔加入DMSO 100 μl，37 ℃保温20 min，然后用酶标 仪测定570 nm波长下OD值。Con A刺激组与自发增殖对照组OD值之差，即为Con A刺激脾淋马 细胞净增OD值。
统计学处理：实验结果应用t检验。
, 百拇医药
2 结果
2.1 肾上腺素能受体激动剂的影响
NS组：0.065±0.011 (Con A刺激脾淋巴细胞净增OD值，
±s，下同，n=45 )；NE组：0.049±0.013 (n=28)；ISO组：0.057±0.009 (n=20)；Dobutamine 组：0.047±0.014 (n=20);Metaproterenol组：0.048±0.013 (n=20)。与NS 组比较差别均显著(P<0.05)，Dobutamine组与Metaproternenol组比较无显著性差异。
2.2 肾上腺素能受体阻断剂的影响
酚妥拉明组：0.075±0.011 (n=20)；心得安组：0.084±0.012 (n=20)，与NE 组比较差别非常显著(P<0.01)。
, 百拇医药
2.3 肾上腺素受体阻断剂对激动剂作用的影响
酚妥拉明+NE组：0.068±0.009 (n=20)；心得安+ISO组：0.071±0.012 (n= 20)，与NE组比较差别非常显著(P<0.01)。
3 讨论
已有较多报道，大脑边缘系统的海马结构与免疫功能的调节密切有关。Brook等[3]采用海马电解损毁技术，发现大鼠胸腺细胞和脾细胞Con A增殖反应增强，脾细胞IL-2的生 成增加，提示T细胞功能改变；Sheela Devi等[2]的工作提示海马脑区参与调节机 体非特异性免疫反应；Dunn[4]认为海马是一个兴奋或抑制垂体-肾上腺皮质激素 分泌的整合区，从而引起海马内NE对血浆皮质醇分泌效应的不同差异性，由此可抑制或兴奋 免疫功能。在神经系统对免疫系统的调控中，神经递质对免疫的作用越来越受到人们的关注 。研究表明，苯丙胺诱导的内源性儿茶酚胺释放可明显的抑制淋巴细胞增殖反应，若预先给 予α及β受体阻断剂酚妥拉明、普荼洛尔则抑制儿茶酚胺类递质引起的这种免疫抑制作用 [5]。皮下注射NE可降低外周血CD3+与CD4+ T细胞数目[6]。Itoi等 [7]研究发现在大鼠室旁核微量注射NE，该区域CRF的mRNA水平表达增加，用6-OHDA 损毁大鼠的交感神经后，胸腺中T细胞增殖增强[8]。NE可抑制正常小鼠脾淋巴细胞 由Con A刺激的DNA的合成[9]。这些工作表明NE在调节免疫功能中的作用是非常重 要的。本研究发现，海马内微量注射NE对大鼠细胞免疫功能有抑制效应，此效应能被α及β 受体阻断剂酚妥拉明、心得安所阻断，β、β1及β2受体激动剂ISO、Dobutamine和Met aproterenol均能抑制Con A刺激的脾淋巴细胞增殖反应，且后两者无明显差异。由此可见， 海马内NE可抑制机体的细胞免疫功能，且由α及β受体共同介导，其中β1、β2在此作 用中的差别不明显。至于在整体条件下，以哪一种受体为主，α1和α2受体在此过程的 作用如何，以及上述诸效应是否随药物的剂量和药物作用时间而变，仍有待探讨。
, http://www.100md.com
国家自然科学基金资助项目(N o. 39330210， 39270250)
邹飞，男，1965年生，讲师
参考文献
1，Besedovsky H O, Sorkin E. Network of Immunoneuroendocrine interactio ns. Chin Exp Immunol, 1977, 27: 1
2，Sheela devi R, Namasicayam A. Modulation of non-specific immunity b y hippocampal stimulation. J Neuroimmunol, 1993, 42: 193
3，Brooks W I I, Cross R J. Nauroimmunomodulation: Neurol anatomical ba sis for impairment and facilitation. Ann Neurol, 1982, 12: 56
, http://www.100md.com
4，Dunn J D, Orr S E. Differential plasma corticosterone responses to h ippocampal stimulation. Exp Brain Res, 1984, 54: 1
5，Heiling M, Irwin M. Sympathetic regulation of T-helper cell functio n. Brain Behav Immun, 1993, 7: 154
6，Schedlowski M, Falk A. Catacholamines induce alterations of distribu tion and activity of human natural killer cells. J clin Immunol, 1993, 13: 344[ ZK)〗
7，Itoi K, Suda T. Microinjection of norepinephrine into the paraventri cular nucleus of the hypothalamus stimulates corticotropin-releasing factor gen e expression in conscious rats. Endocrinology, 1994, 15: 2177
, 百拇医药
8，Kendall M D, Shawaf A A. Innervation of the rat thymus gland. Brain Behav Immunol, 1991, 5: 9
9，Cook-Mills J M, Munshi H G, Perlman R L et al. Mouse hepatitis virus infection suppresses modulation of mouse spleen T-cell activation. Immuno logy, 1992, 75: 542
(收稿：1998-12-03)
, http://www.100md.com
单位：邹飞 王阿敬 胡谋先 杨渝珍(同济医科大学实验医学研究中心， 武汉 430030)；张玉芹(武汉冶金科技大学医学院生理教研室，武汉 430030)
关键词：海马；去甲肾上腺素；神经免疫调节
同济医科大学学报000203 摘要：用MTT法测定Con A刺激脾淋巴细胞的增殖活性，研究了在大鼠海马中微量注射去甲肾上腺素(NE)对细胞免疫功能的影响，探讨了α及β受体在此影响中的作用。发现：①海马内微量注射NE对ConA刺激的脾淋巴细胞增殖反应产生抑制效应，此效应能被α及β受体阻断剂酚妥拉明、心得安所阻断。②β、β1及β2受体激动剂异丙基肾上腺素(ISO)、Dobutamine、Metaproterenol均能抑制ConA刺激的脾淋巴细胞增殖反应。心得安可阻断β2受体激动剂的免疫抑制效应。提示：海马内的NE对大鼠细胞免疫功能有抑制效应，此效应由肾上腺素能α及β受体共同介导。
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中图法分类号：R322.81， R972， R338.2
The Role of Adrenoceptor and Its Subtype s of Hippocampus in Regulating Cellular Immune Function
Zou Fei, Wang Ajing, Hu Mouxian et al
Research Center of Experimental Medicine, Tongji Medic al University, Wuhan 430030
Abstract：The effects of intrahippocampal micro-injection of noradrenaline (NE) on cellul a r immune function was studied in rats and the roles of Alpha and Beta receptors were further investigated by determining the proliferative activity of Con A-st i mulated splenic lymphocytes by using MTT method. The results showed: (1) The pro liferative reaction of Con-stimulated splenic lymphocytes was significantly inh ibited by injection of NE into both sides of hippocampus, which could be inhibit ed by phentolamine and propranolol; (2) ISO, Dobutamine and Metaproterenol all c oud inhibit the proliferation of Con A-stimulated splenic lymphocytes. Proprano lol could blocked the immune inhibitory response caused by β2 receptor excita nt. The results suggested that NE in hippocampus can distinctly inhibit the cell ular immune function, which was mediated by Alpha and Beta adrenoceptors.
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Key words：hippocampus; noradrenaline; neuroimmunomodulation
自Besedovsky[1]提出神经内分泌免疫网络以来，有关神经与免疫之间的相互影响 得到越来越多理论和实践的证实。海马为边缘系统的主要成分，它除了与情感、情绪、记忆 等有关外，在神经免疫调节中也具有重要的功能[2]。在神经系统与免疫系统的调 控中，神经肽、细胞因子与免疫的关系研究较多，而神经递质，特别是NE与免疫的关系研究 较少，且结果相互矛盾。本实验通过观察在大鼠海马内微量注射NE及其受体阻断剂和激动剂 对大鼠脾淋巴细胞增殖反应的影响，以明确海马内NE对细胞免疫功能的调节作用及其可能的 作用途径。
1 材料与方法
1.1 材料
实验动物：Wistar大鼠，体重(200±50) g，雌雄不拘，由本校实验动物学部提供。
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主要试剂：培养液：RPIM1640 (GIBCO，含青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml及10 %灭活的 新生小牛血清)；噻唑蓝(MTT，5 mg/ml， Serva,德国)；二甲亚枫(DMSO，郑州市化学试剂 三厂)；Con A、NE、酚妥拉明、心得安、ISO、Dobutamine、Metaproterenol均为美国Sigma公司产品。
1.2 方法
海马内药物微量注射：100 ml/L水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，将动物置于脑立体定位 仪上，按Pellegrim鼠脑坐标图谱，海马定位为前囟后3.2 mm，中线旁开2.5 mm，颅骨下3 .5 mm，用微量进样器于10 min内双侧海马各注入2 μl下述药物，留针5 min。
注射药物分组：生理盐水(NS) (4 μl)；NE (8 μg/4 μl)；酚妥拉明(10 μg/4 μl)；酚 妥拉明(10 μg/2 μl)+NE(8 μg/2 μl)；心得安(10 μg/4 μl)；ISO(4 μg/4 μl)； 心得安(10 μg/2 μl)+ISO(4 μg/2 μl)，其中注射两种药物时，先注入受体阻断剂，两 药注射相隔5 min。
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Con A刺激脾淋巴细胞增殖活性的检测：注药后60 min，断头处死动物，无菌取脾，制细胞 悬液，以密度梯度法分离脾单个核细胞，用1640培养液洗2～3遍，计数、调整细胞数至2×1 06个/ml后，加入96孔细胞培养板，100 μl/孔，再加入含10 %小牛血清的1640培养液，50 μl/孔。其中Con A刺激组加入含Con A的1640培养液50 μl/孔(Con A终浓度为10 μ g/ml)，自发增殖对照组加1640培养液50 μl/孔。摇匀，置于含5 % CO2的培养箱中，37 ℃培养48 h后，小心吸弃上清，每孔加入浓度为5 mg/ml的MTT 20 μl，再培养8 h后，离心 (2000 r/min，20 min)，弃上清，每孔加入DMSO 100 μl，37 ℃保温20 min，然后用酶标 仪测定570 nm波长下OD值。Con A刺激组与自发增殖对照组OD值之差，即为Con A刺激脾淋马 细胞净增OD值。
统计学处理：实验结果应用t检验。
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2 结果
2.1 肾上腺素能受体激动剂的影响
NS组：0.065±0.011 (Con A刺激脾淋巴细胞净增OD值，
±s，下同，n=45 )；NE组：0.049±0.013 (n=28)；ISO组：0.057±0.009 (n=20)；Dobutamine 组：0.047±0.014 (n=20);Metaproterenol组：0.048±0.013 (n=20)。与NS 组比较差别均显著(P<0.05)，Dobutamine组与Metaproternenol组比较无显著性差异。2.2 肾上腺素能受体阻断剂的影响
酚妥拉明组：0.075±0.011 (n=20)；心得安组：0.084±0.012 (n=20)，与NE 组比较差别非常显著(P<0.01)。
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2.3 肾上腺素受体阻断剂对激动剂作用的影响
酚妥拉明+NE组：0.068±0.009 (n=20)；心得安+ISO组：0.071±0.012 (n= 20)，与NE组比较差别非常显著(P<0.01)。
3 讨论
已有较多报道，大脑边缘系统的海马结构与免疫功能的调节密切有关。Brook等[3]采用海马电解损毁技术，发现大鼠胸腺细胞和脾细胞Con A增殖反应增强，脾细胞IL-2的生 成增加，提示T细胞功能改变；Sheela Devi等[2]的工作提示海马脑区参与调节机 体非特异性免疫反应；Dunn[4]认为海马是一个兴奋或抑制垂体-肾上腺皮质激素 分泌的整合区，从而引起海马内NE对血浆皮质醇分泌效应的不同差异性，由此可抑制或兴奋 免疫功能。在神经系统对免疫系统的调控中，神经递质对免疫的作用越来越受到人们的关注 。研究表明，苯丙胺诱导的内源性儿茶酚胺释放可明显的抑制淋巴细胞增殖反应，若预先给 予α及β受体阻断剂酚妥拉明、普荼洛尔则抑制儿茶酚胺类递质引起的这种免疫抑制作用 [5]。皮下注射NE可降低外周血CD3+与CD4+ T细胞数目[6]。Itoi等 [7]研究发现在大鼠室旁核微量注射NE，该区域CRF的mRNA水平表达增加，用6-OHDA 损毁大鼠的交感神经后，胸腺中T细胞增殖增强[8]。NE可抑制正常小鼠脾淋巴细胞 由Con A刺激的DNA的合成[9]。这些工作表明NE在调节免疫功能中的作用是非常重 要的。本研究发现，海马内微量注射NE对大鼠细胞免疫功能有抑制效应，此效应能被α及β 受体阻断剂酚妥拉明、心得安所阻断，β、β1及β2受体激动剂ISO、Dobutamine和Met aproterenol均能抑制Con A刺激的脾淋巴细胞增殖反应，且后两者无明显差异。由此可见， 海马内NE可抑制机体的细胞免疫功能，且由α及β受体共同介导，其中β1、β2在此作 用中的差别不明显。至于在整体条件下，以哪一种受体为主，α1和α2受体在此过程的 作用如何，以及上述诸效应是否随药物的剂量和药物作用时间而变，仍有待探讨。
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国家自然科学基金资助项目(N o. 39330210， 39270250)
邹飞，男，1965年生，讲师
参考文献
1，Besedovsky H O, Sorkin E. Network of Immunoneuroendocrine interactio ns. Chin Exp Immunol, 1977, 27: 1
2，Sheela devi R, Namasicayam A. Modulation of non-specific immunity b y hippocampal stimulation. J Neuroimmunol, 1993, 42: 193
3，Brooks W I I, Cross R J. Nauroimmunomodulation: Neurol anatomical ba sis for impairment and facilitation. Ann Neurol, 1982, 12: 56
, http://www.100md.com
4，Dunn J D, Orr S E. Differential plasma corticosterone responses to h ippocampal stimulation. Exp Brain Res, 1984, 54: 1
5，Heiling M, Irwin M. Sympathetic regulation of T-helper cell functio n. Brain Behav Immun, 1993, 7: 154
6，Schedlowski M, Falk A. Catacholamines induce alterations of distribu tion and activity of human natural killer cells. J clin Immunol, 1993, 13: 344[ ZK)〗
7，Itoi K, Suda T. Microinjection of norepinephrine into the paraventri cular nucleus of the hypothalamus stimulates corticotropin-releasing factor gen e expression in conscious rats. Endocrinology, 1994, 15: 2177
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8，Kendall M D, Shawaf A A. Innervation of the rat thymus gland. Brain Behav Immunol, 1991, 5: 9
9，Cook-Mills J M, Munshi H G, Perlman R L et al. Mouse hepatitis virus infection suppresses modulation of mouse spleen T-cell activation. Immuno logy, 1992, 75: 542
(收稿：1998-12-03)
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