组胺对脑细胞内游离钙浓度的影响及其机制
作者：吕华瑞 侯玉立 汤允昭
单位：吕华瑞(山西医科大学药理学教研室 太原 030001)；侯玉立(山西医科大学第一临床医学院神经内科)；汤允昭(山西医科大学药理学教研室 太原 030001)
关键词：组胺；脑；细胞内游离钙；Fura-2；异丙嗪
山西医科大学学报000206 摘要： 目的 观察组胺对脑细胞内游离钙浓度的影响，并初步探讨其作用机制。方法 利用荧光探针Fura-2测定乳鼠脑细胞内游离钙的浓度。结果 组胺可明显升高脑细胞内游离钙浓度，而异丙嗪可以阻断组胺的这一效应。结论 组胺升高脑细胞内游离钙浓度是由H1受体介导的。
中图分类号： R962 文献标识码： A
文章编号：1007-6611(2000)02-0107-02
, http://www.100md.com
Effect of histamine on free intracellular calcium in isolated neonatal rat brain cells
Lü Huarui,Hou Yuli,Tang Yunzhao
(Dept. of pharmacology,Shanxi Medical University，Taiyuan 030001)
Abstract: Objective To study the effect of histamine on free intracellular calcium in isolated neonatal rat brain cells and its possible mechanism.Method The Ca2+-sensitive fluorescence indicator Fura-2 was used.Results Histamine(0.1～0.3 mmol/L) improved [Ca2+]i by 37.17%，66.99% and 94.29%,respectively.This effect of histamine on [Ca2+]i was completely antagonized by promethazine(0.1 mmol/L).Conclusion These results suggest that histamine can elevate [Ca2+]i and may be relate to the brain ischemic injure,whereas promethazine can antagonize the increase of [Ca2+]i induced by histamine.
, 百拇医药
Key words: histamine; brain; intracellular free calcium; Fura-2; promethazine
组胺是一种神经递质或调质[1]。它对诸多生理功能的调节是由H1、H2和H3受体介导的。其中H1受体效应与细胞内游离钙浓度的变化密切相关，中间偶联环节是肌醇脂质信号系统。很多报道都证实了H1受体可通过磷酸肌醇代谢激活介导细胞内游离钙浓度的升高，相关资料大都是在体外培养细胞株上获得的，如UC-11MG星形细胞，星形细胞瘤细胞、BC3H-1肌肉细胞株、血管内皮细胞株等。但也有学者提出组胺引起的细胞内游离钙浓度升高是由H2受体介导的[2]。本文利用从新生大鼠乳鼠分离的神经细胞观察组胺对细胞内钙浓度的影响并初步探讨其与H1受体的关系。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 药品与试剂 Fura-2/AM为中国医科院药物所产品，用二甲亚砜溶解为1 mmol/L的贮备液，分装备用；组胺为北京药品生物制品检定所产品，批号22(7)；异丙嗪为江苏金坛制药厂产品，批号950103；胰蛋白酶、EGTA、HEPES、DMEM等皆为Sigma公司产品，余试剂为市售分析纯。
1.2 细胞悬液的制备 参考Dildy的方法[3]，取新生1～3 d的Wistar大鼠乳鼠，剥离全脑，立即置于冰Hank液(mmol/L):NaCl137;CaCl21.3；KCl5.0；MgSO4*7H2O 0.8；Na2HPO4 0.5；KH2PO40.4；NaHCO33.0；Glucose 5.6；HEPES20；pH7.4中，仔细剥离剔除软脑膜及血管，用Hank液冲洗2次，剪碎置于一定量的0.125%胰蛋白酶中于37 ℃消化10 min，用含0.2%牛血清白蛋白的冰DMEM培养基终止消化，用吸管轻轻吹打分散细胞，过200目筛网，滤液以1 000 r/min离心5 min，再以Hank液洗2次，最后用含0.2%牛血清白蛋白的DMEM培养基制成悬液。0.4%台盼蓝排斥试验检查细胞存活率在90%以上即可进行Fura-2/AM的负载。
, 百拇医药
1.3 Fura-2的负载及荧光测定 上述细胞悬液在37 ℃预温5 min后，加入Fura-2/AM(终浓度为5 μmol/L)37℃恒温振荡45 min。负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的温Hank液洗涤2次，最后调整细胞悬液为每毫升2×106个细胞。测前细胞先于37 ℃复温2 min。荧光测定采用日本岛津RF-5000型双波长荧光分光光度计，设定条件，电脑自动输出Ca2+浓度值(单位：nmol/L)。
1.4 统计处理 实验结果均以均数±标准差(
±s)表示。两样本均数间比较用t检验，多组样本均数间比较用方差分析。
2 结果
2.1 静息状态下[Ca2+]i 在细胞外钙浓度为1.3 mmol/L情况下，[Ca2+]i为(159.93±14.32) nmol/L，与文献报道接近[3]。
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2.2 不同浓度组胺对[Ca2+]i的影响 细胞外钙1.3 mmol/L条件下，组胺终浓度0.1、0.2、0.3 mmol/L分别使[Ca2+]i增加到(219.37±21.47)nmol/L、(267.07±25.83)nmol/L、(310.73±29.11) nmol/L，增加幅度分别为37.17%、66.99%、94.29%(P<0.05)。
2.3 异丙嗪对组胺引起的[Ca2+]i增高的影响 异丙嗪(0.1 mmol/L)即可几乎完全阻断组胺(0.3 mmol/L)升高[Ca2+]i的效应，[Ca2+]i由(310.73±29.11)nmol/L降至(163.26±12.77) nmol/L(P<0.05)。
3 讨论
本文参照李明等[4]的方法采用胰蛋白酶消化法制备新生Wistar大鼠脑细胞，对细胞损伤作用小，分离出的细胞经台盼蓝排斥试验检查存活率在90%以上，运用此神经细胞悬液利用Fura-2技术测定[Ca2+]i方法可行，结果可靠。
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组胺是磷酯酰肌醇代谢的激活物[5，6]，很多学者的研究工作证实组胺H1受体激活通过G蛋白耦联的磷脂酶C[7]可以分解磷酯酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)成甘油三酯(DG)和三磷酸肌醇(IP3)而使胞内钙浓度升高。这一升高既有胞内钙动员也有胞外钙内流的成分且可被H1受体拮抗剂阻断。IP3被认为是第二信使，是胞内钙动员的激发物质，IP3与其受体结合开放钙通道，使贮存在内质网/肌浆网中的钙释放入胞浆。另有一些学者认为IP3单独[8，9]或与其代谢物IP4[10]一起可以开放细胞膜上敏感的钙通道促进胞外钙的内流。由此可见，组胺既可通过IP3诱导胞内钙释放又可通过胞外钙内流引起[Ca2+]i的升高。本实验利用分离的乳鼠脑细胞观察了组胺对胞内游离钙浓度的影响，结果显示组胺也可以升高脑细胞内游离钙浓度，而且此作用可被H1受体拮抗剂—异丙嗪完全阻断，说明在乳鼠脑细胞上组胺升高[Ca2+]i是通过H1受体介导的，也就是说是通过IP3诱导完成的，至于这一效应究竟是与IP3诱导的钙动员抑或是钙内流分别有关或两者都参与，尚待进一步研究证实。
, 百拇医药
近年来一些研究表明[11，12]组胺在缺血性脑损伤的发生发展中有一定的作用，而这些作用与脑细胞内Ca2+浓度升高有密切关系，故使人联想到H1受体阻断剂抗脑缺血损伤的可能性，这一设想也需进一步加以证实。
作者简介：吕华瑞，男，1973年2月生，硕士，助教
参考文献：
[1] Oishi R,Nishibori M，Saeki K.Regional differences in the turnover of neuronal histamine in the rat brain[J].Life Sci,1984,34:691.
[2] Muramatsu I,Noda M,Nishio M,et al.Histamine increases the Ca2+ current in guinea-pig ventricular myocytes[J].Eur J Pharmacol,1987,138:269.
, http://www.100md.com
[3] Dildy JE,Leslie SW.Ethanol inhibits NMDA-induced increase in free intracellular Ca2+ in dissociated brain cells[J].Brain Res,1989,499:383.
[4] 李明，王峻峰，韩济生，等.应用Fura-2/AM检验分离的神经细胞内游离钙及其变化[J].药学学报，1991，26(12)：890.
[5] Arbones L,Picatoste F,Garcia A.Histamine H1-receptors mediate phosphoinositide hydrolysis in astrocyte-enriched primary cultures[J].Brain Res,1988,450:144.
, 百拇医药 [6] White TE,Dickenson JM,Hill SJ.Histamine H1-receptors-mediated inositol phospholipid hydrolysis in DDT1MF-2 cells:agonist and antagonist properties[J].Br J Pharmacol,1993,108:196.
[7] Bloyney LM,Newby AC.Histamine and a guanine nucleotide increase calcium permeability in pig aortic microsomal fractions[J].Biochem J,1990,267:105.
[8] Kuno M,Gardner P.Ion channels activated by inositol-1,4,5-triphosphate in plasma membrane of human T-lymphocytes[J].Nature,1987,326:301.
, http://www.100md.com
[9] Penner R,Matthews G,Neher E.Regulation of calcium influx by second messengers in rat mast cells[J].Nature,1988,334:499.
[10]Irvine RF,Moor RM.Micro-injection of inositol-1,3,4,5-tetrakisphosphate activates sea urchin eggs by a mechanism dependent on external Ca2+ [J].Biochem J,1986,240:917.
[11]Schilling L,Wahl M.Opening of the blood-brain barrier during cortical superfusion with histamine[J].Brain Res,1994,653:289.
[12]Adachi N,Oishi R,Itano Y,et al.Aggrevation of ischemic neuronal damage in the rat hippocampus by impairment of histaminergic neurotransmission[J].Brain Res,1993,602:165.
收稿日期：1999-11-22, 百拇医药
单位：吕华瑞(山西医科大学药理学教研室 太原 030001)；侯玉立(山西医科大学第一临床医学院神经内科)；汤允昭(山西医科大学药理学教研室 太原 030001)
关键词：组胺；脑；细胞内游离钙；Fura-2；异丙嗪
山西医科大学学报000206 摘要： 目的 观察组胺对脑细胞内游离钙浓度的影响，并初步探讨其作用机制。方法 利用荧光探针Fura-2测定乳鼠脑细胞内游离钙的浓度。结果 组胺可明显升高脑细胞内游离钙浓度，而异丙嗪可以阻断组胺的这一效应。结论 组胺升高脑细胞内游离钙浓度是由H1受体介导的。
中图分类号： R962 文献标识码： A
文章编号：1007-6611(2000)02-0107-02
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Effect of histamine on free intracellular calcium in isolated neonatal rat brain cells
Lü Huarui,Hou Yuli,Tang Yunzhao
(Dept. of pharmacology,Shanxi Medical University，Taiyuan 030001)
Abstract: Objective To study the effect of histamine on free intracellular calcium in isolated neonatal rat brain cells and its possible mechanism.Method The Ca2+-sensitive fluorescence indicator Fura-2 was used.Results Histamine(0.1～0.3 mmol/L) improved [Ca2+]i by 37.17%，66.99% and 94.29%,respectively.This effect of histamine on [Ca2+]i was completely antagonized by promethazine(0.1 mmol/L).Conclusion These results suggest that histamine can elevate [Ca2+]i and may be relate to the brain ischemic injure,whereas promethazine can antagonize the increase of [Ca2+]i induced by histamine.
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Key words: histamine; brain; intracellular free calcium; Fura-2; promethazine
组胺是一种神经递质或调质[1]。它对诸多生理功能的调节是由H1、H2和H3受体介导的。其中H1受体效应与细胞内游离钙浓度的变化密切相关，中间偶联环节是肌醇脂质信号系统。很多报道都证实了H1受体可通过磷酸肌醇代谢激活介导细胞内游离钙浓度的升高，相关资料大都是在体外培养细胞株上获得的，如UC-11MG星形细胞，星形细胞瘤细胞、BC3H-1肌肉细胞株、血管内皮细胞株等。但也有学者提出组胺引起的细胞内游离钙浓度升高是由H2受体介导的[2]。本文利用从新生大鼠乳鼠分离的神经细胞观察组胺对细胞内钙浓度的影响并初步探讨其与H1受体的关系。
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1 材料和方法
1.1 药品与试剂 Fura-2/AM为中国医科院药物所产品，用二甲亚砜溶解为1 mmol/L的贮备液，分装备用；组胺为北京药品生物制品检定所产品，批号22(7)；异丙嗪为江苏金坛制药厂产品，批号950103；胰蛋白酶、EGTA、HEPES、DMEM等皆为Sigma公司产品，余试剂为市售分析纯。
1.2 细胞悬液的制备 参考Dildy的方法[3]，取新生1～3 d的Wistar大鼠乳鼠，剥离全脑，立即置于冰Hank液(mmol/L):NaCl137;CaCl21.3；KCl5.0；MgSO4*7H2O 0.8；Na2HPO4 0.5；KH2PO40.4；NaHCO33.0；Glucose 5.6；HEPES20；pH7.4中，仔细剥离剔除软脑膜及血管，用Hank液冲洗2次，剪碎置于一定量的0.125%胰蛋白酶中于37 ℃消化10 min，用含0.2%牛血清白蛋白的冰DMEM培养基终止消化，用吸管轻轻吹打分散细胞，过200目筛网，滤液以1 000 r/min离心5 min，再以Hank液洗2次，最后用含0.2%牛血清白蛋白的DMEM培养基制成悬液。0.4%台盼蓝排斥试验检查细胞存活率在90%以上即可进行Fura-2/AM的负载。
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1.3 Fura-2的负载及荧光测定 上述细胞悬液在37 ℃预温5 min后，加入Fura-2/AM(终浓度为5 μmol/L)37℃恒温振荡45 min。负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的温Hank液洗涤2次，最后调整细胞悬液为每毫升2×106个细胞。测前细胞先于37 ℃复温2 min。荧光测定采用日本岛津RF-5000型双波长荧光分光光度计，设定条件，电脑自动输出Ca2+浓度值(单位：nmol/L)。
1.4 统计处理 实验结果均以均数±标准差(
±s)表示。两样本均数间比较用t检验，多组样本均数间比较用方差分析。2 结果
2.1 静息状态下[Ca2+]i 在细胞外钙浓度为1.3 mmol/L情况下，[Ca2+]i为(159.93±14.32) nmol/L，与文献报道接近[3]。
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2.2 不同浓度组胺对[Ca2+]i的影响 细胞外钙1.3 mmol/L条件下，组胺终浓度0.1、0.2、0.3 mmol/L分别使[Ca2+]i增加到(219.37±21.47)nmol/L、(267.07±25.83)nmol/L、(310.73±29.11) nmol/L，增加幅度分别为37.17%、66.99%、94.29%(P<0.05)。
2.3 异丙嗪对组胺引起的[Ca2+]i增高的影响 异丙嗪(0.1 mmol/L)即可几乎完全阻断组胺(0.3 mmol/L)升高[Ca2+]i的效应，[Ca2+]i由(310.73±29.11)nmol/L降至(163.26±12.77) nmol/L(P<0.05)。
3 讨论
本文参照李明等[4]的方法采用胰蛋白酶消化法制备新生Wistar大鼠脑细胞，对细胞损伤作用小，分离出的细胞经台盼蓝排斥试验检查存活率在90%以上，运用此神经细胞悬液利用Fura-2技术测定[Ca2+]i方法可行，结果可靠。
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组胺是磷酯酰肌醇代谢的激活物[5，6]，很多学者的研究工作证实组胺H1受体激活通过G蛋白耦联的磷脂酶C[7]可以分解磷酯酰肌醇-4，5-二磷酸(PIP2)成甘油三酯(DG)和三磷酸肌醇(IP3)而使胞内钙浓度升高。这一升高既有胞内钙动员也有胞外钙内流的成分且可被H1受体拮抗剂阻断。IP3被认为是第二信使，是胞内钙动员的激发物质，IP3与其受体结合开放钙通道，使贮存在内质网/肌浆网中的钙释放入胞浆。另有一些学者认为IP3单独[8，9]或与其代谢物IP4[10]一起可以开放细胞膜上敏感的钙通道促进胞外钙的内流。由此可见，组胺既可通过IP3诱导胞内钙释放又可通过胞外钙内流引起[Ca2+]i的升高。本实验利用分离的乳鼠脑细胞观察了组胺对胞内游离钙浓度的影响，结果显示组胺也可以升高脑细胞内游离钙浓度，而且此作用可被H1受体拮抗剂—异丙嗪完全阻断，说明在乳鼠脑细胞上组胺升高[Ca2+]i是通过H1受体介导的，也就是说是通过IP3诱导完成的，至于这一效应究竟是与IP3诱导的钙动员抑或是钙内流分别有关或两者都参与，尚待进一步研究证实。
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近年来一些研究表明[11，12]组胺在缺血性脑损伤的发生发展中有一定的作用，而这些作用与脑细胞内Ca2+浓度升高有密切关系，故使人联想到H1受体阻断剂抗脑缺血损伤的可能性，这一设想也需进一步加以证实。
作者简介：吕华瑞，男，1973年2月生，硕士，助教
参考文献：
[1] Oishi R,Nishibori M，Saeki K.Regional differences in the turnover of neuronal histamine in the rat brain[J].Life Sci,1984,34:691.
[2] Muramatsu I,Noda M,Nishio M,et al.Histamine increases the Ca2+ current in guinea-pig ventricular myocytes[J].Eur J Pharmacol,1987,138:269.
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[3] Dildy JE,Leslie SW.Ethanol inhibits NMDA-induced increase in free intracellular Ca2+ in dissociated brain cells[J].Brain Res,1989,499:383.
[4] 李明，王峻峰，韩济生，等.应用Fura-2/AM检验分离的神经细胞内游离钙及其变化[J].药学学报，1991，26(12)：890.
[5] Arbones L,Picatoste F,Garcia A.Histamine H1-receptors mediate phosphoinositide hydrolysis in astrocyte-enriched primary cultures[J].Brain Res,1988,450:144.
, 百拇医药 [6] White TE,Dickenson JM,Hill SJ.Histamine H1-receptors-mediated inositol phospholipid hydrolysis in DDT1MF-2 cells:agonist and antagonist properties[J].Br J Pharmacol,1993,108:196.
[7] Bloyney LM,Newby AC.Histamine and a guanine nucleotide increase calcium permeability in pig aortic microsomal fractions[J].Biochem J,1990,267:105.
[8] Kuno M,Gardner P.Ion channels activated by inositol-1,4,5-triphosphate in plasma membrane of human T-lymphocytes[J].Nature,1987,326:301.
, http://www.100md.com
[9] Penner R,Matthews G,Neher E.Regulation of calcium influx by second messengers in rat mast cells[J].Nature,1988,334:499.
[10]Irvine RF,Moor RM.Micro-injection of inositol-1,3,4,5-tetrakisphosphate activates sea urchin eggs by a mechanism dependent on external Ca2+ [J].Biochem J,1986,240:917.
[11]Schilling L,Wahl M.Opening of the blood-brain barrier during cortical superfusion with histamine[J].Brain Res,1994,653:289.
[12]Adachi N,Oishi R,Itano Y,et al.Aggrevation of ischemic neuronal damage in the rat hippocampus by impairment of histaminergic neurotransmission[J].Brain Res,1993,602:165.
收稿日期：1999-11-22, 百拇医药