乳链菌肽nisin Z的pH吸附法分离纯化技术研究*
作者：叶嗣颖 谢昕 黄庆华 彭颖 许迪 胡国平 田拥军
单位：同济医科大学基础医学院微生物学教研室，武汉 430030
关键词：nisin；乳酸链球菌；分离纯化
同济医科大学学报000212 摘要：通过pH吸附法，利用乳酸链球菌亚种N8(Lact ococcus lactis subsp. lactis N8)和乳酸链球菌亚种ATCC11454，研究了nisin Z分子在 不同pH环境下的吸附作用及其分离纯化效率，并经麦黄酮SDS-PAGE和RP-HPLC纯度鉴定， 证实用此技术分离nisin Z具有高效高纯度、操作简便等良好特征。nisin在pH6.5吸附率 达100%，pH3以下完全释放。该技术可望开辟对nisin等微生物分泌性蛋白的分离纯化新途径 。
中图法分类号：R3780， Q514.3
, http://www.100md.com
The Research on Isolation and Purificati on of Bacteriocin Nisin Z from Lactococcus by pH Adsorption
Ye Siying, Xie Xin, Huang Qinghua et al
Department of Microbiology, School of Basic Medical Sc iences,Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract：By using pH adsorption and making use of Lactococcus l actis subspecies lactis N8 and ATCC 11454, the adsorption and efficiency of isol ation and purification of nisin Z molecule at different pH condition were studie d. Identification of tricine sodium dodecyle sulfate polyacrylamide gel electrop horesis and reverse phase high pressure liquid chromatography showed that the te chnique of isolation and purification by pH adsorption was characterized by high efficency, high purity of molecules and simple in manipulation. Rate of nisin a dsorption to cells reached 100 % at pH 6.5 and the nisin molecules were complete ly released at pH 3. The technique is hopeful to be used as a new way for isolat ing and purifying the released small bacteriocins like nisin.
, 百拇医药
Key words：nisin; lactococcus; isolation and purification
Nisin是由乳酸链球菌分泌的一种含34个氨基酸残基的兰抗素(Lantibiotics) 类活性肽分子 。由于其具有高效抗菌活性(杀灭多种革兰阳性菌，包括芽胞菌及其芽胞)、无毒性、热稳 定性、耐酸等特性，已被许多国家和地区作为食品新一代生物保护剂进行研究。目前nisin 已被作为最有希望取代化学防腐剂的一种肽类分子。国际国内虽然已开始批量生产，但生产 成本及抑菌范围仍有待于研究。本研究采用pH吸附法对nisin Z进行了分离纯化研究，以探 讨nisin分离纯化技术新途径。
1 材料与方法
菌株、培养基及主要仪器：乳酸链球菌N8(Lactococcus lactis subsp. latis N8)，为nisi n Z产生菌；乳酸链球菌ATCC 11454,为nisin A产生菌；黄色微球菌 (Micrococcus aureus) ,为nisin活性指示菌。由芬兰赫尔辛基大学生物技术研究所分子细菌学实验室提供。培养 基 ：M17[1]，TGE[3]。M17培养基含1 mol/L蔗糖， 5 g/L葡萄糖。培养细菌 时，将液体M17和TGE放30 ℃静置培养16～18 h。 黄色微球菌用LB培养基，于37℃培养16～ 18 h。Nisapline(国际标准nisin，提供单位同上)。精密pH仪(pHS-3C型，上海雷磁仪器 厂)；电子天平(HANGPING,FA1004, 上海天平仪器厂)；高压液相色谱仪。
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Nisin吸附菌细胞的制备：乳酸链球菌N8及乳酸链球菌ATCC11454用液体培养基培养过夜 ,离心后分离上清并保存于-20℃备用。菌细胞用无菌5 mol/L磷酸钠(pH6.6)洗(加细胞沉 淀物的20%洗液量),再加20% 1 mol/L NaCl混悬,用5%磷酸调pH至2.0，在4℃维持1 h，离心 去上清,用无菌去离子水(dH2O)洗1次,再用dH2O混悬至原细胞培养液量。
Nisin的分离纯化：分子吸附试验:用nisin标准品约105～106 AU(活性单位)/ml加入18 ml 5 mmol/L磷酸钠中,再加1 ml吸附细胞于其中。分装于Eppendorf管并调pH2.0～9.0个 pH点(其余部分保留供重复实验)。于 4℃吸附30 min,离心5 min,分别取上清 测定其活性。设对照A: 等量dH2O代替nisin;对照B:等量dH2O代替菌细胞悬液。以下式 计算分子吸附百分率:
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分子抽提纯化：用nisin Z产生菌(N8) 和nisin A产生菌ATCC11454分别培养于 1000 ml液 体培养基中,至稳定期早期为止(约5×108/ml),70 ℃灭活菌细胞后调pH至6.6 ,离心15 min，回收细胞,分出上清并保留。用pH6.6的5 mmol/L磷酸钠洗菌细胞,再悬浮 于 50 ml 100 mmol/L NaCl(pH2.5) 中, 在4 ℃中用磁力搅拌器作用1 h, 离心2 0 min，收获上清,用不透1 kD蛋白以上的透析袋于dH2O和4 ℃中透析24 h,冻干分离物。
分离纯化物鉴定:采用麦黄酮-SDS-PAGE法[4]和反相高压液相色谱法(reverse ph ase high pressure liquid chromatography,RP-HPLC)。
2 结果
pH对nisin Z吸附菌细胞的影响:通过调变pH,设多种不同pH范围的吸附实验, 观察到nisin Z 分子对乳酸链球菌N8和乳酸链球菌ATCC11454的吸附显著受细胞外pH 环境的影响。在pH3.0 吸附为零,pH4.0吸附60%,pH5.0吸附80%,pH6.0吸附85%, pH6.5 吸附100%。但pH6.5 以上nisin Z和nisin A吸附率均开始急剧下降。由此证实,nisin Z的最大吸附pH值为pH6.5 ,其完全释放的pH值在pH3以下,与文献[2]报道相似。
, 百拇医药
Nisin Z分离纯化效果:通过抗微生物活性测定分离回收及损失量,证实nisin Z纯化干品可达 到95.1%,损失率可降到0.7%(小部分可能损失于其他过程)(表1)。
表1 抽提纯化的nisin损失及回收率 来源
Nisin AU
N8 (%)
ATCC11454 (%)
培养上清+菌细胞
3.0×107( 100)
3.0×107( 100)
残留细胞
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4.0×105( 0.6)
2.0×105( 0.7)
吸附后残留于上清
6.0×105( 2.0)
2.0×106( 0.7)
冷冻干燥纯化品*
2.5×107(95.1)
2.8×107(93.5)
*将干燥纯化品溶于50 mmol/L SDS中以防分子凝聚
, 百拇医药
纯化nisin Z的鉴定:采用麦黄酮-SDS-PAGE 和反向高压液相技术(图1,2) 。 Nisin Z是只 有3.5 kD的小分子蛋白质,麦黄酮(tricine)有利于其在较低浓度的聚丙烯酰胺中泳动。通 过上述技术证明,pH吸附法分离纯化的nisin不仅分子量大小相符,而且具有较高的纯度。反 向高压液相色谱分析在55 min出现峰,未见明显杂蛋白。
图1 Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图
1.N8 2.ATCC11454
图2 反向高压液相色谱图
3 讨论
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从微生物获取蛋白类生物活性分子用于人类食品的保护、医疗保健等目的是当代生命科学的 目标之一。Nisin作为食品生物保护剂研究的历史几乎与青霉素相当。 近年来虽在分子水平 和应用研究上取得很大进展, 但分离纯化效率仍不甚理想。 1991 年Bhunia等首次观察到酸 乳乳酸小球菌素可吸附于敏感的菌细胞上, 并发现这种吸附具有pH依赖性,从而启发学者们 试图用pH吸附法分离纯化细菌素。 本研究对溶解性良好的nisin Z分子进行了pH吸附分离实 验,证实此法分离nisin Z具有高效、高纯度特性,且方法简易,要求条件不高,如进一步扩大 研究, 此方法有可能用于较大规模的大量提纯nisin等细菌素类生物活性分子,亦可用于实验 室研究用细菌素类的提纯。
国家教委留学回国人员科研启动资助项目(教外司留[1995]135号)
叶嗣颖，男，1955年生，教授
参考文献
, 百拇医药
1，Ye S Y, Koponen O, Qiao M Q et al. NisP is related to nisin precursor processing and possibly to immunity in Lactococcus lactis. J Tongji Med Univ, 1995,15:193
2，Yang R G, Monty C J, Bibek R. Novel method to extract large amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria. Appl Envir Microbiol, 1992,58:3355
3，Biswas S R, Ray M C, Johnson et al. Influence of growth condi tion on the production of a bacteriocin, pediocin AcH, by pediococcus acidi lactici H. Appl Environ Microbiol, 1991,57:1265
4，Hermann S, Gebhard J. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins i n the range from 1 to 100 kDa. Anal Bioch, 1987,166:468
(收稿：1999-04-14), 百拇医药
单位：同济医科大学基础医学院微生物学教研室，武汉 430030
关键词：nisin；乳酸链球菌；分离纯化
同济医科大学学报000212 摘要：通过pH吸附法，利用乳酸链球菌亚种N8(Lact ococcus lactis subsp. lactis N8)和乳酸链球菌亚种ATCC11454，研究了nisin Z分子在 不同pH环境下的吸附作用及其分离纯化效率，并经麦黄酮SDS-PAGE和RP-HPLC纯度鉴定， 证实用此技术分离nisin Z具有高效高纯度、操作简便等良好特征。nisin在pH6.5吸附率 达100%，pH3以下完全释放。该技术可望开辟对nisin等微生物分泌性蛋白的分离纯化新途径 。
中图法分类号：R3780， Q514.3
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The Research on Isolation and Purificati on of Bacteriocin Nisin Z from Lactococcus by pH Adsorption
Ye Siying, Xie Xin, Huang Qinghua et al
Department of Microbiology, School of Basic Medical Sc iences,Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract：By using pH adsorption and making use of Lactococcus l actis subspecies lactis N8 and ATCC 11454, the adsorption and efficiency of isol ation and purification of nisin Z molecule at different pH condition were studie d. Identification of tricine sodium dodecyle sulfate polyacrylamide gel electrop horesis and reverse phase high pressure liquid chromatography showed that the te chnique of isolation and purification by pH adsorption was characterized by high efficency, high purity of molecules and simple in manipulation. Rate of nisin a dsorption to cells reached 100 % at pH 6.5 and the nisin molecules were complete ly released at pH 3. The technique is hopeful to be used as a new way for isolat ing and purifying the released small bacteriocins like nisin.
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Key words：nisin; lactococcus; isolation and purification
Nisin是由乳酸链球菌分泌的一种含34个氨基酸残基的兰抗素(Lantibiotics) 类活性肽分子 。由于其具有高效抗菌活性(杀灭多种革兰阳性菌，包括芽胞菌及其芽胞)、无毒性、热稳 定性、耐酸等特性，已被许多国家和地区作为食品新一代生物保护剂进行研究。目前nisin 已被作为最有希望取代化学防腐剂的一种肽类分子。国际国内虽然已开始批量生产，但生产 成本及抑菌范围仍有待于研究。本研究采用pH吸附法对nisin Z进行了分离纯化研究，以探 讨nisin分离纯化技术新途径。
1 材料与方法
菌株、培养基及主要仪器：乳酸链球菌N8(Lactococcus lactis subsp. latis N8)，为nisi n Z产生菌；乳酸链球菌ATCC 11454,为nisin A产生菌；黄色微球菌 (Micrococcus aureus) ,为nisin活性指示菌。由芬兰赫尔辛基大学生物技术研究所分子细菌学实验室提供。培养 基 ：M17[1]，TGE[3]。M17培养基含1 mol/L蔗糖， 5 g/L葡萄糖。培养细菌 时，将液体M17和TGE放30 ℃静置培养16～18 h。 黄色微球菌用LB培养基，于37℃培养16～ 18 h。Nisapline(国际标准nisin，提供单位同上)。精密pH仪(pHS-3C型，上海雷磁仪器 厂)；电子天平(HANGPING,FA1004, 上海天平仪器厂)；高压液相色谱仪。
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Nisin吸附菌细胞的制备：乳酸链球菌N8及乳酸链球菌ATCC11454用液体培养基培养过夜 ,离心后分离上清并保存于-20℃备用。菌细胞用无菌5 mol/L磷酸钠(pH6.6)洗(加细胞沉 淀物的20%洗液量),再加20% 1 mol/L NaCl混悬,用5%磷酸调pH至2.0，在4℃维持1 h，离心 去上清,用无菌去离子水(dH2O)洗1次,再用dH2O混悬至原细胞培养液量。
Nisin的分离纯化：分子吸附试验:用nisin标准品约105～106 AU(活性单位)/ml加入18 ml 5 mmol/L磷酸钠中,再加1 ml吸附细胞于其中。分装于Eppendorf管并调pH2.0～9.0个 pH点(其余部分保留供重复实验)。于 4℃吸附30 min,离心5 min,分别取上清 测定其活性。设对照A: 等量dH2O代替nisin;对照B:等量dH2O代替菌细胞悬液。以下式 计算分子吸附百分率:
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分子抽提纯化：用nisin Z产生菌(N8) 和nisin A产生菌ATCC11454分别培养于 1000 ml液 体培养基中,至稳定期早期为止(约5×108/ml),70 ℃灭活菌细胞后调pH至6.6 ,离心15 min，回收细胞,分出上清并保留。用pH6.6的5 mmol/L磷酸钠洗菌细胞,再悬浮 于 50 ml 100 mmol/L NaCl(pH2.5) 中, 在4 ℃中用磁力搅拌器作用1 h, 离心2 0 min，收获上清,用不透1 kD蛋白以上的透析袋于dH2O和4 ℃中透析24 h,冻干分离物。
分离纯化物鉴定:采用麦黄酮-SDS-PAGE法[4]和反相高压液相色谱法(reverse ph ase high pressure liquid chromatography,RP-HPLC)。
2 结果
pH对nisin Z吸附菌细胞的影响:通过调变pH,设多种不同pH范围的吸附实验, 观察到nisin Z 分子对乳酸链球菌N8和乳酸链球菌ATCC11454的吸附显著受细胞外pH 环境的影响。在pH3.0 吸附为零,pH4.0吸附60%,pH5.0吸附80%,pH6.0吸附85%, pH6.5 吸附100%。但pH6.5 以上nisin Z和nisin A吸附率均开始急剧下降。由此证实,nisin Z的最大吸附pH值为pH6.5 ,其完全释放的pH值在pH3以下,与文献[2]报道相似。
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Nisin Z分离纯化效果:通过抗微生物活性测定分离回收及损失量,证实nisin Z纯化干品可达 到95.1%,损失率可降到0.7%(小部分可能损失于其他过程)(表1)。
表1 抽提纯化的nisin损失及回收率 来源
Nisin AU
N8 (%)
ATCC11454 (%)
培养上清+菌细胞
3.0×107( 100)
3.0×107( 100)
残留细胞
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4.0×105( 0.6)
2.0×105( 0.7)
吸附后残留于上清
6.0×105( 2.0)
2.0×106( 0.7)
冷冻干燥纯化品*
2.5×107(95.1)
2.8×107(93.5)
*将干燥纯化品溶于50 mmol/L SDS中以防分子凝聚
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纯化nisin Z的鉴定:采用麦黄酮-SDS-PAGE 和反向高压液相技术(图1,2) 。 Nisin Z是只 有3.5 kD的小分子蛋白质,麦黄酮(tricine)有利于其在较低浓度的聚丙烯酰胺中泳动。通 过上述技术证明,pH吸附法分离纯化的nisin不仅分子量大小相符,而且具有较高的纯度。反 向高压液相色谱分析在55 min出现峰,未见明显杂蛋白。
图1 Tricine-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图
1.N8 2.ATCC11454
图2 反向高压液相色谱图
3 讨论
, http://www.100md.com
从微生物获取蛋白类生物活性分子用于人类食品的保护、医疗保健等目的是当代生命科学的 目标之一。Nisin作为食品生物保护剂研究的历史几乎与青霉素相当。 近年来虽在分子水平 和应用研究上取得很大进展, 但分离纯化效率仍不甚理想。 1991 年Bhunia等首次观察到酸 乳乳酸小球菌素可吸附于敏感的菌细胞上, 并发现这种吸附具有pH依赖性,从而启发学者们 试图用pH吸附法分离纯化细菌素。 本研究对溶解性良好的nisin Z分子进行了pH吸附分离实 验,证实此法分离nisin Z具有高效、高纯度特性,且方法简易,要求条件不高,如进一步扩大 研究, 此方法有可能用于较大规模的大量提纯nisin等细菌素类生物活性分子,亦可用于实验 室研究用细菌素类的提纯。
国家教委留学回国人员科研启动资助项目(教外司留[1995]135号)
叶嗣颖，男，1955年生，教授
参考文献
, 百拇医药
1，Ye S Y, Koponen O, Qiao M Q et al. NisP is related to nisin precursor processing and possibly to immunity in Lactococcus lactis. J Tongji Med Univ, 1995,15:193
2，Yang R G, Monty C J, Bibek R. Novel method to extract large amounts of bacteriocins from lactic acid bacteria. Appl Envir Microbiol, 1992,58:3355
3，Biswas S R, Ray M C, Johnson et al. Influence of growth condi tion on the production of a bacteriocin, pediocin AcH, by pediococcus acidi lactici H. Appl Environ Microbiol, 1991,57:1265
4，Hermann S, Gebhard J. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins i n the range from 1 to 100 kDa. Anal Bioch, 1987,166:468
(收稿：1999-04-14), 百拇医药