热休克蛋白70在3T3细胞创伤愈合中的作用
作者：王昭领 雷德林
单位：第四军医大学口腔医学院颌面外科 710032
关键词：3T3细胞；热休克蛋白70；创伤愈合
实用口腔医学杂志000212 〔摘要〕 目的：探讨热休克蛋白70(HSP70)在细胞创伤后增殖中的作用。方法：采用细胞机械创伤模型，检测创伤后48 h时热处理细胞及 非热处理细胞的增殖活性，并用免疫细胞化学的方法检测两组细胞生长过程中HSP70的表达 。结果：非热处理组细胞在增殖期表达HSP70。热处理可诱导HSP70 的表达，热处理组创伤后细胞的增殖活性明显高于非热处理组。结论：HSP70参与细胞增殖过程，热处理引起的细胞增殖活性升高可能与HSP70的功能有关。
中图分类号：Q274 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)02-0122-03
, 百拇医药
The role of heat shock protein 70 in cell proliferation after scrape wound of 3T 3 cells in vitro
Wang Zhaoling,Lei Delin
(Department.of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatologi cal College,Fourth Military University,Xi'an 710032)
〔Abstracts〕Objectives:To study the role of heat shock protein 70 (H SP70) in cell proliferation after wound.Methods:The mechan ical scrape wound model of 3T3 cell was used.Cells were divided into heat pre-t reated group and non-pretreated group.Their proliferation ability at 48 h after wound was measured via MTT assay.The expression of HSP70 was detected by immuno cytochemistry.Results:HSP70 strongly expressed when cells were proliferating.After heat pretreated,cells were induced to express HSP70.The A values of heat-pretreated cells and non-pretrated were 2.15±0.14 and 1.67 ±0.28 respectively (P<0.01).Conclusion:HSP70 may play a role in cell proliferation and the enhanced cell proliferation by heat pretre atment may be due to the functions of HSP70.
, 百拇医药
Key words 3T3 cell;Heat shock protein 70;Wound healing
热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)是细胞内一类进化上高度保守的应激蛋白，可 参与蛋白的折叠、组装、转运与蛋白复合物的降解以及DNA的复制与修复等过程〔1〕 ，而在细胞增殖时这些作用至关重要。在HSPs家族中，HSP70是最重要的一类，哺乳动物细 胞中的HSPs即以HSP70为主。本实验应用NIH3T3细胞的体外创伤模型，试图探讨HSP70在细胞 创伤后增殖中的作用，进而研究其与创伤愈合的关系。
1 材料与方法
1.1 主要材料
NIH3T3细胞及培养用品、台盼兰染液、MTT溶液(5 g/L)，由第四军医大学口腔医学院生物教 研室提供。酶联免疫检测仪(华东电子管厂)。HSP70单克隆抗体(Sigma公司)。SABC试剂盒( 博士德公司)。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 用含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液常规培养NIH3T3细胞。实验 分为热处理组及非热处理组。
1.2.2 热处理 待细胞长成单层细胞后，将热处理组细胞置于42 ℃环境下孵育20 min，用 培养液冲洗两次后，再加入培养液于37 ℃环境下继续培养。非热处理组细胞作对照。
1.2.3 细胞创伤模型的建立 3T3细胞按1×104/孔密度接种于96孔培养板，37 ℃培养。 待长成单层细胞后按Stewart〔2〕方式用200 μl移液器滴头造成细胞机械性划伤模 型，用吸管吸去脱落细胞，并用新鲜培养液冲洗两次后再加入培养液继续培养。
1.2.4 细胞活性检测 热处理组单层细胞经热处理后消化成单细胞悬液，进行台盼兰排斥 试验〔3〕，计算细胞存活率，并与非热处理组比较。
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1.2.5 细胞增殖活性检测 3T3细胞按1×104/孔的细胞密度接种于96孔培养板，待长成 单层细胞后，按上述方法进行热处理及创伤，创伤后继续培养48 h行MTT比色试验〔3〕 。
1.2.6 免疫细胞化学检测染色 3T3细胞按2×104/孔接种于24孔板，孔内置0.3 cm×0.3 cm大小盖玻片。24 h后热处理组按上述方法进行热处理，并于热处理后0、24、48 h及细胞 长成单层时取出细胞爬片，用体积分数为95%酒精固定后按SABC方法(按试剂盒说明)检测HSP 70的表达。同时，非热处理组作对照。
1.3 统计学处理
对创伤后48 h时两组细胞MTT比色值及热处理后两组细胞的存活率进行t检验。
2 结 果
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2.1 一般观察
3T3细胞为梭形或多突起形扁平细胞，接种24 h后细胞贴壁、伸展，48 h时细胞增殖旺盛， 可见细胞分裂现象。按1×104/孔接种于96孔板，72 h后即可长成单层细胞，创伤后12 h 可观察到创缘细胞向创伤裸区内移动。创伤后48 h，热处理组创伤裸区内细胞数目较非热处 理组多，已基本覆盖创伤区(如图1，2)。
图1 热处理组(3T3细胞)创伤后48 h细胞基本已覆盖创伤裸区(10×△ 示创缘)
图2 非处理组(3T3细胞)创伤后48 h细胞数目较热处理组少(△示创缘)
2.2 细胞存活率
热处理组(95.5±0.5)%，非热处理组(93.5±1.5)%，两组间无显著性差异P>0.05。
, 百拇医药
2.3 细胞增殖活性检测
MTT比色试验结果表明热处理组光吸收值为2.15±0.14，非热处理组1.67±0.28，两组 相比较具有显著性差异P<0.01。
2.4 免疫细胞化学染色结果
非热处理组细胞接种24 h后(相当于热处理后 0 h)，细胞贴壁、伸展，此时HSP70表达基本 为阴性；48 h时，在胞浆及胞核内均可见HSP70着色，当细胞长成单层后，HSP70表达又转为 阴性。在热处理组，热处理后即可见细胞浆内HSP70表达，此后，其表达一直持续在较高水 平。即使细胞长成单层时，HSP70的表达仍为阳性。
3 讨 论
HSPs是一类具有维持机体自身稳定功能的应激蛋白，热与多种刺激均可诱导其表达，特别是 HSP70在几乎所有生物的应激细胞中都经常高度地被诱导。NIH3T3细胞为成纤维细胞，而创 伤愈合中，修复细胞即以成纤维细胞为主，因此，用3T3细胞建立体外创伤模型能较好地模 拟创伤愈合过程。
, 百拇医药
Polla 〔4〕认为高于种属体温3～4 ℃时，短时间(通常为20 min)即可诱导HSPs的合 成。本实验用42 ℃处理3T3细胞20 min后即发现了HSP70表达。台盼兰排斥实验的结果表明 这种热刺激是非致死性的，可以用来诱导HSP70 的合成从而进行有关研究。
免疫细胞化学的研究表明，非热处理组3T3细胞在接种24 h及长成单层细胞时，HSP70的表达 很弱；而48 h时，HSP70在胞浆及胞核内均有表达，HSP70的这种表达变化可能与细胞的增殖 状态有关。如上所述，3T3细胞在接种24 h后贴壁、伸展，细胞生长不活跃；在长成单层细 胞时，细胞增殖基本停止；而在48 h时，细胞处于增殖活跃期。这说明在细胞增殖时，HSP7 0的合成增加。我们先前的研究也发现，在生长活跃的肉芽组织中HSP70呈现高表达，而在疤 痕化组织中基本不表达。
MTT比色实验表明，创伤后热处理组细胞增殖活性明显高于非热处理组。创伤的愈合有赖于 细胞的增殖及迁移，说明非致死性的热处理能促进创伤的愈合。实验中也发现在创伤裸区内 ，热处理组细胞数目明显多于非热处理组，这可能与细胞内高水平的HSP70有关。有实验发 现，静止期HeLa细胞经血清刺激进入增殖状态时，可诱导HSP70及其mRNA的表达，并且HSP70 在S期集中于核内〔5〕，表明其在某种水平上参与了细胞的增殖。近来有学者用可诱 导HSP70的药物作用于糖尿病大鼠的背部创面，结果发现创面愈合加速〔6〕，说明HS P70参与了创伤愈合过程。
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研究发现，HSP70具有两个结构域，即ATP酶区和肽结合区〔7〕，借助ATP水解产生的 能量，HSP70可与其他蛋白相互作用，参与蛋白的合成、转运以及变性蛋白的复性等。HSP70 对细胞增殖的影响可能与其作用于增殖相关蛋白有关，如通过减少一些抑制性酶的合成或促 进抑制性蛋白与目标DNA分离等方式启动细胞增殖过程〔8〕。
尽管实验发现细胞增殖过程中有HSP70的表达，而且通过热处理诱导后细胞的增殖活性升高 并可因此促进创伤的愈合，但HSP70在细胞增殖及创伤愈合过程中的作用机制尚需近一步探 讨。
参考文献
1,Oberringer M,Baum HP,Jung V,et al.Differential expression of heat s hock protein 70 in well healing and chronic human wound tissue.Biochem Biophys R es Commun,1995,214(3):1009
, 百拇医药
2,Stewart RJ,Duley JA,Allardyce RA.The migration of fibroblasts into an in vit ro wound.Br J Exp Path,1979,60:582
3,司徒镇强,吴军正主编.细胞培养.西安:世界图书出版社西安公司,1996.181,186～187
4,Polla BS.A role for heat shock proteins in inflammation? Immuno Today,1988,9(5 ):134
5,Ferris DK,Bellan AH,Morimoto RI,et al.Mitogen and lymphokine stimulation o f heat shock proteins in T lymphocytes.Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:3850
, 百拇医药
6,Vigh L,Literati P,Horvath I,et al.Bimoclomol:A nontoxic,hydroxylamine deri vative with stress protein-inducing activity and cytoprotective effects.Nat Med ,1997,3(10):1150
7,Feige U,Polla BS.Heat shock protins:The hsp70 family.Experientia,1994,50:979
8,Wu BJ,Morrimoto I.Transcription of the human hsp70 gene is induced by serum st imulation.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:6070
(收稿：1999-03-26修回：1999-06-30), 百拇医药
单位：第四军医大学口腔医学院颌面外科 710032
关键词：3T3细胞；热休克蛋白70；创伤愈合
实用口腔医学杂志000212 〔摘要〕 目的：探讨热休克蛋白70(HSP70)在细胞创伤后增殖中的作用。方法：采用细胞机械创伤模型，检测创伤后48 h时热处理细胞及 非热处理细胞的增殖活性，并用免疫细胞化学的方法检测两组细胞生长过程中HSP70的表达 。结果：非热处理组细胞在增殖期表达HSP70。热处理可诱导HSP70 的表达，热处理组创伤后细胞的增殖活性明显高于非热处理组。结论：HSP70参与细胞增殖过程，热处理引起的细胞增殖活性升高可能与HSP70的功能有关。
中图分类号：Q274 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)02-0122-03
, 百拇医药
The role of heat shock protein 70 in cell proliferation after scrape wound of 3T 3 cells in vitro
Wang Zhaoling,Lei Delin
(Department.of Oral and Maxillofacial Surgery,Stomatologi cal College,Fourth Military University,Xi'an 710032)
〔Abstracts〕Objectives:To study the role of heat shock protein 70 (H SP70) in cell proliferation after wound.Methods:The mechan ical scrape wound model of 3T3 cell was used.Cells were divided into heat pre-t reated group and non-pretreated group.Their proliferation ability at 48 h after wound was measured via MTT assay.The expression of HSP70 was detected by immuno cytochemistry.Results:HSP70 strongly expressed when cells were proliferating.After heat pretreated,cells were induced to express HSP70.The A values of heat-pretreated cells and non-pretrated were 2.15±0.14 and 1.67 ±0.28 respectively (P<0.01).Conclusion:HSP70 may play a role in cell proliferation and the enhanced cell proliferation by heat pretre atment may be due to the functions of HSP70.
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Key words 3T3 cell;Heat shock protein 70;Wound healing
热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)是细胞内一类进化上高度保守的应激蛋白，可 参与蛋白的折叠、组装、转运与蛋白复合物的降解以及DNA的复制与修复等过程〔1〕 ，而在细胞增殖时这些作用至关重要。在HSPs家族中，HSP70是最重要的一类，哺乳动物细 胞中的HSPs即以HSP70为主。本实验应用NIH3T3细胞的体外创伤模型，试图探讨HSP70在细胞 创伤后增殖中的作用，进而研究其与创伤愈合的关系。
1 材料与方法
1.1 主要材料
NIH3T3细胞及培养用品、台盼兰染液、MTT溶液(5 g/L)，由第四军医大学口腔医学院生物教 研室提供。酶联免疫检测仪(华东电子管厂)。HSP70单克隆抗体(Sigma公司)。SABC试剂盒( 博士德公司)。
, http://www.100md.com
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 用含体积分数10%胎牛血清的RPMI1640培养液常规培养NIH3T3细胞。实验 分为热处理组及非热处理组。
1.2.2 热处理 待细胞长成单层细胞后，将热处理组细胞置于42 ℃环境下孵育20 min，用 培养液冲洗两次后，再加入培养液于37 ℃环境下继续培养。非热处理组细胞作对照。
1.2.3 细胞创伤模型的建立 3T3细胞按1×104/孔密度接种于96孔培养板，37 ℃培养。 待长成单层细胞后按Stewart〔2〕方式用200 μl移液器滴头造成细胞机械性划伤模 型，用吸管吸去脱落细胞，并用新鲜培养液冲洗两次后再加入培养液继续培养。
1.2.4 细胞活性检测 热处理组单层细胞经热处理后消化成单细胞悬液，进行台盼兰排斥 试验〔3〕，计算细胞存活率，并与非热处理组比较。
, http://www.100md.com
1.2.5 细胞增殖活性检测 3T3细胞按1×104/孔的细胞密度接种于96孔培养板，待长成 单层细胞后，按上述方法进行热处理及创伤，创伤后继续培养48 h行MTT比色试验〔3〕 。
1.2.6 免疫细胞化学检测染色 3T3细胞按2×104/孔接种于24孔板，孔内置0.3 cm×0.3 cm大小盖玻片。24 h后热处理组按上述方法进行热处理，并于热处理后0、24、48 h及细胞 长成单层时取出细胞爬片，用体积分数为95%酒精固定后按SABC方法(按试剂盒说明)检测HSP 70的表达。同时，非热处理组作对照。
1.3 统计学处理
对创伤后48 h时两组细胞MTT比色值及热处理后两组细胞的存活率进行t检验。
2 结 果
, http://www.100md.com
2.1 一般观察
3T3细胞为梭形或多突起形扁平细胞，接种24 h后细胞贴壁、伸展，48 h时细胞增殖旺盛， 可见细胞分裂现象。按1×104/孔接种于96孔板，72 h后即可长成单层细胞，创伤后12 h 可观察到创缘细胞向创伤裸区内移动。创伤后48 h，热处理组创伤裸区内细胞数目较非热处 理组多，已基本覆盖创伤区(如图1，2)。
图1 热处理组(3T3细胞)创伤后48 h细胞基本已覆盖创伤裸区(10×△ 示创缘)
图2 非处理组(3T3细胞)创伤后48 h细胞数目较热处理组少(△示创缘)
2.2 细胞存活率
热处理组(95.5±0.5)%，非热处理组(93.5±1.5)%，两组间无显著性差异P>0.05。
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2.3 细胞增殖活性检测
MTT比色试验结果表明热处理组光吸收值为2.15±0.14，非热处理组1.67±0.28，两组 相比较具有显著性差异P<0.01。
2.4 免疫细胞化学染色结果
非热处理组细胞接种24 h后(相当于热处理后 0 h)，细胞贴壁、伸展，此时HSP70表达基本 为阴性；48 h时，在胞浆及胞核内均可见HSP70着色，当细胞长成单层后，HSP70表达又转为 阴性。在热处理组，热处理后即可见细胞浆内HSP70表达，此后，其表达一直持续在较高水 平。即使细胞长成单层时，HSP70的表达仍为阳性。
3 讨 论
HSPs是一类具有维持机体自身稳定功能的应激蛋白，热与多种刺激均可诱导其表达，特别是 HSP70在几乎所有生物的应激细胞中都经常高度地被诱导。NIH3T3细胞为成纤维细胞，而创 伤愈合中，修复细胞即以成纤维细胞为主，因此，用3T3细胞建立体外创伤模型能较好地模 拟创伤愈合过程。
, 百拇医药
Polla 〔4〕认为高于种属体温3～4 ℃时，短时间(通常为20 min)即可诱导HSPs的合 成。本实验用42 ℃处理3T3细胞20 min后即发现了HSP70表达。台盼兰排斥实验的结果表明 这种热刺激是非致死性的，可以用来诱导HSP70 的合成从而进行有关研究。
免疫细胞化学的研究表明，非热处理组3T3细胞在接种24 h及长成单层细胞时，HSP70的表达 很弱；而48 h时，HSP70在胞浆及胞核内均有表达，HSP70的这种表达变化可能与细胞的增殖 状态有关。如上所述，3T3细胞在接种24 h后贴壁、伸展，细胞生长不活跃；在长成单层细 胞时，细胞增殖基本停止；而在48 h时，细胞处于增殖活跃期。这说明在细胞增殖时，HSP7 0的合成增加。我们先前的研究也发现，在生长活跃的肉芽组织中HSP70呈现高表达，而在疤 痕化组织中基本不表达。
MTT比色实验表明，创伤后热处理组细胞增殖活性明显高于非热处理组。创伤的愈合有赖于 细胞的增殖及迁移，说明非致死性的热处理能促进创伤的愈合。实验中也发现在创伤裸区内 ，热处理组细胞数目明显多于非热处理组，这可能与细胞内高水平的HSP70有关。有实验发 现，静止期HeLa细胞经血清刺激进入增殖状态时，可诱导HSP70及其mRNA的表达，并且HSP70 在S期集中于核内〔5〕，表明其在某种水平上参与了细胞的增殖。近来有学者用可诱 导HSP70的药物作用于糖尿病大鼠的背部创面，结果发现创面愈合加速〔6〕，说明HS P70参与了创伤愈合过程。
, http://www.100md.com
研究发现，HSP70具有两个结构域，即ATP酶区和肽结合区〔7〕，借助ATP水解产生的 能量，HSP70可与其他蛋白相互作用，参与蛋白的合成、转运以及变性蛋白的复性等。HSP70 对细胞增殖的影响可能与其作用于增殖相关蛋白有关，如通过减少一些抑制性酶的合成或促 进抑制性蛋白与目标DNA分离等方式启动细胞增殖过程〔8〕。
尽管实验发现细胞增殖过程中有HSP70的表达，而且通过热处理诱导后细胞的增殖活性升高 并可因此促进创伤的愈合，但HSP70在细胞增殖及创伤愈合过程中的作用机制尚需近一步探 讨。
参考文献
1,Oberringer M,Baum HP,Jung V,et al.Differential expression of heat s hock protein 70 in well healing and chronic human wound tissue.Biochem Biophys R es Commun,1995,214(3):1009
, 百拇医药
2,Stewart RJ,Duley JA,Allardyce RA.The migration of fibroblasts into an in vit ro wound.Br J Exp Path,1979,60:582
3,司徒镇强,吴军正主编.细胞培养.西安:世界图书出版社西安公司,1996.181,186～187
4,Polla BS.A role for heat shock proteins in inflammation? Immuno Today,1988,9(5 ):134
5,Ferris DK,Bellan AH,Morimoto RI,et al.Mitogen and lymphokine stimulation o f heat shock proteins in T lymphocytes.Proc Natl Acad Sci USA,1988,85:3850
, 百拇医药
6,Vigh L,Literati P,Horvath I,et al.Bimoclomol:A nontoxic,hydroxylamine deri vative with stress protein-inducing activity and cytoprotective effects.Nat Med ,1997,3(10):1150
7,Feige U,Polla BS.Heat shock protins:The hsp70 family.Experientia,1994,50:979
8,Wu BJ,Morrimoto I.Transcription of the human hsp70 gene is induced by serum st imulation.Proc Natl Acad Sci USA,1985,82:6070
(收稿：1999-03-26修回：1999-06-30), 百拇医药