海洋生物中蛋白质、肽类毒素的研究新进展
作者：傅余强 顾谦群 方玉春 管华诗
单位：傅余强 顾谦群 方玉春 管华诗(青岛海洋大学海洋药物与食品研究所，青岛 266003)
关键词：毒素，蛋白质，肽，芋螺毒素，海葵毒素，水母毒素，头足毒素，海胆毒素，鱼卵毒素，海蛇毒素，海兔毒素，鱼 工鱼毒素，微囊藻素
中国海洋药物000215 摘要 报道了海洋生物中蛋白质、肽类毒素，主要是芋螺毒素和海葵毒素的近三年最新研究进展；对它们的结构、药理和构效关系进行概述。
海洋生物中存在着种类众多的蛋白质、肽类毒素，这些毒素性质独特，它们在生物医药、分子生物学的研究和应用方面有广阔前景。本文主要报道了芋螺毒素和海葵毒素近三年最新研究进展，其它几种毒素研究较少，所以做简要概述。
1 芋螺毒素(Conotoxin CTX)
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芋螺毒素是研究热点之一，它们是一类由10～30余个基氨酸残基组成的小肽，含两对或三对二硫键，是迄今发现的最小核酸编码的动物神经肽毒素。按其作用部位分为α、ω、μ、δ等亚型，每种亚型仍可细分。α-CTX作用于神经突触后乙酰胆碱受体(AChR)，起阻断作用；ω-CTX专一阻断神经末梢突触前电压敏感型Ca2+通道；μ-CTX在活化相起作用，专一抑制电压敏感型Na+通道；δ-CTX专一作用于电压敏感型Na+通道，在非活化相起作用，延长动作电位持续时间。芋螺毒素结合在神经和肌肉的受体上，具有“高亲和力、高度专一”特点，是神经科学十分有效的探针[2，3]。临床上用作特异诊断试剂，作为镇痛药具有疗效确切、不成瘾特点。数种芋螺毒素已申请美国专利。目前的最新质谱技术可精确测定仅1～2pmol芋螺肽的分子量和初级结构，甚至不经层析分离就可以分析混合物[4]。因此芋螺毒素的研究进展很快，除了发展几种新芋螺毒素外，对毒素的高级结构、药理和构效关系也进行了大量研究工作。
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1.1 新发现的几种芋螺毒素
新发现的几种芋螺毒素在一级结构上各具特点，并与其独特的生理活性相关。England等[5]从地纹芋螺(Conus geographus)中分离得到δ-CTX GVⅢA，它是富含GLy和Thr的41肽，是迄今发现的芋螺毒素分子中最大的一个。δ-CTX GVⅢA能使5-羟色胺(5-HT3)受体通道失活(0.25mg/ml)。第34位为极罕见的L-6-Br-色氨酸，而内源性的5-HT3受体的配体是羟基色氨酸，所以L-6-Br-色氨酸是该毒素的功能决定因子。shon等[6]从Conus purpuracens中分离出Ψ-CTX PⅢE，它是一种麻痹肽。Ψ-CTX PⅢE有特殊的作用机制,它能使电鳐肌肉内的发电细胞活动衰减100%(10μmol/L)和80%(1μmol/L)，表明Ψ-CTX PⅢE抑制骨骼肌的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)，但不与α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin)竞争作用位点，因此该毒素非竞争性结合nAChR。Loughnan等[7]从食鱼芋螺(Conus episcopatus)中分离得到α-CTX EPⅠ，其结构中第15位是磺化酪氨酸，这是磺酸基首次在芋螺毒素中发现。α-CTX EPⅠ能竞争性抑制牛肾上腺嗜铬细胞(神经AChR)由烟碱诱导的几茶酚胺的释放，而对大鼠膈神经nerve-diaphragm无影响。EPⅠ还能部分抑制离体大鼠心内神经节副交感神经元的活动，表明EPⅠ选择性地抑制AChR制的α3β2和α3β4亚基。
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1.2 结构、药理和构效关系
对CTX的结构、药理和构效关系的研究主要集中在α、ω-CTX上，对其它亚型研究较少。利用二维NMR、CD 及X-射线晶体衍射等手段着重研究了它们的空间结构、构效关系及其与受体的特异结合性质。
1.2.1 α-CTX
Gehrmann等[8]研究了α-CTX GⅠ二硫键三种连接形式，通过NMR方法发现天然型的α-CTX GⅠ(2-7、3-13)最完美。在5位和11位氨基酸残基之间主要是一个扭曲的310-螺旋结构。构效关系表明二硫键对于毒素无论是结构还是稳定性均起关键作用。Maslennikon等[9]利用二维NMR分析α-CTX GⅠ在水中的空间构型。发现α-CTX GⅠ呈现两种可以相互转化的拓扑异构体，出现概率分别为78%和22%。它们的共同特征是：存在Asn4-Cys7的β-折角；在Gly8到Tyrll之间出现概率大的构型呈右手螺旋，出现概率小的构型呈线性状态。Rogers等[10]研究了α-CTX ⅠMⅠ的溶液结构，它的特点是由两个二硫键形成两个紧密的环(loop)，形成被一深裂隔离的两个亚区域。第一个环中的两个310-螺旋与第二个环通过C-末端β-折角相连。两个二硫键与Ala9形成一个牢固的疏水核心，其余氨基酸伸向表面。Hu等[11]利用X-射线晶体衍射技术研究了α-CΤΧ ΡnⅠB的晶体结构，并与α-CTX PNⅠA、GⅠ的结构做了比较。Pn I B是斜方晶，属于P212121空间结构。Shon等[12]利用二维HNMR谱确定了α-CTX MⅡ水溶液的三维结构，发现了14种具有最低能量的结构。总体结构是围绕二硫键的α螺旋，分子表面可分为两部分，分别由疏水性和亲水性氨基酸残基组成，这种结构特点可能在专一性亚基识别时起重要作用。Ashcom等[13](1997)用荧光素标记于α-CTX GI(FGI)的N-末端，利用旋转柱(spin-column)技术，发现FGI与电鳐发电器官nAChR的结合是独特的剂量依赖型的紧密结合，毒素结合在受体的一个位点上，有饱和性质，解离常数KD为41.3±8.2nmol/L。Quiram等[14]研究了α-CTX IMI的构效关系。它的Asp5所带的负电荷及其适宜的侧链长度是毒素活性所必需的，而Arg7所带的正电荷及其适宜的大小也是毒素活性所必需的。Tyr-10芳香侧链也是活性必需基团，其余4个氨基酸残基被取代后毒素的结合能力未有显著变化。Groeb等[15]研究了α-CTX GI和SI与nAChR的肌肉亚型结合时的决定因子，结果表明α-CTX GI和SI的9、10位均参与受体中的种属和亚基依赖型的相互作用。Hann等[16]发现α-CTX GI中，Arg9残基对毒素特异性地与放电器官的nAChR的α、γ兴奋位点结合起关键作用。当α-CTX GI中Arg9被Pro取代后对nAChR的α、γ不表现特异性而类似α-CTX SI；α-CTX GSⅠ中的Pro9被Arg取代后，则表现出类似α-CTX GI的特异性。据此推测GI的两个阳离子中心即N-端的氨基和Arg9 的胍基直接与nAChR作用。Harvey等[17]研究了α-CTX MⅡ对神经nAChR的α3β2亚基的专一亲和决定因子。α3亚基的决定因子位于序列121～181和181～195，在序列181～195上Lys185和Ile188在该决定因子中起重要作用；β2亚基的决定因子位于序列1～54、54～63和63～80，在序列54～63上Thr59在该决定因子中起重要作用。
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1.2.2 ω-CTX
Kim等[18]研究了ω-CTX GVIA的CD谱并与ω-CTX MVⅡA和ω-CTX MV ⅡC的CD谱作比较，发现GVIA与后两者尽管在三维结构上十分相似，但CD谱差异极大。前者在200nm附近有正性cotton效应，后两者的CD谱相似，表明它们的CD谱与三维结构无明显关系。Hirata等[19]发现纳摩尔级浓度的ω-CTX GVIA、MVⅡA、MVⅡC即可阻断大鼠输精管抽动反应，机理可能是抑制Ca2+进入突触前N型Ca2+通道从而抑制释放ATP。Marian Price-Carter等[20](1998)研究了ω-CTX MVⅡA中二硫键对该毒素稳定性和肽段折叠的影响。发现每个二硫键均对毒素稳定的构象有重要贡献，缺少任何一个二硫键都会导致毒素变成不规则二级结构，大幅度降低与Ca2+通道的结合能力并变得更容易被还原。Lew等[21]通过功能鉴定发现ω-CTX GVIA中Lys2和Tyr13被Ala取代能使毒素效价减少2个数量级，Arg17、Tyr22和Lys24 被Ala取代能使毒素效价大幅下降(<100倍)。GVIA对N型Ca2+通道的高亲和性是通道结合位点与多个毒素的作用位点相互作用的结果。Marian Price-Carter等[22](1996)研究了ω-CTX MVⅡA折叠成熟过程，结果表明，MVⅡA-Gly中的Gly能增加毒素的稳定性，使其在最适条件下折叠效力增加80%，而Pro-ω-CTX MVⅡA的前体部分并不能增加效能。通过鸡的脑突触受体结合实验发现，MVⅡA-Gly的结合能力比MVⅡA降低10倍，Pro-ω-MVⅡA则降低了约100倍。
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2 海葵毒素(Anthoplerin toxin AP)
海葵毒素也是研究的热点，主要有AP-A 和AP-B两种，AP-A特异结合在心脏Na+通道上，AP-B对心脏和骨骼肌的Na+通道均能紧密结合，它们都有显著的强心作用。除此二种海葵毒素外，Kelso等[23]从黄海葵(Anthopleura xanthogrammica)中发现6种新毒素。其中5种类似从A.elegantissima.A.fuscoviridis 和Anmonia sulcata中分离得到的47个残基的I型长肽，还有一种似乎是从A.xanthogrammica中得到的两种49肽的嵌合体。用离子流方法在RT-4B和NIE-115细胞系中分别纯化和定性；一种命名为PCR2-10 47肽能增加藜芦定依赖型的Na+摄入，在RT-4B和NIE-115种细胞系中的K0.5分别为329nmol/L和1354nmol/L；49肽与Na+通道结合更紧密，在上述两种细胞系中的K0.5分别为47nmol/L和108nmol/L。
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2.1 AP-A
Pallaghy等[24]用NMR考察AP-A在溶液中的三维结构：AP-A结合紧密，四条短的反向平行的β片层通过3个环(loop)连接起来。第一个环始于I型β折角，包括2个重要的Asp残基；第二个环由二硫键形成包括2个完整的β折角；第三个环含有Gly40-Pro41残基。Asp7与Lys37相接近，可能形成盐桥，这部分残基可能与邻近的Asp9、His39位于分子表面，与心脏Na+通道相互作用。Gould等[25]考察了AP-A中Arg14对毒素活性的影响，当Arg14与1，2-环已二酮特异结合时，毒素活性在修饰前后相同，表明Arg14不是毒素活性所必需的。Benzinger等[26]发现AP-A与AP-B尽管均能与关闭状态的哺乳动物骨骼肌和心脏Na+通道结合，但它们的解离常数Koff不同，它们的差异受区域IV控制。
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2.2 AP-B
Kelso等[27]发现AP-B中Arg12和Lys49在毒素区分神经和心脏Na+通道中起关键作用，AP-B的突变体(P13V)对两类通道的结合力下降了约10倍，作者推测这可能是因为Arg12、Arg14、Lys49组成的阳离子簇发生了构型重组。Monks等[28]制备了AP-B的衍生物——用1-羟基-2，2，6，6-四甲基-4-哌啶羧基叠氮化物自旋标记的AP-B并作定性分析。MS发现标记物仅连在序列的N末端上，该衍生物保留正性收缩能活性，利用反相HPLC发现它以两种完全不同的构型存在。khera等[29]研究了AP-B中高度保守的阴离子残基和静电作用对活性和结构的影响。Asp7被取代导致毒素无法折叠；突变体H39A和H34A的活性接近于天然毒素；突变体D9N和K37A活性仅是天然型的7～12分之一。作者还发现氨基酸残基12和49对毒素的紧密结合能力和专一性均十分重要[30]；Arg12和Arg14中，Arg12对毒素的结合能力起主要作用；Arg14所起作用不大，因为它可以被其它氨基酸替换。另外AP-B还可以区分心脏Na+通道的开放和关闭。Dias-Kadambi等[31]利用PCR来确认AP-B外露的疏水性氨基酸残基33和45对毒素的作用，发现残基33是高度保守的，在维持毒素的结构上起重要作用，用Phe做相对保守替换Try33会导致毒素无论对心脏还是对神经通道的结合力大幅度下降，而用酪氨酸替换时毒素的亲和力接近于天然型的，表明侧链形成氢键的能力或两性性质在位置33处是重要的。Dias-kadambi等[32]利用定点突变方法考察Leu18和Ile43对毒素的贡献。Leu18被Ala或Val替换时，毒素对心脏和神经Na+通道的结合力降低了几百倍(231～672倍)。相反Ile43允许在该位置上作保守性替换。作者认为毒素的活性部位不仅限于阳离子区，疏水性氨基酸也起关键作用。Benzinger等[33]构建了大鼠心脏Na+通道Asp-1612突变体，发现它与AP-B结合力降低主要是由于毒素/通道的解离率的提高。
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3 其它毒素
来源于水母(Jellyfish)触手的毒素具有溶血、心脏毒性、神经毒性、肌肉毒性、皮肤坏死作用、影响离子运转及酶样活性[34]。这些作用有相关性，多数毒素具有几种不同的作用，且毒素的作用还与浓度、纯度有关。被水母蛰伤后，能产生疼痛、水肿、神经抑制、严重时心跳停止、麻痹以至死亡。水母毒素有望在研制独特功效的心血管药及研究神经、分子生物学的工具药方面有应用前景。
头足毒素(cephalotoxin)也称章鱼毒素[35]，是从乌贼及多种章鱼唾液腺中得到的活性物质，含低分子胺类、蛋白质和肽。头足毒素不耐热，能被胰蛋白酶灭活。初步实验表明头足毒素可能是一种糖蛋白[36]。它具有提高冠脉血流的能力，能改善心肌生化指标，消除胸骨后疼痛，静注可提高人血液纤维蛋白溶解活性，防止血栓形成。其血管舒张作用超过硝酸甘油103～104倍。可望开发成抗心绞痛药物。
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海胆毒素存在于海胆的生殖腺和叉棘中[37]，可溶于水。白棘三列海胆(Tripheustes gratilla)的球状叉棘中存在高毒物质，这类毒素不可透析，在pH4.3～10.6范围内是稳定的，但在45.0～47.5℃时就被灭活。海胆(Lytechinus variegatus)球状叉棘的盐水提取物含有毒性物质可透析，不耐热，在0.25mol/L NaOH溶液中保温1～2h就被破坏，有类似乙酰胆碱样作用。
海蛇毒素中常见的是半环扁尾海蛇(Lacticaudza semifasciate)的毒素(laticatoxin)Ⅰ～Ⅴ[35]。海蛇的毒性比陆上最毒的蛇毒还要强得多，其毒液是多种蛋白质混合物，包括酶、多肽和小肽，多肽占90%左右。它们均能高度专一性地结合乙酰胆碱受体，阻断突触传递，引起麻痹，多以呼吸肌麻痹导致死亡。现已证明，多种海蛇毒素有一个共同的抗原，利用免疫学方法制备出抗蛇毒血清可用来治疗蛇毒中毒，海蛇毒素在心血管、抗血栓用药方面将大有作为。
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海兔毒素(dolastoxin)从截尾海兔(Dolabella auricularia)中分离得到一种抗肿瘤的活性成分[35、39]，它是含量很低的九肽；从海兔分离得海兔毒素1～9，迄今唯一确定海兔毒素3的结构为：环[Pro-Leu-Val-(Gln)Thz-(Gly)-Thz]。海兔毒素3含有两种新的少见的噻唑氨基酸：(Gln)-Thz及(Gln)-Thz。它强烈抑制细胞生长，具有抗P388白血病及B16黑色素瘤作用。有人按海兔毒素3的结构进行了人工全合成，但合成的环多肽无生物活性。
鱼毒素源自鱼 工科(Dasyatidae)[40]的毒刺，毒液的水溶液无色，含蛋白质、多肽，pH中性，有弱氨气味。除10种游离氨基酸、5-羟色胺、5-核苷酸酶、磷酸二酯酶外，还发现三种具有高毒性的蛋白质部分，分子量约为100000。毒性在冻干后可损失一部分，提取物的毒性在18h内也同样有损失。
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微囊藻素(microcystin)是从蓝细菌(cyanobacteria)即蓝菌(藻)，主要是从铜绿微囊藻(Microcyatis aeruginosa)中发现的一大类50多种结构相似的环肽类肝脏毒素[41]。Mcdermott等[42]观察微囊藻素-LR对大鼠肝细胞、人成纤维细胞、人内皮细胞、大鼠早幼粒细胞的形态、生化、特别是对细胞程序性死亡的影响。结果发现，在30分钟内微囊藻素(0.8μM)使肝细胞膜呈水泡样，细胞萎缩，细胞器位置变化，染色质浓缩，呈典型的细胞程序性死亡。其它细胞在高剂量(100μM)下也发生类似形态变化，但需较长时间，多数细胞的DNA断裂，出现“梯子”样构型。
结语
综上所述，海洋中的这些蛋白质、肽类毒素具有性质独特、作用专一，剂量低、效果显著的特点。其中以芋螺毒素和海葵毒素最受关注。它们虽由少量氨基酸组成，却表现出极强的生物学活性，为大规模合成利用创造了条件，也为分子生物学研究提供了良好的工具药。相信此类毒素在未来人类战胜病患，探索生命奥秘会开辟新的道路。
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收稿：2000-01-08, 百拇医药
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1.1 新发现的几种芋螺毒素
新发现的几种芋螺毒素在一级结构上各具特点，并与其独特的生理活性相关。England等[5]从地纹芋螺(Conus geographus)中分离得到δ-CTX GVⅢA，它是富含GLy和Thr的41肽，是迄今发现的芋螺毒素分子中最大的一个。δ-CTX GVⅢA能使5-羟色胺(5-HT3)受体通道失活(0.25mg/ml)。第34位为极罕见的L-6-Br-色氨酸，而内源性的5-HT3受体的配体是羟基色氨酸，所以L-6-Br-色氨酸是该毒素的功能决定因子。shon等[6]从Conus purpuracens中分离出Ψ-CTX PⅢE，它是一种麻痹肽。Ψ-CTX PⅢE有特殊的作用机制,它能使电鳐肌肉内的发电细胞活动衰减100%(10μmol/L)和80%(1μmol/L)，表明Ψ-CTX PⅢE抑制骨骼肌的烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)，但不与α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin)竞争作用位点，因此该毒素非竞争性结合nAChR。Loughnan等[7]从食鱼芋螺(Conus episcopatus)中分离得到α-CTX EPⅠ，其结构中第15位是磺化酪氨酸，这是磺酸基首次在芋螺毒素中发现。α-CTX EPⅠ能竞争性抑制牛肾上腺嗜铬细胞(神经AChR)由烟碱诱导的几茶酚胺的释放，而对大鼠膈神经nerve-diaphragm无影响。EPⅠ还能部分抑制离体大鼠心内神经节副交感神经元的活动，表明EPⅠ选择性地抑制AChR制的α3β2和α3β4亚基。
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1.2 结构、药理和构效关系
对CTX的结构、药理和构效关系的研究主要集中在α、ω-CTX上，对其它亚型研究较少。利用二维NMR、CD 及X-射线晶体衍射等手段着重研究了它们的空间结构、构效关系及其与受体的特异结合性质。
1.2.1 α-CTX
Gehrmann等[8]研究了α-CTX GⅠ二硫键三种连接形式，通过NMR方法发现天然型的α-CTX GⅠ(2-7、3-13)最完美。在5位和11位氨基酸残基之间主要是一个扭曲的310-螺旋结构。构效关系表明二硫键对于毒素无论是结构还是稳定性均起关键作用。Maslennikon等[9]利用二维NMR分析α-CTX GⅠ在水中的空间构型。发现α-CTX GⅠ呈现两种可以相互转化的拓扑异构体，出现概率分别为78%和22%。它们的共同特征是：存在Asn4-Cys7的β-折角；在Gly8到Tyrll之间出现概率大的构型呈右手螺旋，出现概率小的构型呈线性状态。Rogers等[10]研究了α-CTX ⅠMⅠ的溶液结构，它的特点是由两个二硫键形成两个紧密的环(loop)，形成被一深裂隔离的两个亚区域。第一个环中的两个310-螺旋与第二个环通过C-末端β-折角相连。两个二硫键与Ala9形成一个牢固的疏水核心，其余氨基酸伸向表面。Hu等[11]利用X-射线晶体衍射技术研究了α-CΤΧ ΡnⅠB的晶体结构，并与α-CTX PNⅠA、GⅠ的结构做了比较。Pn I B是斜方晶，属于P212121空间结构。Shon等[12]利用二维HNMR谱确定了α-CTX MⅡ水溶液的三维结构，发现了14种具有最低能量的结构。总体结构是围绕二硫键的α螺旋，分子表面可分为两部分，分别由疏水性和亲水性氨基酸残基组成，这种结构特点可能在专一性亚基识别时起重要作用。Ashcom等[13](1997)用荧光素标记于α-CTX GI(FGI)的N-末端，利用旋转柱(spin-column)技术，发现FGI与电鳐发电器官nAChR的结合是独特的剂量依赖型的紧密结合，毒素结合在受体的一个位点上，有饱和性质，解离常数KD为41.3±8.2nmol/L。Quiram等[14]研究了α-CTX IMI的构效关系。它的Asp5所带的负电荷及其适宜的侧链长度是毒素活性所必需的，而Arg7所带的正电荷及其适宜的大小也是毒素活性所必需的。Tyr-10芳香侧链也是活性必需基团，其余4个氨基酸残基被取代后毒素的结合能力未有显著变化。Groeb等[15]研究了α-CTX GI和SI与nAChR的肌肉亚型结合时的决定因子，结果表明α-CTX GI和SI的9、10位均参与受体中的种属和亚基依赖型的相互作用。Hann等[16]发现α-CTX GI中，Arg9残基对毒素特异性地与放电器官的nAChR的α、γ兴奋位点结合起关键作用。当α-CTX GI中Arg9被Pro取代后对nAChR的α、γ不表现特异性而类似α-CTX SI；α-CTX GSⅠ中的Pro9被Arg取代后，则表现出类似α-CTX GI的特异性。据此推测GI的两个阳离子中心即N-端的氨基和Arg9 的胍基直接与nAChR作用。Harvey等[17]研究了α-CTX MⅡ对神经nAChR的α3β2亚基的专一亲和决定因子。α3亚基的决定因子位于序列121～181和181～195，在序列181～195上Lys185和Ile188在该决定因子中起重要作用；β2亚基的决定因子位于序列1～54、54～63和63～80，在序列54～63上Thr59在该决定因子中起重要作用。
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1.2.2 ω-CTX
Kim等[18]研究了ω-CTX GVIA的CD谱并与ω-CTX MVⅡA和ω-CTX MV ⅡC的CD谱作比较，发现GVIA与后两者尽管在三维结构上十分相似，但CD谱差异极大。前者在200nm附近有正性cotton效应，后两者的CD谱相似，表明它们的CD谱与三维结构无明显关系。Hirata等[19]发现纳摩尔级浓度的ω-CTX GVIA、MVⅡA、MVⅡC即可阻断大鼠输精管抽动反应，机理可能是抑制Ca2+进入突触前N型Ca2+通道从而抑制释放ATP。Marian Price-Carter等[20](1998)研究了ω-CTX MVⅡA中二硫键对该毒素稳定性和肽段折叠的影响。发现每个二硫键均对毒素稳定的构象有重要贡献，缺少任何一个二硫键都会导致毒素变成不规则二级结构，大幅度降低与Ca2+通道的结合能力并变得更容易被还原。Lew等[21]通过功能鉴定发现ω-CTX GVIA中Lys2和Tyr13被Ala取代能使毒素效价减少2个数量级，Arg17、Tyr22和Lys24 被Ala取代能使毒素效价大幅下降(<100倍)。GVIA对N型Ca2+通道的高亲和性是通道结合位点与多个毒素的作用位点相互作用的结果。Marian Price-Carter等[22](1996)研究了ω-CTX MVⅡA折叠成熟过程，结果表明，MVⅡA-Gly中的Gly能增加毒素的稳定性，使其在最适条件下折叠效力增加80%，而Pro-ω-CTX MVⅡA的前体部分并不能增加效能。通过鸡的脑突触受体结合实验发现，MVⅡA-Gly的结合能力比MVⅡA降低10倍，Pro-ω-MVⅡA则降低了约100倍。
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2 海葵毒素(Anthoplerin toxin AP)
海葵毒素也是研究的热点，主要有AP-A 和AP-B两种，AP-A特异结合在心脏Na+通道上，AP-B对心脏和骨骼肌的Na+通道均能紧密结合，它们都有显著的强心作用。除此二种海葵毒素外，Kelso等[23]从黄海葵(Anthopleura xanthogrammica)中发现6种新毒素。其中5种类似从A.elegantissima.A.fuscoviridis 和Anmonia sulcata中分离得到的47个残基的I型长肽，还有一种似乎是从A.xanthogrammica中得到的两种49肽的嵌合体。用离子流方法在RT-4B和NIE-115细胞系中分别纯化和定性；一种命名为PCR2-10 47肽能增加藜芦定依赖型的Na+摄入，在RT-4B和NIE-115种细胞系中的K0.5分别为329nmol/L和1354nmol/L；49肽与Na+通道结合更紧密，在上述两种细胞系中的K0.5分别为47nmol/L和108nmol/L。
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2.1 AP-A
Pallaghy等[24]用NMR考察AP-A在溶液中的三维结构：AP-A结合紧密，四条短的反向平行的β片层通过3个环(loop)连接起来。第一个环始于I型β折角，包括2个重要的Asp残基；第二个环由二硫键形成包括2个完整的β折角；第三个环含有Gly40-Pro41残基。Asp7与Lys37相接近，可能形成盐桥，这部分残基可能与邻近的Asp9、His39位于分子表面，与心脏Na+通道相互作用。Gould等[25]考察了AP-A中Arg14对毒素活性的影响，当Arg14与1，2-环已二酮特异结合时，毒素活性在修饰前后相同，表明Arg14不是毒素活性所必需的。Benzinger等[26]发现AP-A与AP-B尽管均能与关闭状态的哺乳动物骨骼肌和心脏Na+通道结合，但它们的解离常数Koff不同，它们的差异受区域IV控制。
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2.2 AP-B
Kelso等[27]发现AP-B中Arg12和Lys49在毒素区分神经和心脏Na+通道中起关键作用，AP-B的突变体(P13V)对两类通道的结合力下降了约10倍，作者推测这可能是因为Arg12、Arg14、Lys49组成的阳离子簇发生了构型重组。Monks等[28]制备了AP-B的衍生物——用1-羟基-2，2，6，6-四甲基-4-哌啶羧基叠氮化物自旋标记的AP-B并作定性分析。MS发现标记物仅连在序列的N末端上，该衍生物保留正性收缩能活性，利用反相HPLC发现它以两种完全不同的构型存在。khera等[29]研究了AP-B中高度保守的阴离子残基和静电作用对活性和结构的影响。Asp7被取代导致毒素无法折叠；突变体H39A和H34A的活性接近于天然毒素；突变体D9N和K37A活性仅是天然型的7～12分之一。作者还发现氨基酸残基12和49对毒素的紧密结合能力和专一性均十分重要[30]；Arg12和Arg14中，Arg12对毒素的结合能力起主要作用；Arg14所起作用不大，因为它可以被其它氨基酸替换。另外AP-B还可以区分心脏Na+通道的开放和关闭。Dias-Kadambi等[31]利用PCR来确认AP-B外露的疏水性氨基酸残基33和45对毒素的作用，发现残基33是高度保守的，在维持毒素的结构上起重要作用，用Phe做相对保守替换Try33会导致毒素无论对心脏还是对神经通道的结合力大幅度下降，而用酪氨酸替换时毒素的亲和力接近于天然型的，表明侧链形成氢键的能力或两性性质在位置33处是重要的。Dias-kadambi等[32]利用定点突变方法考察Leu18和Ile43对毒素的贡献。Leu18被Ala或Val替换时，毒素对心脏和神经Na+通道的结合力降低了几百倍(231～672倍)。相反Ile43允许在该位置上作保守性替换。作者认为毒素的活性部位不仅限于阳离子区，疏水性氨基酸也起关键作用。Benzinger等[33]构建了大鼠心脏Na+通道Asp-1612突变体，发现它与AP-B结合力降低主要是由于毒素/通道的解离率的提高。
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3 其它毒素
来源于水母(Jellyfish)触手的毒素具有溶血、心脏毒性、神经毒性、肌肉毒性、皮肤坏死作用、影响离子运转及酶样活性[34]。这些作用有相关性，多数毒素具有几种不同的作用，且毒素的作用还与浓度、纯度有关。被水母蛰伤后，能产生疼痛、水肿、神经抑制、严重时心跳停止、麻痹以至死亡。水母毒素有望在研制独特功效的心血管药及研究神经、分子生物学的工具药方面有应用前景。
头足毒素(cephalotoxin)也称章鱼毒素[35]，是从乌贼及多种章鱼唾液腺中得到的活性物质，含低分子胺类、蛋白质和肽。头足毒素不耐热，能被胰蛋白酶灭活。初步实验表明头足毒素可能是一种糖蛋白[36]。它具有提高冠脉血流的能力，能改善心肌生化指标，消除胸骨后疼痛，静注可提高人血液纤维蛋白溶解活性，防止血栓形成。其血管舒张作用超过硝酸甘油103～104倍。可望开发成抗心绞痛药物。
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海胆毒素存在于海胆的生殖腺和叉棘中[37]，可溶于水。白棘三列海胆(Tripheustes gratilla)的球状叉棘中存在高毒物质，这类毒素不可透析，在pH4.3～10.6范围内是稳定的，但在45.0～47.5℃时就被灭活。海胆(Lytechinus variegatus)球状叉棘的盐水提取物含有毒性物质可透析，不耐热，在0.25mol/L NaOH溶液中保温1～2h就被破坏，有类似乙酰胆碱样作用。
海蛇毒素中常见的是半环扁尾海蛇(Lacticaudza semifasciate)的毒素(laticatoxin)Ⅰ～Ⅴ[35]。海蛇的毒性比陆上最毒的蛇毒还要强得多，其毒液是多种蛋白质混合物，包括酶、多肽和小肽，多肽占90%左右。它们均能高度专一性地结合乙酰胆碱受体，阻断突触传递，引起麻痹，多以呼吸肌麻痹导致死亡。现已证明，多种海蛇毒素有一个共同的抗原，利用免疫学方法制备出抗蛇毒血清可用来治疗蛇毒中毒，海蛇毒素在心血管、抗血栓用药方面将大有作为。
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海兔毒素(dolastoxin)从截尾海兔(Dolabella auricularia)中分离得到一种抗肿瘤的活性成分[35、39]，它是含量很低的九肽；从海兔分离得海兔毒素1～9，迄今唯一确定海兔毒素3的结构为：环[Pro-Leu-Val-(Gln)Thz-(Gly)-Thz]。海兔毒素3含有两种新的少见的噻唑氨基酸：(Gln)-Thz及(Gln)-Thz。它强烈抑制细胞生长，具有抗P388白血病及B16黑色素瘤作用。有人按海兔毒素3的结构进行了人工全合成，但合成的环多肽无生物活性。
鱼毒素源自鱼 工科(Dasyatidae)[40]的毒刺，毒液的水溶液无色，含蛋白质、多肽，pH中性，有弱氨气味。除10种游离氨基酸、5-羟色胺、5-核苷酸酶、磷酸二酯酶外，还发现三种具有高毒性的蛋白质部分，分子量约为100000。毒性在冻干后可损失一部分，提取物的毒性在18h内也同样有损失。, 百拇医药
微囊藻素(microcystin)是从蓝细菌(cyanobacteria)即蓝菌(藻)，主要是从铜绿微囊藻(Microcyatis aeruginosa)中发现的一大类50多种结构相似的环肽类肝脏毒素[41]。Mcdermott等[42]观察微囊藻素-LR对大鼠肝细胞、人成纤维细胞、人内皮细胞、大鼠早幼粒细胞的形态、生化、特别是对细胞程序性死亡的影响。结果发现，在30分钟内微囊藻素(0.8μM)使肝细胞膜呈水泡样，细胞萎缩，细胞器位置变化，染色质浓缩，呈典型的细胞程序性死亡。其它细胞在高剂量(100μM)下也发生类似形态变化，但需较长时间，多数细胞的DNA断裂，出现“梯子”样构型。
结语
综上所述，海洋中的这些蛋白质、肽类毒素具有性质独特、作用专一，剂量低、效果显著的特点。其中以芋螺毒素和海葵毒素最受关注。它们虽由少量氨基酸组成，却表现出极强的生物学活性，为大规模合成利用创造了条件，也为分子生物学研究提供了良好的工具药。相信此类毒素在未来人类战胜病患，探索生命奥秘会开辟新的道路。
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