病理组织中人类免疫缺陷病毒1型前病毒pol基因的检测
作者：王斌 鲁晓晴
单位：266021 青岛大学医学院分子病毒学研究室
关键词：
中华传染病杂志000211 人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)可以借助于其表面膜蛋白与CD4分子及其它细胞表面分子在机体内侵染多种组织细胞[1，2]。HIV-1前病毒pol基因是编码多种与复制有关酶的基因，组织细胞中HIV-1前病毒pol基因的检测阳性可视为HIV-1病毒侵染的标志。我们运用套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)方法，对1例艾滋病患者尸检石蜡组织标本进行HIV-1前病毒pol基因的检测，现将结果报告如下。
材料与方法
一、标本采集及其组织病理观察
标本来自1例因HIV-1感染导致免疫系统衰竭死亡的患者，取患者肺、脑、脾、肾、肌肉组织经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，HE染色后进行组织学观察，未见组织病理改变。
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二、组织DNA的提取及HIV-1前病毒pol基因的Nested-PCR检测
将上述约1 g石蜡包埋组织经二甲苯脱蜡，加无水乙醇以除去二甲苯，使用0.01 mol/L PBS反复冲洗3遍以去除内含的血细胞，用玻璃研钵将组织研磨为碎块，置入1.5 ml离心管，参照文献[3]提取组织DNA。Nested-PCR引物参照HIV-1 MN株全基因序列及文献[4]进行，外侧引物为PP1：5′-TACAGGAGCAGATGATACAG-3′(正义nt 2342～2361)及PP2：5′-CCTGGCTTTAATTTTACTGG-3′(反义nt 2608～2589)。内侧引物为PP3：5′-GGAAACCAAAAATGATAGGG-3′(正义 nt 2392～2411)及PP4：5′-ATTATGTTGACAGGTGTAGG-3′(反义 nt 2521～2502)。外侧引物PCR扩增产物为一266 bp的片段，内侧引物PCR扩增产物为一121 bp的片段。外侧引物PCR的模板为5 μl组织DNA。外侧引物的PCR扩增产物5 μl作为内侧引物PCR扩增的模板，使用PE4800 DNA扩增仪，扩增条件为：94°C 2 min变性后，94°C 30 s，41°C 30 s，72°C 30 s共30个循环后，72°C 5 min结束扩增。同步设立阳性对照(pBH10,HIVBH10株全基因质粒，1 ng/μl，加样量为1 μl pBH10+4 μl水)、阴性对照(正常人组织DNA)和水对照(加样量分别为5 μl)。扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，1 μg/ml溴化乙锭染色，紫外灯下显示并记录。根据我们既往的研究结果[5]，使用上述反应体系进行外侧引物PCR可检出1 000个以上的模板DNA，而使用Nested-PCR则可检出低至10个的模板DNA。根据这两者检测模板DNA敏感性的差异，我们分别对上述来自艾滋病患者的组织DNA进行了HIV-1前病毒pol基因的外侧引物PCR及内侧引物PCR检测以推算出其原始模板DNA的数量。
, 百拇医药
结果与讨论
对来自患者的肺、脑、脾、肾、肌肉等石蜡组织DNA分别使用外侧引物PCR及Nested-PCR检测整合于细胞基因组的HIV-1前病毒pol基因检测结果见表1。
表1 病理组织DNA中HIV-1前病毒pol
基因的PCR检测结果 PCR类别
肺
脑
脾
肾
肌肉
单对引物PCR
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-
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套式引物PCR
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结果表明在未见有镜下组织病理改变的情况下，HIV-1可侵染脑、肝、肺、脾、肾及肌肉等组织器官，表明在基因水平上HIV-1对组织器官的侵染是广泛的[6，7]。我们的结果还表明，在肺、脑、脾、肝等石蜡组织提取DNA中，使用外侧单对引物PCR即可检出HIV-1前病毒pol基因DNA，表明这些组织细胞中HIV-1有较高程度的侵染。可能与这些组织细胞表面富含CD4分子有关。在肾及肌肉石蜡组织提取DNA，使用外侧单对引物PCR不能检出HIV-1前病毒pol基因DNA，而使用套式引物PCR则可检出HIV-1前病毒pol基因DNA，这表明在这些组织中HIV的整合水平较低。我们的结果表明HIV-1在不同的组织细胞内的侵染及整合水平是不均一的，这可能与细胞表面的分子分布、病毒感染细胞谱及细胞内代谢机制有关。 参考文献
, 百拇医药
1，Maddon PJ, Dalgleish AG, McDougal JS, et al. The T4 gene encodes the AIDS virus receptor and is expressed in the immune system and the brain. Cell, 1986, 47:333-348.
2，Dukes CS, Yu Y, Rivadeneira ED, et al. Cellular CD44s as a determinant of human immunodificiency virus type 1 infection and cellular tropism. J Virol, 1995, 69:4000-4005.
3，Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫，译.第2版.北京：科学出版社，1992.
, 百拇医药
4，Albert J, Fenyo EM. Simple, sensitive, and specific detection of human immuno-deficiency virus type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers. J Clin Microbiol, 1990, 28:1560-1564.
5，王斌，邵一鸣，曾毅.HIV-1 pol基因的套式PCR检测.病毒学报，1994，10：357-363.
6，Kunsch C, Hartle HT, Wigdahl B. Infection of human fetal dorsal root ganglion glial cells with human immunodeficiency virus type 1 involves an entry mechanism independent of the CD4 T4A epitope. J Virol, 1989, 63:5054-5061.
7，Harouse JM, Collman RG, Gonzalez-Scarano F. Human immunodeficiency virus type 1 infection of SK-N-MC cells: domains of gp120 involved in entry into a CD4- negative, galactosyl ceramides/3′ sulfo-galactosyl ceramide-positive cell line. J Virol, 1995, 69:7383-7390.
收稿日期：1999-04-24, http://www.100md.com
单位：266021 青岛大学医学院分子病毒学研究室
关键词：
中华传染病杂志000211 人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)可以借助于其表面膜蛋白与CD4分子及其它细胞表面分子在机体内侵染多种组织细胞[1，2]。HIV-1前病毒pol基因是编码多种与复制有关酶的基因，组织细胞中HIV-1前病毒pol基因的检测阳性可视为HIV-1病毒侵染的标志。我们运用套式-聚合酶链反应(Nested-PCR)方法，对1例艾滋病患者尸检石蜡组织标本进行HIV-1前病毒pol基因的检测，现将结果报告如下。
材料与方法
一、标本采集及其组织病理观察
标本来自1例因HIV-1感染导致免疫系统衰竭死亡的患者，取患者肺、脑、脾、肾、肌肉组织经10%福尔马林固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，HE染色后进行组织学观察，未见组织病理改变。
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二、组织DNA的提取及HIV-1前病毒pol基因的Nested-PCR检测
将上述约1 g石蜡包埋组织经二甲苯脱蜡，加无水乙醇以除去二甲苯，使用0.01 mol/L PBS反复冲洗3遍以去除内含的血细胞，用玻璃研钵将组织研磨为碎块，置入1.5 ml离心管，参照文献[3]提取组织DNA。Nested-PCR引物参照HIV-1 MN株全基因序列及文献[4]进行，外侧引物为PP1：5′-TACAGGAGCAGATGATACAG-3′(正义nt 2342～2361)及PP2：5′-CCTGGCTTTAATTTTACTGG-3′(反义nt 2608～2589)。内侧引物为PP3：5′-GGAAACCAAAAATGATAGGG-3′(正义 nt 2392～2411)及PP4：5′-ATTATGTTGACAGGTGTAGG-3′(反义 nt 2521～2502)。外侧引物PCR扩增产物为一266 bp的片段，内侧引物PCR扩增产物为一121 bp的片段。外侧引物PCR的模板为5 μl组织DNA。外侧引物的PCR扩增产物5 μl作为内侧引物PCR扩增的模板，使用PE4800 DNA扩增仪，扩增条件为：94°C 2 min变性后，94°C 30 s，41°C 30 s，72°C 30 s共30个循环后，72°C 5 min结束扩增。同步设立阳性对照(pBH10,HIVBH10株全基因质粒，1 ng/μl，加样量为1 μl pBH10+4 μl水)、阴性对照(正常人组织DNA)和水对照(加样量分别为5 μl)。扩增产物用2.5%琼脂糖凝胶电泳分离，1 μg/ml溴化乙锭染色，紫外灯下显示并记录。根据我们既往的研究结果[5]，使用上述反应体系进行外侧引物PCR可检出1 000个以上的模板DNA，而使用Nested-PCR则可检出低至10个的模板DNA。根据这两者检测模板DNA敏感性的差异，我们分别对上述来自艾滋病患者的组织DNA进行了HIV-1前病毒pol基因的外侧引物PCR及内侧引物PCR检测以推算出其原始模板DNA的数量。
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结果与讨论
对来自患者的肺、脑、脾、肾、肌肉等石蜡组织DNA分别使用外侧引物PCR及Nested-PCR检测整合于细胞基因组的HIV-1前病毒pol基因检测结果见表1。
表1 病理组织DNA中HIV-1前病毒pol
基因的PCR检测结果 PCR类别
肺
脑
脾
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肌肉
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结果表明在未见有镜下组织病理改变的情况下，HIV-1可侵染脑、肝、肺、脾、肾及肌肉等组织器官，表明在基因水平上HIV-1对组织器官的侵染是广泛的[6，7]。我们的结果还表明，在肺、脑、脾、肝等石蜡组织提取DNA中，使用外侧单对引物PCR即可检出HIV-1前病毒pol基因DNA，表明这些组织细胞中HIV-1有较高程度的侵染。可能与这些组织细胞表面富含CD4分子有关。在肾及肌肉石蜡组织提取DNA，使用外侧单对引物PCR不能检出HIV-1前病毒pol基因DNA，而使用套式引物PCR则可检出HIV-1前病毒pol基因DNA，这表明在这些组织中HIV的整合水平较低。我们的结果表明HIV-1在不同的组织细胞内的侵染及整合水平是不均一的，这可能与细胞表面的分子分布、病毒感染细胞谱及细胞内代谢机制有关。 参考文献
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1，Maddon PJ, Dalgleish AG, McDougal JS, et al. The T4 gene encodes the AIDS virus receptor and is expressed in the immune system and the brain. Cell, 1986, 47:333-348.
2，Dukes CS, Yu Y, Rivadeneira ED, et al. Cellular CD44s as a determinant of human immunodificiency virus type 1 infection and cellular tropism. J Virol, 1995, 69:4000-4005.
3，Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫，译.第2版.北京：科学出版社，1992.
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4，Albert J, Fenyo EM. Simple, sensitive, and specific detection of human immuno-deficiency virus type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers. J Clin Microbiol, 1990, 28:1560-1564.
5，王斌，邵一鸣，曾毅.HIV-1 pol基因的套式PCR检测.病毒学报，1994，10：357-363.
6，Kunsch C, Hartle HT, Wigdahl B. Infection of human fetal dorsal root ganglion glial cells with human immunodeficiency virus type 1 involves an entry mechanism independent of the CD4 T4A epitope. J Virol, 1989, 63:5054-5061.
7，Harouse JM, Collman RG, Gonzalez-Scarano F. Human immunodeficiency virus type 1 infection of SK-N-MC cells: domains of gp120 involved in entry into a CD4- negative, galactosyl ceramides/3′ sulfo-galactosyl ceramide-positive cell line. J Virol, 1995, 69:7383-7390.
收稿日期：1999-04-24, http://www.100md.com