人IgG1Fc cDNA的克隆与鉴定
作者：安云庆 柯岩 陈金栋
单位：(首都医科大学微生物学和免疫学教研室)
关键词：IgG1Fc(Fcγ1)； PUC18-Fcγ1700重组克隆载体； RT-PCR
首都医科大学学报000201 提要： 根据编码人IgG1Fc(Fcγ1)的基因序列，设计合成1对与之相匹配的引物。采用RT-PCR法，从正常人白细胞mRNA中扩增获得预期目的基因Fcγ1700 bp基因片段，成功构建PUC18-Fcγ1700重组克隆载体，酶切、酶谱分析与预期结果相符；DNA测序结果与GenBank报道一致。
中图分类号： R392.1
Cloning and Identification of
, http://www.100md.com
Human IgG1Fc cDNA
An Yunqing Ke Yan Chen Jindong
(Department of Microbiology and Immunology, Capital University of Medical Sciences)
Abstract: According to the cDNA sequences which encode the human IgG1Fc, a pair of primers were designed; The expected gene (Fcγ1700 bp) which encode Fcγ1 was amplified by RT-PCR from mRNA extracted from normal person′s leukocyte; PUC18-Fcγ1700 recombinant cloning vector was successfully constructed, and the enzyme digestion analysis are identical to expected results. Sequences are identical to those in GenBank report.
, 百拇医药
Key words: IgG1Fc gene(Fcγ1700 bp); PUC18-Fcγ1700 recombinant cloning vector; RT-PCR
Ig样重组蛋白是采用基因工程技术研制的一种由某种功能性小分子多肽或蛋白与IgFc片段嵌合而成的生物制剂。它们不仅具有某种多肽或蛋白所特有的生物学功能，而且兼备Ig的固定补体、调理作用和具有较长血清半衰期等特性[1]。杀菌/渗透-增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein, BPI)、重组BPI或其功能性氨基端片段(rBPI23)是近年发现和研制的一种非抗生素类抗感染生物制剂[2]。该种抗菌蛋白由于具有广谱杀伤G-菌和中和内毒素的作用，而得到人们的关注[3]。但是由于它们在体内的半衰期太短(<1 h)而影响其临床应用[4]。为此我们于1996年7月至1999年7月进行了BPI23-Fcγ1重组蛋白的研制，以期获得一种兼备BPI抗菌活性和Ig血清半衰期较长等特性的新型抗菌重组蛋白。下面主要介绍该课题研究的前期工作人IgG1Fc基因(Fcγ1700 bp)的克隆和鉴定。
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1 材料和方法
细胞、菌株和质粒载体：白细胞获自正常人外周血。E.coli DH5α〔基因型 supE44▲lacU169(80lacI M15)hsdR17 recA1 end A1 gyrA96 thi-1 relA1〕为本实验室保存菌株。克隆载体PUC18质粒购自北方同正生物工程公司。
主要试剂：限制性内切酶(HindIII、BamHI、SmaI)购自promega公司。T4DNA连接酶购自GIBCO/BRL公司。Taq plusI DNA聚合酶购自Sangon生物工程公司。mRNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、质粒提取纯化试剂盒购自promega公司。DNA回收纯化试剂盒购自原平皓生物制品公司。
引物设计与合成：根据已知人IgG1Fc基因序列，设计合成1对引物：P1 5′GTAAGCTT-
CTACATGCCCACCGTGCCCAG 3′，P2 5′TCG-GATCCTTATTTACCCGGAGACAGGGAG 3′。5′端引物P1含有HindIII酶切位点；3′端引物P2含有BamHI酶切位点和大肠杆菌偏性强终止密码子TAA[5]。该对引物所扩增的基因为编码IgG1Fc片段的基因，上述引物均由上海生工生物工程公司合成。
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mRNA的提取：按mRNA提取试剂盒说明从人白细胞中提取mRNA：①取正常人外周血5 mL，用淋巴细胞分离液分离白细胞后将其置于1.5 mL Eppendorf管中。②将40 μL细胞裂解液加入Eppendorf管内轻轻吹打使细胞溶解，再加入80 μL mRNA提取液Ⅰ振动混匀，14 000 r/min离心5 min。③取上清至预分装20 μL mRNA提取液Ⅱ的薄壁PCR管中混匀，70 ℃保温2 min后降至室温(18～25 ℃)静置10 min。④8 000 r/min离心2 min后弃去上清，用200 μL mRNA洗涤液吹打洗涤沉淀物，8 000 r/min离心2 min后弃上清。同法洗涤沉淀物4次后，加入10 μL mRNA保存液振动混匀备用。
RT-PCR扩增获得目的基因：按一步法RT-PCR试剂盒说明进行。逆转录反应体系由mRNA保存液10 μL、反应液Ⅰ 13 μL(5×RT-PCR缓冲液5 μL、25 mmol/L MgSO4 1.5 μL、去离子水6.5 μL)、反应液Ⅱ 1.5 μL(10 mmol/L dNTP 0.5 μL、引物1 μL)、混合酶1 μL(AMV逆转录酶0.5 μL、Taq PlusI NDA多聚酶0.5 μL)组成。反应程序：48 ℃逆转录45 min，94 ℃变性2 min后进行40个PCR循环。循环参数：94 ℃变性30 s，53.5 ℃复性40 s，72 ℃延伸45 s，末次循环后再延伸5 min。
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取扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳。根据相对分子质量Marker标示，从琼脂糖凝胶上切下含目的基因(Fcγ1700 bpDNA片段)的凝胶，按NDA快速纯化回收试剂盒操作步骤纯化回收扩增产物。
PUC18-Fcγ1700重组克隆载体的构建、筛选和鉴定：用HindⅢ/BamHI分别对扩增产物Fcγ1700bp和PUC18克隆载体进行酶切反应后，通过连接反应使两者结合构成PUC18-Fcγ1700重组克隆载体。上述重组克隆载体转化E.coli DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆菌。以PUC18-Fcγ1700重组质粒DNA为模板，在P1/P2引物指导下，对重组质粒进行PCR鉴定。然后用SmaI对PCR扩增产物(Fcγ1700 bp基因片段)进行酶谱鉴定。小提质粒后，再用HindⅢ/BamHI和SmaI分别对PUC18-Fcγ1700重组克隆载体进行酶切分析和酶谱鉴定。以上各步均参照文献[6]进行。
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DNA序列分析：从阳性克隆菌中小量提取质粒DNA，以M13 reverse primer为引物进行全自动测序(北京赛百盛生物工程公司测定)。
2 结果
RT-PCR扩增产物的鉴定：RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，在约700 bp处呈现1条与原设计产物相对分子质量大小相符的DNA条带(图1)。
图1 RT-PCR扩增产物
1 pBR322/MspI Marker
2 RT-PCR产物700 bp基因片段
PUC18-Fcγ1700重组克隆载体的筛选和鉴定：以PUC18-Fcγ1700重组质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定。结果发现在琼脂糖凝胶中呈现1条约700 bp的特异性条带(图2)，表明RT-PCR扩增产物确与预期结果相符。PCR扩增产物(Fcγ1700 bp基因片段)经SmaI酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现在约420 bp和280 bp处呈现2条DNA条带(图3)，与预期结果相符。
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图2 PUC18-Fcγ1700重组质粒PCR鉴定
1 pBR322/MspI Marker
2 阳性克隆的PCR产物700 bp基因片段
图3 700 bp基因酶切产物
1 pBR322/MspI Marker
2 700 bp基因酶切产物420 bp/280 bpn基因片段
取PUC18-Fcγ1700重组克隆载体转化的E.coli DH5α细菌，小提质粒后经酶切和酶谱分析发现：①PUC18-Fcγ1700重组克隆载体经HindⅢ/BamHI酶切后获得1个约700 bp的基因片段(图4)；经SmaI酶切后获得1个约280 bp的基因片段(图5)。上述各酶切片段与预期结果相符，表明Fcγ1700 bp片段已被整合在PUC18质粒载体的HindⅢ和BamHI酶切位点之间。
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图4 PUC18-Fcγ1700重组质粒酶切鉴定
1 pBR322/MspI Marker
2 HindⅢ/BamHⅠ酶切产物700 bp基因片段
图5 PUC18-Fcγ700重组质粒酶谱鉴定
1 pBR322/MspI Marker
2 SmaI酶切产物280 bp基因片段
PCR产物的测序结果如下所示，与GeneBank报道一致。
ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACT-
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CCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC-
CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC-
TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT-
GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGG-
TCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG-
GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG-
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGG-
TGGTCAGCGTCCTACCGTCCTGCACCAGG-
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ACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC-
AAGGTCTCCAACCAGCCCCGAGAACCACA-
GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGG-
AGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC-
TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGA-
CATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC-
AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCT-
CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT-
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CCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGA-
GCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA-
TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA-
CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT-
CCCCGGGTAAATAATAGGATCC
3 讨论
革兰阴性细菌败血症(GNS)及其休克有很高的病死率[7]，传统抗生素治疗和采用抗脂多糖类脂A单克隆抗体或抗IL-1、TNF单克隆抗体进行免疫治疗均未获得令人满意的效果[8，9]。rBPI和rBPI23的研制成功为GNS及其休克的防治带来了希望，但是由于它们在体内的半衰期太短而影响了临床的实际应用。我们采用基因工程技术研制BPI23-Fcγ1重组抗菌蛋白可集BPI和Ig两者抗感染优势于一体，有可能获得良好的临床治疗效果。本研究主要介绍了该课题研究的前期工作，即IgG1Fc基因的克隆和鉴定。
, 百拇医药
根据编码IgG1重链羧基端231个氨基酸的基因序列，设计合成了1对与之相匹配的引物。其中5′端引物P1加入HindⅢ酶切位点，酶切后通过连接反应可与BPI600 bp3′端结合；3′端引物P2加入BamHI酶切位点，并以大肠杆菌偏性强终止密码子TAA取代Fcγ1片段本身具有的终止密码子TAG[5]，以保证外源基因在E.coli中的正确表达。在上述引物指导下，采用RT-PCR技术，从正常人白细胞mRNA中成功地扩增获得了预期目的基因Fcγ1700 bp基因片段。实验中选择具有纠错功能的Taq plus I DNA polymerase参加反应，保证了RT-PCR反应的忠实性、特异性和成功率。
PUC18质粒为克隆/测序载体经HindⅢ/BamHI酶切形成粘性末端后，与具有粘性末端的Fcγ1700 bp基因片段通过连接反应构建形成 PUC18-Fcγ1700重组质粒载体。该重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞后，经蓝白斑筛选获得若干白色菌落，然后通过PCR扩增和扩增产物的酶谱分析鉴定，获得若干阳性克隆菌。增菌小提质粒后，对所提质粒进行酶切酶谱分析鉴定，结果发现各酶切片段与预期结果相符，表明Fcγ1700 bp基因片段已整合插入到PUC18质粒载体相应酶切位点之间。DNA序列分析结果也与GeneBank报道一致，证实RT-PCR扩增产物确为编码IgG1重链羧基端231个氨基酸的基因片段。
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PUC18-Fcγ1700重组质粒载体的获得，为BPI23-Fcγ1重组蛋白的研制奠定了工作基础。
国家自然科学基金资助项目(39570666)
参 考 文 献
1，Hodges T L. Phase I study of recombinant human CD4-immunoglobulin G therapy of patient with Aids and Aids-related complex. Antimicro Agonts Chemother,1991,35:2580～2586
2，Weiss J, Elsbach P, Olson I, et al. Purification and characterization of a potent bactericidal and membrane active protein from the granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Biol Chem, 1978,253:2664～2672
, 百拇医药
3，Marra M N, Wilde C G, Collins M S, et al. The role of bactericidal/permeability-increasing protein as a natural inhibitor of bacterial endotoxin. J Immunol,1992,148(2):532～537
4，Robert J B, Kenneth D, Nneka O I, et al. The role of Liver and Kidney on the pharmacokinetics of a recombinant amino terminal fragment of bactericidal/permeability-increasing protein in rats. Pharm Res,1997,14(2):224～229
5，Grosjian H, Wetal F. Preferential codon usage in prokaryotic gene: The optimal codon anticodon interaction energy and selective usage efficiently expressed gene. Gene,1982,18:199
, 百拇医药
6，Sambrook J. Molecular cloning: A laboratory manual. 2 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory,1989
7，Dahlberg P S, Acton R D, Battafarano R J. A novel endotoxin antagonist attennates tumor necrosis factor-alpha secrection. J Surg Res,1996,63:44～48
8，Verhoef J, Hustinx W M, Frase H, et al. Issues in the adjunct therapy of severe sepsis. J Antimicrob Chemother,1996,38(2):167～182
9，Mccloskey R U, Straube R C, Sander C, et al. Treatment of septic shock with human monoclonal antibody HA-1A. Ann Intern Med,1994,121:1
收稿日期：1999-08-27, 百拇医药
单位：(首都医科大学微生物学和免疫学教研室)
关键词：IgG1Fc(Fcγ1)； PUC18-Fcγ1700重组克隆载体； RT-PCR
首都医科大学学报000201 提要： 根据编码人IgG1Fc(Fcγ1)的基因序列，设计合成1对与之相匹配的引物。采用RT-PCR法，从正常人白细胞mRNA中扩增获得预期目的基因Fcγ1700 bp基因片段，成功构建PUC18-Fcγ1700重组克隆载体，酶切、酶谱分析与预期结果相符；DNA测序结果与GenBank报道一致。
中图分类号： R392.1
Cloning and Identification of
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Human IgG1Fc cDNA
An Yunqing Ke Yan Chen Jindong
(Department of Microbiology and Immunology, Capital University of Medical Sciences)
Abstract: According to the cDNA sequences which encode the human IgG1Fc, a pair of primers were designed; The expected gene (Fcγ1700 bp) which encode Fcγ1 was amplified by RT-PCR from mRNA extracted from normal person′s leukocyte; PUC18-Fcγ1700 recombinant cloning vector was successfully constructed, and the enzyme digestion analysis are identical to expected results. Sequences are identical to those in GenBank report.
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Key words: IgG1Fc gene(Fcγ1700 bp); PUC18-Fcγ1700 recombinant cloning vector; RT-PCR
Ig样重组蛋白是采用基因工程技术研制的一种由某种功能性小分子多肽或蛋白与IgFc片段嵌合而成的生物制剂。它们不仅具有某种多肽或蛋白所特有的生物学功能，而且兼备Ig的固定补体、调理作用和具有较长血清半衰期等特性[1]。杀菌/渗透-增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein, BPI)、重组BPI或其功能性氨基端片段(rBPI23)是近年发现和研制的一种非抗生素类抗感染生物制剂[2]。该种抗菌蛋白由于具有广谱杀伤G-菌和中和内毒素的作用，而得到人们的关注[3]。但是由于它们在体内的半衰期太短(<1 h)而影响其临床应用[4]。为此我们于1996年7月至1999年7月进行了BPI23-Fcγ1重组蛋白的研制，以期获得一种兼备BPI抗菌活性和Ig血清半衰期较长等特性的新型抗菌重组蛋白。下面主要介绍该课题研究的前期工作人IgG1Fc基因(Fcγ1700 bp)的克隆和鉴定。
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1 材料和方法
细胞、菌株和质粒载体：白细胞获自正常人外周血。E.coli DH5α〔基因型 supE44▲lacU169(80lacI M15)hsdR17 recA1 end A1 gyrA96 thi-1 relA1〕为本实验室保存菌株。克隆载体PUC18质粒购自北方同正生物工程公司。
主要试剂：限制性内切酶(HindIII、BamHI、SmaI)购自promega公司。T4DNA连接酶购自GIBCO/BRL公司。Taq plusI DNA聚合酶购自Sangon生物工程公司。mRNA提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、质粒提取纯化试剂盒购自promega公司。DNA回收纯化试剂盒购自原平皓生物制品公司。
引物设计与合成：根据已知人IgG1Fc基因序列，设计合成1对引物：P1 5′GTAAGCTT-
CTACATGCCCACCGTGCCCAG 3′，P2 5′TCG-GATCCTTATTTACCCGGAGACAGGGAG 3′。5′端引物P1含有HindIII酶切位点；3′端引物P2含有BamHI酶切位点和大肠杆菌偏性强终止密码子TAA[5]。该对引物所扩增的基因为编码IgG1Fc片段的基因，上述引物均由上海生工生物工程公司合成。
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mRNA的提取：按mRNA提取试剂盒说明从人白细胞中提取mRNA：①取正常人外周血5 mL，用淋巴细胞分离液分离白细胞后将其置于1.5 mL Eppendorf管中。②将40 μL细胞裂解液加入Eppendorf管内轻轻吹打使细胞溶解，再加入80 μL mRNA提取液Ⅰ振动混匀，14 000 r/min离心5 min。③取上清至预分装20 μL mRNA提取液Ⅱ的薄壁PCR管中混匀，70 ℃保温2 min后降至室温(18～25 ℃)静置10 min。④8 000 r/min离心2 min后弃去上清，用200 μL mRNA洗涤液吹打洗涤沉淀物，8 000 r/min离心2 min后弃上清。同法洗涤沉淀物4次后，加入10 μL mRNA保存液振动混匀备用。
RT-PCR扩增获得目的基因：按一步法RT-PCR试剂盒说明进行。逆转录反应体系由mRNA保存液10 μL、反应液Ⅰ 13 μL(5×RT-PCR缓冲液5 μL、25 mmol/L MgSO4 1.5 μL、去离子水6.5 μL)、反应液Ⅱ 1.5 μL(10 mmol/L dNTP 0.5 μL、引物1 μL)、混合酶1 μL(AMV逆转录酶0.5 μL、Taq PlusI NDA多聚酶0.5 μL)组成。反应程序：48 ℃逆转录45 min，94 ℃变性2 min后进行40个PCR循环。循环参数：94 ℃变性30 s，53.5 ℃复性40 s，72 ℃延伸45 s，末次循环后再延伸5 min。
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取扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳。根据相对分子质量Marker标示，从琼脂糖凝胶上切下含目的基因(Fcγ1700 bpDNA片段)的凝胶，按NDA快速纯化回收试剂盒操作步骤纯化回收扩增产物。
PUC18-Fcγ1700重组克隆载体的构建、筛选和鉴定：用HindⅢ/BamHI分别对扩增产物Fcγ1700bp和PUC18克隆载体进行酶切反应后，通过连接反应使两者结合构成PUC18-Fcγ1700重组克隆载体。上述重组克隆载体转化E.coli DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选获得阳性克隆菌。以PUC18-Fcγ1700重组质粒DNA为模板，在P1/P2引物指导下，对重组质粒进行PCR鉴定。然后用SmaI对PCR扩增产物(Fcγ1700 bp基因片段)进行酶谱鉴定。小提质粒后，再用HindⅢ/BamHI和SmaI分别对PUC18-Fcγ1700重组克隆载体进行酶切分析和酶谱鉴定。以上各步均参照文献[6]进行。
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DNA序列分析：从阳性克隆菌中小量提取质粒DNA，以M13 reverse primer为引物进行全自动测序(北京赛百盛生物工程公司测定)。
2 结果
RT-PCR扩增产物的鉴定：RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，在约700 bp处呈现1条与原设计产物相对分子质量大小相符的DNA条带(图1)。
图1 RT-PCR扩增产物
1 pBR322/MspI Marker
2 RT-PCR产物700 bp基因片段
PUC18-Fcγ1700重组克隆载体的筛选和鉴定：以PUC18-Fcγ1700重组质粒DNA为模板进行PCR扩增鉴定。结果发现在琼脂糖凝胶中呈现1条约700 bp的特异性条带(图2)，表明RT-PCR扩增产物确与预期结果相符。PCR扩增产物(Fcγ1700 bp基因片段)经SmaI酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现在约420 bp和280 bp处呈现2条DNA条带(图3)，与预期结果相符。
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图2 PUC18-Fcγ1700重组质粒PCR鉴定
1 pBR322/MspI Marker
2 阳性克隆的PCR产物700 bp基因片段
图3 700 bp基因酶切产物
1 pBR322/MspI Marker
2 700 bp基因酶切产物420 bp/280 bpn基因片段
取PUC18-Fcγ1700重组克隆载体转化的E.coli DH5α细菌，小提质粒后经酶切和酶谱分析发现：①PUC18-Fcγ1700重组克隆载体经HindⅢ/BamHI酶切后获得1个约700 bp的基因片段(图4)；经SmaI酶切后获得1个约280 bp的基因片段(图5)。上述各酶切片段与预期结果相符，表明Fcγ1700 bp片段已被整合在PUC18质粒载体的HindⅢ和BamHI酶切位点之间。
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图4 PUC18-Fcγ1700重组质粒酶切鉴定
1 pBR322/MspI Marker
2 HindⅢ/BamHⅠ酶切产物700 bp基因片段
图5 PUC18-Fcγ700重组质粒酶谱鉴定
1 pBR322/MspI Marker
2 SmaI酶切产物280 bp基因片段
PCR产物的测序结果如下所示，与GeneBank报道一致。
ACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACT-
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CCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCC-
CCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC-
TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGT-
GGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGG-
TCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTG-
GAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCG-
GGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGG-
TGGTCAGCGTCCTACCGTCCTGCACCAGG-
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ACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC-
AAGGTCTCCAACCAGCCCCGAGAACCACA-
GGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGG-
AGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACC-
TGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGA-
CATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGC-
AGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCT-
CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT-
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CCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGA-
GCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA-
TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAA-
CCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT-
CCCCGGGTAAATAATAGGATCC
3 讨论
革兰阴性细菌败血症(GNS)及其休克有很高的病死率[7]，传统抗生素治疗和采用抗脂多糖类脂A单克隆抗体或抗IL-1、TNF单克隆抗体进行免疫治疗均未获得令人满意的效果[8，9]。rBPI和rBPI23的研制成功为GNS及其休克的防治带来了希望，但是由于它们在体内的半衰期太短而影响了临床的实际应用。我们采用基因工程技术研制BPI23-Fcγ1重组抗菌蛋白可集BPI和Ig两者抗感染优势于一体，有可能获得良好的临床治疗效果。本研究主要介绍了该课题研究的前期工作，即IgG1Fc基因的克隆和鉴定。
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根据编码IgG1重链羧基端231个氨基酸的基因序列，设计合成了1对与之相匹配的引物。其中5′端引物P1加入HindⅢ酶切位点，酶切后通过连接反应可与BPI600 bp3′端结合；3′端引物P2加入BamHI酶切位点，并以大肠杆菌偏性强终止密码子TAA取代Fcγ1片段本身具有的终止密码子TAG[5]，以保证外源基因在E.coli中的正确表达。在上述引物指导下，采用RT-PCR技术，从正常人白细胞mRNA中成功地扩增获得了预期目的基因Fcγ1700 bp基因片段。实验中选择具有纠错功能的Taq plus I DNA polymerase参加反应，保证了RT-PCR反应的忠实性、特异性和成功率。
PUC18质粒为克隆/测序载体经HindⅢ/BamHI酶切形成粘性末端后，与具有粘性末端的Fcγ1700 bp基因片段通过连接反应构建形成 PUC18-Fcγ1700重组质粒载体。该重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞后，经蓝白斑筛选获得若干白色菌落，然后通过PCR扩增和扩增产物的酶谱分析鉴定，获得若干阳性克隆菌。增菌小提质粒后，对所提质粒进行酶切酶谱分析鉴定，结果发现各酶切片段与预期结果相符，表明Fcγ1700 bp基因片段已整合插入到PUC18质粒载体相应酶切位点之间。DNA序列分析结果也与GeneBank报道一致，证实RT-PCR扩增产物确为编码IgG1重链羧基端231个氨基酸的基因片段。
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PUC18-Fcγ1700重组质粒载体的获得，为BPI23-Fcγ1重组蛋白的研制奠定了工作基础。
国家自然科学基金资助项目(39570666)
参 考 文 献
1，Hodges T L. Phase I study of recombinant human CD4-immunoglobulin G therapy of patient with Aids and Aids-related complex. Antimicro Agonts Chemother,1991,35:2580～2586
2，Weiss J, Elsbach P, Olson I, et al. Purification and characterization of a potent bactericidal and membrane active protein from the granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Biol Chem, 1978,253:2664～2672
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3，Marra M N, Wilde C G, Collins M S, et al. The role of bactericidal/permeability-increasing protein as a natural inhibitor of bacterial endotoxin. J Immunol,1992,148(2):532～537
4，Robert J B, Kenneth D, Nneka O I, et al. The role of Liver and Kidney on the pharmacokinetics of a recombinant amino terminal fragment of bactericidal/permeability-increasing protein in rats. Pharm Res,1997,14(2):224～229
5，Grosjian H, Wetal F. Preferential codon usage in prokaryotic gene: The optimal codon anticodon interaction energy and selective usage efficiently expressed gene. Gene,1982,18:199
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6，Sambrook J. Molecular cloning: A laboratory manual. 2 ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory,1989
7，Dahlberg P S, Acton R D, Battafarano R J. A novel endotoxin antagonist attennates tumor necrosis factor-alpha secrection. J Surg Res,1996,63:44～48
8，Verhoef J, Hustinx W M, Frase H, et al. Issues in the adjunct therapy of severe sepsis. J Antimicrob Chemother,1996,38(2):167～182
9，Mccloskey R U, Straube R C, Sander C, et al. Treatment of septic shock with human monoclonal antibody HA-1A. Ann Intern Med,1994,121:1
收稿日期：1999-08-27, 百拇医药