青心酮对血管内皮细胞和红细胞生物力学特性的影响*
作者：叶笃筠 黄云峰 吴萍 熊宗斌 余尚斌 黄引平
单位：同济医科大学基础医学院病理生理学教研室，武汉 430030
关键词：青心酮；微管吸吮；内皮细胞；红细胞
同济医科大学学报000209 摘要：采用微管吸吮技术观察了体外培养肺血管内皮 细胞及新鲜分离的红细胞在用青心酮处理后生物力学特性的变化。与未用药组比较，在加用 青心酮30 min后，中、大剂量组内皮细胞弹性系数K1和K2 增大(P<0.05),粘性系 数μ变化不大；红细胞表观变形指数和最大变形值也明显增加(P<0.05或P<0.01) 。提示青心酮可以增加肺血管内皮细胞弹性，并使红细胞变形能力明显增强，这可能是青心 酮改善血液循环的生物力学机制。
中图法分类号：R285.1， R322.1， R331.1
, 百拇医药
The Effects of DHPA on Biomechanic Prope rties of Vascular Endothelial Cells and Isolated Erythrocytes
Ye Duyun, Huang Yunfeng, Wu Ping et al
Department of Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract：The effects of DHAP on biomechanic properties of cultu red pulmonary vessel endothelial cells and isolated erythrocytes were studied by using micropipette aspiration methods. Thirty min after addition of DHAP, the e lastic coefficient K1 and K2 of endothelial cells were increased in a dose-depe n dent manner (P<0.05), and the apparent deformation index and the maximum def ormation of erythrocytes elevated (P<0,05 or P<0.01), while the viscosi tic coefficient changed slightly as compared with control group. The results ind icated that DHAP could increase the elasticity of endothelial cells and the the deformability of erythrocytes, which might be responsible for the biomechanical mechanism that DHAP improved the circulation.
, 百拇医药
Key words：DHAP;micropipette aspiration;endothelial cell;erythrocyte
青心酮(又名3，4-二羟基苯乙酮，DHAP)是从中草药秃毛冬青叶中提取的一种有效成份。 临床上已将其用于妊高征(PIH)、胎儿宫内发育迟缓(IUGR)及慢性阻塞性肺疾患(COPD)等的 治疗，并取得了良好疗效[1～3]。迄今为止，有关其改善血液循环的机制研究报道 不少，但其对血管内皮细胞(VEC)和红细胞(RBC)生物力学特性的直接影响如何，尚无文献报 道。本文应用微管吸吮技术，观察了DHAP对VEC和RBC的生物力学特性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
取2周龄80～100 g雄性Wistar大鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，DHAP(北京制药 工业研究所提供)，DMEM(高糖，Hyclone提供),FB(Hyclone提供)，胰蛋白酶(GIBCO提供)， 胶原酶(GIBCO提供)，PBS Hanks液(自配)。倒置显微镜(Axiover35,Zeiss Co.)，显微操作 器(MR5170,eppendorf Co.)，压力控制记录系统(重庆大学)，电视摄像和磁带录像机(NV-H D100Mc, Panasonic)，图像处理仪(Vidas2 1,Rontorn Co.)，微管拉制器(P87,Sutter Inst rument Co.)，CO2培养箱。
, 百拇医药
1.2 肺动脉内皮细胞培养
按我室报道方法[4]取大鼠肺动脉中段，用酶消化法获取内皮细胞进行培养， 待细胞长满瓶底后进行传代。
1.3 微管吸吮操作
将约0.5 ml细胞悬液注入一特定的圆形小室内，置于倒置显微镜载物台上。微管与显 微操作器相连，通过它连接于压力控制和记录系统。利用显微操作器控制微管尖部靠近细胞 表面，并用自动压力控制和记录系统通过微管给细胞施以2940 N/m2的阶跃负压，使细胞 的一小部分吸入微管。细胞在微管内变形过程由图像处理仪记录，并通过回放所记录的图像 测量细胞在微管内的变形值。
1.4 内皮细胞粘弹性模型和红细胞变形性分析
参照Sung[6]等的方法，采用标准线性固体模型分析内皮细胞粘弹特性。该模型由 弹性系数K1、K2的弹性元件和粘性系数μ的阻力元件构成。K1和K2代表瞬间产生与 负荷成正比的变形，μ代表任一瞬间产生与负荷成正比的变形速度。以K1和K1+K2作 为衡量细胞刚性指标，以K1/(K1+K2)作为衡量细胞弹性指标，以μ(K1+K2)/ K1×K2作为细胞蠕动时间。将红细胞吸吮实验数据按文献[6]进行归一化处理后，定义 了一个表观变形指数(Apparent deformability index, ADI)，即单位负压下被吸入管内的 红细胞长度与微管内径之比，以ADI表示红细胞通过微管的能力。另外，还用最大变性(D max)反映其变形性。
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1.5 给药方法
将传代3～4次的PAEC用胰蛋白酶消化后，用DMEM培养液清洗几次，吹打分离后随机分成对照 组、DHAP小剂量组(1.32×10-5 mol/L)、DHAP中剂量组(1.32×10-4 mol/ L)和DHAP大剂量组(6.60×10-4 mol/L)4组。抽取大鼠血液，抗凝离心分离出红细 胞后，再用等渗液稀释至1500个/ml，按上述方法分组和给药，给药后温育30 min行微管吸 吮。
2 结果
2.1 不同剂量DHAP对培养PAEC粘弹特性的影响
肺血管内皮细胞于2940 N/m2的阶跃负压作用下(图1A)，在微管内变形经历了一个初始快 速响应和其后稳定增加的时间过程，测得正常和DHAP不同剂量组PAEC弹性系数K1、K2和 粘性系数μ值(见表1)，DHAP小剂量组与对照组无显著差异。
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2.2 不同剂量DHAP对RBC特性的影响
在微管内，大鼠红细胞于98～196 Pa的负压作用下(图1B)，首先经历200～300 ms的 快速变形，然后，呈缓慢稳定增加历程，测得正常对照和DHAP不同剂量组RBC表观变形指数A MI和最大变形Dmax(见表2)。
图1 微管吸吮下PAEC、RBC开始变形
A. PAEC 负压值△P＝2940 Pa
B. RBC 负压值△P＝180 Pa
表1 不同剂量青心酮对培养肺血管内皮细胞粘弹特性的影响(n=120,
±s) 指标
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对照
小(1.32×10-5 mol/L)
中(1.32×10-4 mol/L)
大(6.60×10-4 mol/L)
K1(dyn/cm2)
492.03±116.51
524.31±113.70
543.94±69.11**
509.92±229.19**
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K2(dyn/cm2)
363.76±98.51
360.35±127.73
427.13±113.31**
560.14±144.43**
K1/(K1+K2)
196.35±126.48
203.29±78.99
150.08±39.15*
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185.59±74.71
与对照组比较 *P<0.05 **P<0.01
表2 不同剂量青心酮对大鼠红细胞变形性的影响 指标
对照
小(1.32×10-5 mol/L)
中(1.32×10-4 mol/L)
大(6.60×10-4 mol/L)
AMI
1.88±0.15
2.03±0.21**
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1.68±0.21**
4.56±0.86**
Dmax
0.77±0.14
1.17±0.15**
1.91±0.32**
5.36±1.01**
与对照组比较 **P<0.01
3 讨论
VEC被覆于血管的最内层，它介于血液与血管壁组织之间，作为血液和组织的屏障。血 液的流动，对VEC施加各种物理力，如剪切力(shear stress)、周期性牵拉力(cyclic strai n)及血液静水压力(pressure)等。由此引发VEC一系列生物学变化，如使血管内皮源性舒张 和收缩因子合成和释放的改变。细胞生物力学研究结果表明，剪切力对VEC的生物学效应产 生影响尤为明显，有人认为剪切力是与心血管疾病最相关的血流动力学因素[6]。 另一方 面，血管内的红细胞的变形能力对维持血管中的正常流态，保证微循环灌注，以及器官、组 织氧和营养物质的供应是十分必要的[7]。因而，研究活血化瘀中药对VEC和RBC的 生物力学的影响，以阐明其药理作用机制具有重要的理论和实用价值。
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临床和基础研究表明，DHAP可明显改善IUGR患者血液流变学状况[1]。那么，DHAP 这一作用与其对VEC和RBC的动力学特性直接影响关系如何，成为DHAP改善血液循环机制研究 亟待解决的问题。微管吸吮技术被认为是一种评价单个细胞变形的重要手段[5]。 本研究发现，在一定负压作用下，青心酮使肺动脉EC粘弹系数K1、K2呈剂量依赖性增加 ，而粘性系数μ变化不大。根据Kelvin模型推导，细胞的最大变形与K1或K1+ K2成反 比，K1越大，其最大变形越小，刚性则越大，而K1+ K2越大，其初始变形越小，刚性 也越大。这提示DHAP能增强肺动脉EC刚性，使其变形能力降低。DHAP能使K1/(K1+ K2)的比值增加，而此比值与弹性成正比，因而 ，DHAP也能增加肺动脉EC之弹性。DHAP增强VEC刚性，这有利于减少血流对VEC的损伤作用。 而DHAP增加VEC弹性，一方面，这有助于VEC在心血管周期收缩运动中，待压力释放后，迅速 恢复其形态以保持对下一周期的血流压力的响应。同时，DHAP使VEC弹性增大，这意味着在 相同血流压力的作用下，其剪切应变增加，后者的增大，可激发VEC释放内皮源性舒张因子( EDRF)[7]和减少内皮源性收缩因子(EDCF)的合成和释放[8]，并以旁分泌 方式调控血管 平滑肌舒缩功能，从而使血管管径增大，增加血流量。这或许是DHAP改善血液循环的重要机 制之一。
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与DHAP对VEC上述生物力学特性影响不同，DHAP则明显增加红细胞的表观变形指数ADI和 最大变形Dmax。这表明DHAP能增加红细胞变形性，这有利于RBC通过毛细血管，减少 细胞间的叠连，降低血液粘度，疏通微循环，从而活血化瘀。这一现象与以往临床观察发现 DHAP能改善IUGR患者血液流变学的结果相吻合。
总之，本实验结果表明，DHAP改善微循环的作用，不仅与其增强VEC刚性和弹性，加强 其屏障作用有关，同时也与DHAP增加红细胞变形性有关。
(本实验得到重庆大学生物工程学院吴泽志教授、王红兵老师、秦建老师和黄岂平 博士的大力支持和帮助，在此表示诚挚谢意。)
国家自然科学基金(No. 39470727)和湖北省卫生厅资助项目
叶笃筠，男，1955年生，副教授
, 百拇医药
参考文献
1，黄引平，马庭元. 青心酮治疗胎儿宫内生长迟缓的临床疗效及作用机理的研究.中华妇产科杂志，1993,28(3)：333
2，黄引平，叶笃筠，马庭元等. 青心酮对妊高征患者胎盘血管壁一氧化氮合成酶和血浆内皮素的影响.中华妇产科杂志，1996,31(6)：667
3，洪志刚，叶笃筠，刘声远. 青心酮对豚鼠气道反应性影响. 实用肺科杂志, 1998,5(4):12
4，潘德顺，于江洲，郝天玲等.红细胞生成素3’-增强子片段对内皮细胞低氧时环加氧酶-2基因表达的影响.中国病理生理杂志，1998,14(6)：608
5，冯元桢主编. 生物力学:活组织的力学特性.长沙：湖南科学技术出版社， 1986. 47～48
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6，Eskin S G,McIntire L V. Hemodynamic effects in atherosclerosis and thrombosis. Semin Thromb Hemostasis,1988,14:170
7，Kuchan M J,Frangos J A. Role of calcium and calmodulin in foe- induced nitric oxide production in endothelial cells. Am J Physiol, 1994,266:c628
8，Kuchan M J,Frangos J A. Shear stress regulates endothelin-release via protein kinase C and cGMP in cultured endothelial cells. Am J Physiol, 1993,264:H150
(收稿：1999-09-21), 百拇医药
单位：同济医科大学基础医学院病理生理学教研室，武汉 430030
关键词：青心酮；微管吸吮；内皮细胞；红细胞
同济医科大学学报000209 摘要：采用微管吸吮技术观察了体外培养肺血管内皮 细胞及新鲜分离的红细胞在用青心酮处理后生物力学特性的变化。与未用药组比较，在加用 青心酮30 min后，中、大剂量组内皮细胞弹性系数K1和K2 增大(P<0.05),粘性系 数μ变化不大；红细胞表观变形指数和最大变形值也明显增加(P<0.05或P<0.01) 。提示青心酮可以增加肺血管内皮细胞弹性，并使红细胞变形能力明显增强，这可能是青心 酮改善血液循环的生物力学机制。
中图法分类号：R285.1， R322.1， R331.1
, 百拇医药
The Effects of DHPA on Biomechanic Prope rties of Vascular Endothelial Cells and Isolated Erythrocytes
Ye Duyun, Huang Yunfeng, Wu Ping et al
Department of Pathophysiology, School of Basic Medical Sciences,Tongji Medical University, Wuhan 430030
Abstract：The effects of DHAP on biomechanic properties of cultu red pulmonary vessel endothelial cells and isolated erythrocytes were studied by using micropipette aspiration methods. Thirty min after addition of DHAP, the e lastic coefficient K1 and K2 of endothelial cells were increased in a dose-depe n dent manner (P<0.05), and the apparent deformation index and the maximum def ormation of erythrocytes elevated (P<0,05 or P<0.01), while the viscosi tic coefficient changed slightly as compared with control group. The results ind icated that DHAP could increase the elasticity of endothelial cells and the the deformability of erythrocytes, which might be responsible for the biomechanical mechanism that DHAP improved the circulation.
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Key words：DHAP;micropipette aspiration;endothelial cell;erythrocyte
青心酮(又名3，4-二羟基苯乙酮，DHAP)是从中草药秃毛冬青叶中提取的一种有效成份。 临床上已将其用于妊高征(PIH)、胎儿宫内发育迟缓(IUGR)及慢性阻塞性肺疾患(COPD)等的 治疗，并取得了良好疗效[1～3]。迄今为止，有关其改善血液循环的机制研究报道 不少，但其对血管内皮细胞(VEC)和红细胞(RBC)生物力学特性的直接影响如何，尚无文献报 道。本文应用微管吸吮技术，观察了DHAP对VEC和RBC的生物力学特性的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
取2周龄80～100 g雄性Wistar大鼠(第三军医大学实验动物中心提供)，DHAP(北京制药 工业研究所提供)，DMEM(高糖，Hyclone提供),FB(Hyclone提供)，胰蛋白酶(GIBCO提供)， 胶原酶(GIBCO提供)，PBS Hanks液(自配)。倒置显微镜(Axiover35,Zeiss Co.)，显微操作 器(MR5170,eppendorf Co.)，压力控制记录系统(重庆大学)，电视摄像和磁带录像机(NV-H D100Mc, Panasonic)，图像处理仪(Vidas2 1,Rontorn Co.)，微管拉制器(P87,Sutter Inst rument Co.)，CO2培养箱。
, 百拇医药
1.2 肺动脉内皮细胞培养
按我室报道方法[4]取大鼠肺动脉中段，用酶消化法获取内皮细胞进行培养， 待细胞长满瓶底后进行传代。
1.3 微管吸吮操作
将约0.5 ml细胞悬液注入一特定的圆形小室内，置于倒置显微镜载物台上。微管与显 微操作器相连，通过它连接于压力控制和记录系统。利用显微操作器控制微管尖部靠近细胞 表面，并用自动压力控制和记录系统通过微管给细胞施以2940 N/m2的阶跃负压，使细胞 的一小部分吸入微管。细胞在微管内变形过程由图像处理仪记录，并通过回放所记录的图像 测量细胞在微管内的变形值。
1.4 内皮细胞粘弹性模型和红细胞变形性分析
参照Sung[6]等的方法，采用标准线性固体模型分析内皮细胞粘弹特性。该模型由 弹性系数K1、K2的弹性元件和粘性系数μ的阻力元件构成。K1和K2代表瞬间产生与 负荷成正比的变形，μ代表任一瞬间产生与负荷成正比的变形速度。以K1和K1+K2作 为衡量细胞刚性指标，以K1/(K1+K2)作为衡量细胞弹性指标，以μ(K1+K2)/ K1×K2作为细胞蠕动时间。将红细胞吸吮实验数据按文献[6]进行归一化处理后，定义 了一个表观变形指数(Apparent deformability index, ADI)，即单位负压下被吸入管内的 红细胞长度与微管内径之比，以ADI表示红细胞通过微管的能力。另外，还用最大变性(D max)反映其变形性。
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1.5 给药方法
将传代3～4次的PAEC用胰蛋白酶消化后，用DMEM培养液清洗几次，吹打分离后随机分成对照 组、DHAP小剂量组(1.32×10-5 mol/L)、DHAP中剂量组(1.32×10-4 mol/ L)和DHAP大剂量组(6.60×10-4 mol/L)4组。抽取大鼠血液，抗凝离心分离出红细 胞后，再用等渗液稀释至1500个/ml，按上述方法分组和给药，给药后温育30 min行微管吸 吮。
2 结果
2.1 不同剂量DHAP对培养PAEC粘弹特性的影响
肺血管内皮细胞于2940 N/m2的阶跃负压作用下(图1A)，在微管内变形经历了一个初始快 速响应和其后稳定增加的时间过程，测得正常和DHAP不同剂量组PAEC弹性系数K1、K2和 粘性系数μ值(见表1)，DHAP小剂量组与对照组无显著差异。
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2.2 不同剂量DHAP对RBC特性的影响
在微管内，大鼠红细胞于98～196 Pa的负压作用下(图1B)，首先经历200～300 ms的 快速变形，然后，呈缓慢稳定增加历程，测得正常对照和DHAP不同剂量组RBC表观变形指数A MI和最大变形Dmax(见表2)。
图1 微管吸吮下PAEC、RBC开始变形
A. PAEC 负压值△P＝2940 Pa
B. RBC 负压值△P＝180 Pa
表1 不同剂量青心酮对培养肺血管内皮细胞粘弹特性的影响(n=120,
±s) 指标, http://www.100md.com
对照
小(1.32×10-5 mol/L)
中(1.32×10-4 mol/L)
大(6.60×10-4 mol/L)
K1(dyn/cm2)
492.03±116.51
524.31±113.70
543.94±69.11**
509.92±229.19**
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K2(dyn/cm2)
363.76±98.51
360.35±127.73
427.13±113.31**
560.14±144.43**
K1/(K1+K2)
196.35±126.48
203.29±78.99
150.08±39.15*
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185.59±74.71
与对照组比较 *P<0.05 **P<0.01
表2 不同剂量青心酮对大鼠红细胞变形性的影响 指标
对照
小(1.32×10-5 mol/L)
中(1.32×10-4 mol/L)
大(6.60×10-4 mol/L)
AMI
1.88±0.15
2.03±0.21**
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1.68±0.21**
4.56±0.86**
Dmax
0.77±0.14
1.17±0.15**
1.91±0.32**
5.36±1.01**
与对照组比较 **P<0.01
3 讨论
VEC被覆于血管的最内层，它介于血液与血管壁组织之间，作为血液和组织的屏障。血 液的流动，对VEC施加各种物理力，如剪切力(shear stress)、周期性牵拉力(cyclic strai n)及血液静水压力(pressure)等。由此引发VEC一系列生物学变化，如使血管内皮源性舒张 和收缩因子合成和释放的改变。细胞生物力学研究结果表明，剪切力对VEC的生物学效应产 生影响尤为明显，有人认为剪切力是与心血管疾病最相关的血流动力学因素[6]。 另一方 面，血管内的红细胞的变形能力对维持血管中的正常流态，保证微循环灌注，以及器官、组 织氧和营养物质的供应是十分必要的[7]。因而，研究活血化瘀中药对VEC和RBC的 生物力学的影响，以阐明其药理作用机制具有重要的理论和实用价值。
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临床和基础研究表明，DHAP可明显改善IUGR患者血液流变学状况[1]。那么，DHAP 这一作用与其对VEC和RBC的动力学特性直接影响关系如何，成为DHAP改善血液循环机制研究 亟待解决的问题。微管吸吮技术被认为是一种评价单个细胞变形的重要手段[5]。 本研究发现，在一定负压作用下，青心酮使肺动脉EC粘弹系数K1、K2呈剂量依赖性增加 ，而粘性系数μ变化不大。根据Kelvin模型推导，细胞的最大变形与K1或K1+ K2成反 比，K1越大，其最大变形越小，刚性则越大，而K1+ K2越大，其初始变形越小，刚性 也越大。这提示DHAP能增强肺动脉EC刚性，使其变形能力降低。DHAP能使K1/(K1+ K2)的比值增加，而此比值与弹性成正比，因而 ，DHAP也能增加肺动脉EC之弹性。DHAP增强VEC刚性，这有利于减少血流对VEC的损伤作用。 而DHAP增加VEC弹性，一方面，这有助于VEC在心血管周期收缩运动中，待压力释放后，迅速 恢复其形态以保持对下一周期的血流压力的响应。同时，DHAP使VEC弹性增大，这意味着在 相同血流压力的作用下，其剪切应变增加，后者的增大，可激发VEC释放内皮源性舒张因子( EDRF)[7]和减少内皮源性收缩因子(EDCF)的合成和释放[8]，并以旁分泌 方式调控血管 平滑肌舒缩功能，从而使血管管径增大，增加血流量。这或许是DHAP改善血液循环的重要机 制之一。
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与DHAP对VEC上述生物力学特性影响不同，DHAP则明显增加红细胞的表观变形指数ADI和 最大变形Dmax。这表明DHAP能增加红细胞变形性，这有利于RBC通过毛细血管，减少 细胞间的叠连，降低血液粘度，疏通微循环，从而活血化瘀。这一现象与以往临床观察发现 DHAP能改善IUGR患者血液流变学的结果相吻合。
总之，本实验结果表明，DHAP改善微循环的作用，不仅与其增强VEC刚性和弹性，加强 其屏障作用有关，同时也与DHAP增加红细胞变形性有关。
(本实验得到重庆大学生物工程学院吴泽志教授、王红兵老师、秦建老师和黄岂平 博士的大力支持和帮助，在此表示诚挚谢意。)
国家自然科学基金(No. 39470727)和湖北省卫生厅资助项目
叶笃筠，男，1955年生，副教授
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参考文献
1，黄引平，马庭元. 青心酮治疗胎儿宫内生长迟缓的临床疗效及作用机理的研究.中华妇产科杂志，1993,28(3)：333
2，黄引平，叶笃筠，马庭元等. 青心酮对妊高征患者胎盘血管壁一氧化氮合成酶和血浆内皮素的影响.中华妇产科杂志，1996,31(6)：667
3，洪志刚，叶笃筠，刘声远. 青心酮对豚鼠气道反应性影响. 实用肺科杂志, 1998,5(4):12
4，潘德顺，于江洲，郝天玲等.红细胞生成素3’-增强子片段对内皮细胞低氧时环加氧酶-2基因表达的影响.中国病理生理杂志，1998,14(6)：608
5，冯元桢主编. 生物力学:活组织的力学特性.长沙：湖南科学技术出版社， 1986. 47～48
, http://www.100md.com
6，Eskin S G,McIntire L V. Hemodynamic effects in atherosclerosis and thrombosis. Semin Thromb Hemostasis,1988,14:170
7，Kuchan M J,Frangos J A. Role of calcium and calmodulin in foe- induced nitric oxide production in endothelial cells. Am J Physiol, 1994,266:c628
8，Kuchan M J,Frangos J A. Shear stress regulates endothelin-release via protein kinase C and cGMP in cultured endothelial cells. Am J Physiol, 1993,264:H150
(收稿：1999-09-21), 百拇医药