一种改良的小鼠原代肝细胞培养方法
作者：聂兴草 方峰
单位：同济医科大学附属同济医院儿科，武汉 430030
关键词：原代培养；鼠肝细胞
同济医科大学学报000225 摘要：为寻求一种简易、价廉的原代小鼠肝细胞培养方法，采用非灌注法、冰浴操作处 理肝组织块及改良低血清培养基进行了原代鼠肝组织块和鼠肝细胞单层培养。通过光镜观察 细胞形态、电镜观察超微结构及检测培养上清白蛋白水平证实培养细胞为肝细胞。持续培养 结果显示原代培养第6～12 d左右为肝细胞功能最佳观察和实验阶段。
中图法分类号：R322.4， R329.2
An Improved Method for the Primary Cultu re of Murine Hepatocytes
, 百拇医药
Nie Xingcao, Fang Feng
Department of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medi cal University, Wuhan 430030
Abstract：To search for an easier and a cheaper method for the p rimany culture of murine hepatocytes, the primary culture of murine liver tissue and monolayer hepatocytes was performed in a simple way of non-perfusion under the ice bath treating the live tissues with a modified low-serum medium. The cu l tured cells were proved to be hepatocytes by observing morphology and structure under the light microscopy and the electron microscopy as well as by detecting a lbum levels in the supernatant of the cultures. The results showed that the dura tion from the 6th to 12th d of the primary culture was the optium period to carr y out research work on the hepatocytes.
, 百拇医药
Key words：primary culture; murine hepatocytes
肝细胞具有多种功能，代谢旺盛，在体外培养所需条件高，不易成功。Seglen的原位 两步灌流法为分离肝细胞的经典方法，但灌流法操作复杂，易污染，不宜于小动物。国外常 采用无血清培养基，其价格昂贵，国内不易常规获得。本文采用非灌流法和改良低血清培养 基获得纯度>95%原代小鼠肝细胞，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物
2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限(湖北省防疫站动物房提供)。
1.2 试剂
D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ(上海华美 生物工程公司提供)及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100 u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺(武汉中健公司提供)；小牛血清(BS，GIBC O公司提供)；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工 程公司产品)、促甲状腺素释放因子10-6 mol/L(Sigma公司产品)、促肝细胞生长 因子20 μg/ml、氢化可的松10-6 mol/L(广东阳江制药厂产品)。
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1.3 鼠肝组织块培养
断头处死动物无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。肝组织用4℃ D-ha nk's液或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分，将肝组织切为约1 mm3小块， 再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800 r/min离心4 min，弃上清，加入消化 液Ⅰ,37℃孵育12 min,再用培养液洗3次以清除胰酶。将消化好的肝组织块贴于25 cm2培 养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3 h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。
1.4 鼠肝细胞单层培养
动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去 除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用 培养液洗2次，4 ℃ 50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml 密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50 ml/L BS培养液。
, 百拇医药
1.5 肝细胞形态观察及其功能测定
原代培养前3 d尽量不晃动培养瓶，以后每天观察 细胞生长情况，每次换液前收集培养上清放-20℃保存，送本院检验科测定白蛋白含量。
1.6 电镜检测
待细胞生长成单层后倾去培养液刮取单层细胞加入25 ml/L戊二醛固定后按常规 方法制片，电镜(Opton EM10C,德国)观察细胞结构。
2 结果
2.1 细胞生长情况观察
原代组织块培养一般3 d后组织块周围有生长晕出现，且逐渐向周围扩展，单层细胞 3 d后已贴壁生长。光镜下可见培养的肝细胞呈三角形、圆形或类圆形，排列整齐，细胞界 限清晰，胞浆丰富透亮。细胞核有单核、双核，呈圆形或椭圆形，核仁清晰可见。
, 百拇医药
2.2 电镜观察
培养肝细胞在电镜下可见到细胞间毛细胆管，玫瑰花瓣样糖原颗粒、车轮状线粒体、大 量粗、滑面内质网。
2.3 不同血清浓度及成分培养基对肝细胞增殖的影响
见表1。
表1 不同浓度及成分培养基对肝细胞增殖的影响 培养基小牛血清浓度及成分
贴壁前 贴壁后，贴壁情况
肝细胞纯度
(%)
20 %
20 %
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+++
60～70
10 %+因子
5 %+因子
++
>95
5 %+因子
5 %+因子
+
90
10 %+因子
3 %+因子
++
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90(生长缓慢)
2.4 白蛋白检测结果
见表2。表2 原代鼠肝细胞培养上清内白蛋白含量(g/L)动态变化(
±s) 培养天数
3
6
9
12
15
18
培养上清(n=25)
1.72±0.28
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3.95±0.30
4.76±0.14
4.44±0.15
2.83±0.18
2.52±0.17
培养液白蛋白含量为0.5 g/L
3 讨论
Seglen[1]的原位两步灌注法为分离肝细胞的经典方法，它采用无Ca2+、Mg 2+的Hank's液 及胶原酶两步灌注，去除红细胞效果好，所分离的肝细胞较纯，细胞存活率高，主要适用于 中等大小动物，而较小动物(如小鼠)则因其解剖结构细小，操作复杂不易成功。王宇明 [2]采用分离小鼠肝细胞的简易灌流法获成功，但灌流法毕竟操作复杂，容易污染。 本实验 采用非灌流法分离小鼠肝细胞也获成功。首先，用断头法处死动物可大大减少肝组织内血含 量，而经充分漂洗，剥除纤维成分,4℃低速离心,可将大部分肝细胞沉淀而纯化。此外，笔 者经过多次对比实验发现在冰浴条件下操作可大大提高成功率，这可能是由于肝细胞在低温 条件下代谢减慢，致抗损伤能力增强的结果。酶的浓度及消化时间也是肝细胞培养成功的另 一个关键步骤，组织块培养采用37℃ 1 g/L胰酶消化10～15 min,单层细胞培养用4℃ 2 g/L 胶原酶Ⅳ过夜消化效果佳，此点与罗树衡[3]及裴许芳[4]报道一致。
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肝细胞培养条件特殊，若采用常规血清浓度培养基可致纤维细胞过度生长。国外学者采用无 血清培养基[5]抑制纤维细胞生长，但需加入诸多生长因子、激素及营养素，如表 皮生长因子、胰高血糖素、亚硒酸等，促进肝细胞生长，但这些成分价格昂贵，有些国内不 易得到。本实验采用改良50 ml/L血清培养基辅以肝细胞生长因子、促甲状腺激素释放激素 、氢化可的松等激素及营养素也获得纯度>95%的肝细胞。
从白蛋白检测结果来看，我们培养的细胞是具有一定生物学特性及功能的肝细胞，其分 泌白蛋白含量随培养天数增加而增加，至培养9 d时达峰值，随后又逐渐下降，培养的第6～ 12 d左右为原代肝细胞功能最佳观察和实验阶段。
1974年Phillips[6]等认为电镜下细胞间存在毛细胆管，胞浆内大量玫瑰花瓣 样糖原颗粒、大量粗面及滑面内质网及车轮状线粒体即可确定为肝细胞。本实验培养肝细胞 也具有上述超微结构，从细胞形态学上得以证实其性质。
, 百拇医药
原代鼠肝细胞培养成功为研究肝细胞的生物学特性及肝细胞多种感染性损伤、癌变机制提供 了一个良好的实验模型。本实验采用的方法简单易行，所用的改良培养基有效且大大降低了 成本，适应中国国情，宜于推广应用。
聂兴草，女，1974年生，医学硕士
参考文献
1，Alpini G, Phillips J O, Vorman B et al. Recent advance in the is olation of liver cells. Hepatology, 1994, 20: 494
2，王宇明. 分离小鼠肝细胞的一种简易灌流法. 中国应用生理学杂志, 1993, 9( 1): 65
3，罗树衡，舒衡平. 鼠肝细胞的分离及传代培养. 湖南医科大学学报, 1991, 16(2): 189
, http://www.100md.com
4，裴许芳，于志兰. 人胚胎肝样上皮细胞的体外培养. 细胞生物学杂志, 1987, 9(1): 28
5，Iacovacci S, Manzis A, Barca S et al. Molecular characterization an d dynamics of hepatitis C virus replication in human fetal hepatocytes infected in vitro. Hepatology, 1997, 26: 1328
6，Phillips M J, Oda M, Edwards V D et al. Ultrastructural and func tional studies of cultured hepatocyte. Lab Invest, 1974, 31: 533
(收稿：1999-05-28), 百拇医药
单位：同济医科大学附属同济医院儿科，武汉 430030
关键词：原代培养；鼠肝细胞
同济医科大学学报000225 摘要：为寻求一种简易、价廉的原代小鼠肝细胞培养方法，采用非灌注法、冰浴操作处 理肝组织块及改良低血清培养基进行了原代鼠肝组织块和鼠肝细胞单层培养。通过光镜观察 细胞形态、电镜观察超微结构及检测培养上清白蛋白水平证实培养细胞为肝细胞。持续培养 结果显示原代培养第6～12 d左右为肝细胞功能最佳观察和实验阶段。
中图法分类号：R322.4， R329.2
An Improved Method for the Primary Cultu re of Murine Hepatocytes
, 百拇医药
Nie Xingcao, Fang Feng
Department of Pediatrics, Tongji Hospital, Tongji Medi cal University, Wuhan 430030
Abstract：To search for an easier and a cheaper method for the p rimany culture of murine hepatocytes, the primary culture of murine liver tissue and monolayer hepatocytes was performed in a simple way of non-perfusion under the ice bath treating the live tissues with a modified low-serum medium. The cu l tured cells were proved to be hepatocytes by observing morphology and structure under the light microscopy and the electron microscopy as well as by detecting a lbum levels in the supernatant of the cultures. The results showed that the dura tion from the 6th to 12th d of the primary culture was the optium period to carr y out research work on the hepatocytes.
, 百拇医药
Key words：primary culture; murine hepatocytes
肝细胞具有多种功能，代谢旺盛，在体外培养所需条件高，不易成功。Seglen的原位 两步灌流法为分离肝细胞的经典方法，但灌流法操作复杂，易污染，不宜于小动物。国外常 采用无血清培养基，其价格昂贵，国内不易常规获得。本文采用非灌流法和改良低血清培养 基获得纯度>95%原代小鼠肝细胞，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物
2～4周龄BALB/C小鼠，雌雄不限(湖北省防疫站动物房提供)。
1.2 试剂
D-hank's液；消化液Ⅰ：含1 g/L胰蛋白酶、10 g/L聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyroli done, PVP)及0.3 g/L EDTA(武汉中健公司提供)；消化液Ⅱ：含2 g/L胶原酶Ⅳ(上海华美 生物工程公司提供)及10 g/L PVP；基础培养液为DMEM，另含青霉素100 u/ml、链霉素100 μg/ml、50 mmol/L HEPES、30 g/L谷氨酰胺(武汉中健公司提供)；小牛血清(BS，GIBC O公司提供)；培养基内其他因子：胰岛素5 μg/ml 、转铁蛋白5 μg/ml (上海华美生物工 程公司产品)、促甲状腺素释放因子10-6 mol/L(Sigma公司产品)、促肝细胞生长 因子20 μg/ml、氢化可的松10-6 mol/L(广东阳江制药厂产品)。
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1.3 鼠肝组织块培养
断头处死动物无菌分离肝组织后均在冰浴下操作。肝组织用4℃ D-ha nk's液或不含BS的培养液洗净血污，剥除包膜及纤维成分，将肝组织切为约1 mm3小块， 再用上述液体尽量洗去残留血污，最后一次清洗后800 r/min离心4 min，弃上清，加入消化 液Ⅰ,37℃孵育12 min,再用培养液洗3次以清除胰酶。将消化好的肝组织块贴于25 cm2培 养瓶中，加少许含100 ml/L BS培养液置37℃、5% CO2条件下2～3 h后再补充6 ml含100 m l/L BS培养液。待细胞长出生长晕后改为50 ml/L BS培养液。
1.4 鼠肝细胞单层培养
动物和肝组织处理同上，加入消化液Ⅱ，置4℃过夜消化，去 除消化液加含100 ml/L BS培养液，用滴管轻轻吹打成细胞悬液，经200目尼龙筛网过滤后用 培养液洗2次，4 ℃ 50 g离心4 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>80%,按5×105/ml 密度接种，于37℃、5% CO2条件下培养，待细胞贴壁生长后改为50 ml/L BS培养液。
, 百拇医药
1.5 肝细胞形态观察及其功能测定
原代培养前3 d尽量不晃动培养瓶，以后每天观察 细胞生长情况，每次换液前收集培养上清放-20℃保存，送本院检验科测定白蛋白含量。
1.6 电镜检测
待细胞生长成单层后倾去培养液刮取单层细胞加入25 ml/L戊二醛固定后按常规 方法制片，电镜(Opton EM10C,德国)观察细胞结构。
2 结果
2.1 细胞生长情况观察
原代组织块培养一般3 d后组织块周围有生长晕出现，且逐渐向周围扩展，单层细胞 3 d后已贴壁生长。光镜下可见培养的肝细胞呈三角形、圆形或类圆形，排列整齐，细胞界 限清晰，胞浆丰富透亮。细胞核有单核、双核，呈圆形或椭圆形，核仁清晰可见。
, 百拇医药
2.2 电镜观察
培养肝细胞在电镜下可见到细胞间毛细胆管，玫瑰花瓣样糖原颗粒、车轮状线粒体、大 量粗、滑面内质网。
2.3 不同血清浓度及成分培养基对肝细胞增殖的影响
见表1。
表1 不同浓度及成分培养基对肝细胞增殖的影响 培养基小牛血清浓度及成分
贴壁前 贴壁后，贴壁情况
肝细胞纯度
(%)
20 %
20 %
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+++
60～70
10 %+因子
5 %+因子
++
>95
5 %+因子
5 %+因子
+
90
10 %+因子
3 %+因子
++
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90(生长缓慢)
2.4 白蛋白检测结果
见表2。表2 原代鼠肝细胞培养上清内白蛋白含量(g/L)动态变化(
±s) 培养天数3
6
9
12
15
18
培养上清(n=25)
1.72±0.28
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3.95±0.30
4.76±0.14
4.44±0.15
2.83±0.18
2.52±0.17
培养液白蛋白含量为0.5 g/L
3 讨论
Seglen[1]的原位两步灌注法为分离肝细胞的经典方法，它采用无Ca2+、Mg 2+的Hank's液 及胶原酶两步灌注，去除红细胞效果好，所分离的肝细胞较纯，细胞存活率高，主要适用于 中等大小动物，而较小动物(如小鼠)则因其解剖结构细小，操作复杂不易成功。王宇明 [2]采用分离小鼠肝细胞的简易灌流法获成功，但灌流法毕竟操作复杂，容易污染。 本实验 采用非灌流法分离小鼠肝细胞也获成功。首先，用断头法处死动物可大大减少肝组织内血含 量，而经充分漂洗，剥除纤维成分,4℃低速离心,可将大部分肝细胞沉淀而纯化。此外，笔 者经过多次对比实验发现在冰浴条件下操作可大大提高成功率，这可能是由于肝细胞在低温 条件下代谢减慢，致抗损伤能力增强的结果。酶的浓度及消化时间也是肝细胞培养成功的另 一个关键步骤，组织块培养采用37℃ 1 g/L胰酶消化10～15 min,单层细胞培养用4℃ 2 g/L 胶原酶Ⅳ过夜消化效果佳，此点与罗树衡[3]及裴许芳[4]报道一致。
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肝细胞培养条件特殊，若采用常规血清浓度培养基可致纤维细胞过度生长。国外学者采用无 血清培养基[5]抑制纤维细胞生长，但需加入诸多生长因子、激素及营养素，如表 皮生长因子、胰高血糖素、亚硒酸等，促进肝细胞生长，但这些成分价格昂贵，有些国内不 易得到。本实验采用改良50 ml/L血清培养基辅以肝细胞生长因子、促甲状腺激素释放激素 、氢化可的松等激素及营养素也获得纯度>95%的肝细胞。
从白蛋白检测结果来看，我们培养的细胞是具有一定生物学特性及功能的肝细胞，其分 泌白蛋白含量随培养天数增加而增加，至培养9 d时达峰值，随后又逐渐下降，培养的第6～ 12 d左右为原代肝细胞功能最佳观察和实验阶段。
1974年Phillips[6]等认为电镜下细胞间存在毛细胆管，胞浆内大量玫瑰花瓣 样糖原颗粒、大量粗面及滑面内质网及车轮状线粒体即可确定为肝细胞。本实验培养肝细胞 也具有上述超微结构，从细胞形态学上得以证实其性质。
, 百拇医药
原代鼠肝细胞培养成功为研究肝细胞的生物学特性及肝细胞多种感染性损伤、癌变机制提供 了一个良好的实验模型。本实验采用的方法简单易行，所用的改良培养基有效且大大降低了 成本，适应中国国情，宜于推广应用。
聂兴草，女，1974年生，医学硕士
参考文献
1，Alpini G, Phillips J O, Vorman B et al. Recent advance in the is olation of liver cells. Hepatology, 1994, 20: 494
2，王宇明. 分离小鼠肝细胞的一种简易灌流法. 中国应用生理学杂志, 1993, 9( 1): 65
3，罗树衡，舒衡平. 鼠肝细胞的分离及传代培养. 湖南医科大学学报, 1991, 16(2): 189
, http://www.100md.com
4，裴许芳，于志兰. 人胚胎肝样上皮细胞的体外培养. 细胞生物学杂志, 1987, 9(1): 28
5，Iacovacci S, Manzis A, Barca S et al. Molecular characterization an d dynamics of hepatitis C virus replication in human fetal hepatocytes infected in vitro. Hepatology, 1997, 26: 1328
6，Phillips M J, Oda M, Edwards V D et al. Ultrastructural and func tional studies of cultured hepatocyte. Lab Invest, 1974, 31: 533
(收稿：1999-05-28), 百拇医药