肝癌细胞受照后代生长特性及放射敏感性变化
作者：石卫民 陈龙华
单位：广州，第一军医大学南方医院放射治疗中心 510515
关键词：HepG2细胞系；放射敏感性；p53
中华放射肿瘤学杂志000215 【摘要】 目的 探讨肝癌细胞照射后存活后代生长特性及放射敏感性的变化。 方法 人肝癌细胞株HepG2和其照射后存活后代体外培养，测定其群体倍增时间、放射敏感性和p53的表达水平。结果 HepG2的群体倍增时间为(96.0±6.8)h,克隆形成率为(13.0±1.5)%，SF2为0.41±0.05。HepG2照射后存活后代群体倍增时间为(124.8 ±12.2)h(t=3.572, P<0.05)，克隆形成率为(5.0±0.6)%(t=8.537, P<0.01)，SF2为0.65±0.08(t=3.811, P<0.05)，p53表达水平无差别(t=0.778, P>0.05)。结论 肝癌细胞照射后存活后代生长延缓，放射敏感性降低，但与p53的表达无关。
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Radiosensitivity and growth characteristics of filial generation from irradiated hepatocarcinoma cells
SHI Weimin CHEN Longhua
(Department of Radiation Oncology, Nanfang Hospital,First Military Medical University, Guangzhou 510515,China)
【Abstract】 Objective To investigate the change of radiosensitivity and growth features of the surviving progeny from the irradiated hepatocarcinoma cells. Methods To cultured human hepatocarcinoma cells—HepG2 and the progeny of irradiated HepG2, plating efficiency(PE), population doubling time(PDT),radiosensitivity index SF2 and the expression level of p53 were measured. Results The PDT of HepG2 was (96.0±6.8)hrs,PE (13.0±1.5)%，SF2 0.43±0.06.The PDT of the filial cells was (124.8 ±12.2)hrs(t=3.572, P<0.05)，PE (5.0±0.6)%(t=8.537, P<0.01)，SF2 0.65±0.08(t=3.811, P<0.05). There was no statistical difference in the expression level of p53 between HepG2 and its progeny(t=0.778, P>0.05). Conclusions In the present study,growth delay and declined radiosensitivity are confirmed in the progeny of irradiated hepatocarcinoma cells while these changes are not correlated to the p53 expression.
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【Key words】 HepG2 cell line;Radiosensitivity;p53
肝癌细胞对放射线有相当的敏感性，但肝癌放射治疗后常残留病灶。放射治疗后复发的肝癌细胞的放射敏感性目前并不清楚，本研究拟应用体外实验方法初步评价肝癌细胞照射后存活后代放射敏感性的变化，旨在为临床放射治疗提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 细胞培养：人肝癌细胞株HepG2为本院消化研究所保存。HepG2照射后存活后代为HepG2经2Gy照射后存活细胞传代15代的细胞。所有细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640(GIBCO)培养基中，37℃，5%CO2的培养箱中培养。
1.2 细胞群体倍增时间(population doubling time,PDT)：指数生长期的细胞经质量浓度为2.5g/L胰蛋白酶消化成单细胞后，1×105个细胞接种于直径6cm培养皿中，分别于培养48，72，96，120，144h时消化，计数。实验重复3次，取均数，绘制细胞指数生长曲线，计算细胞群体倍增时间。
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1.3 克隆形成实验：处于指数生长期的细胞经质量浓度为2.5g/L 胰蛋白酶消化后，按照射剂量将102～105个细胞接种于直径3cm培养皿中，分别给予0～10Gy单剂量照射，培养12～14 d后终止培养，甲醇固定，Giemsa染色，镜下计数超过50个细胞的克隆，计算细胞存活分数(SF)。每个剂量点设3个平行样品，实验重复3次，取均数。以线性二次方程S=e-(αD+βD2)及多靶单击模型S=1-(1-
e-KD )N拟合细胞存活曲线，计算细胞敏感性参数α，SF2，D0，N。
1.4 流式细胞仪检测细胞p53蛋白表达水平：细胞p53蛋白的流式细胞仪检测按Ribeiro的方法[1]。即：细胞生长至60%汇聚时用胰蛋白酶或EDTA消化，PBS漂洗后重悬于1mL预冷的PBS中，用体积份数为0.70甲醇固定。每份样品5×105个细胞与1μg/mL一抗(鼠抗人p53蛋白，国产)在冰上共同孵育1h,PBS漂洗2次，与FITC标记的二抗(羊抗鼠IgG，国产)于冰上共同孵育30min, 最后PBS漂洗2次，流式细胞仪(Epics Elite，Couter Corporation,USA)检测荧光强度，分析细胞抗原表达强度。
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1.5 统计方法：用SPSS 8.0统计软件，细胞指数生长及细胞存活曲线用平方回归拟合，各组细胞参数用均数±标准差
±s，两组间比较用t检验。
2 结果
2.1 照射后存活后代的克隆形成率降低：HepG2的克隆形成率为(13.0±1.5)%，照射后存活后代的克隆形成率为(5.0±0.6)%，t=8.537, P<0.01。
2.2 照射后存活后代的细胞群体倍增时间延长：细胞生长曲线见图1。HepG2的PDT为(96.0 ±6.8)h,照射后存活后代PDT为(124.8 ±12.2)h，t=3.572, P<0.05。
, 百拇医药 图1 HepG2及受照后代细胞生长曲线
2.3 照射后存活后代的放射敏感性降低：细胞存活曲线见图2。HepG2的α为0.37Gy-1，D0为0.42 Gy，N为2.45， SF2为0.41±0.05。 照射后存活后代的α为0.08Gy-1，D0为0.58 Gy，N为1.04，SF2为0.66±0.08，t=3.811, P<0.05。
2.4 照射后存活后代p53蛋白表达水平无变化：p53蛋白的流式细胞仪检测结果见图3。HepG2的p53阳性率为(37±11)%，照射后存活后代的p53阳性率为(45±14)%，t=0.778,P>0.05。
图2 HepG2及照后代细胞存活曲线
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图3 HepG2及受照后代细胞p53蛋白表达的流式细胞仪检测结果
3 讨论
目前已有大量研究表明，放射可以诱发细胞基因组的不稳定性，其表现形式多样，并且可以随细胞分裂而传递下去，在其存活后代中出现延迟表达。但细胞基因组的不稳定性是否会导致其存活后代的放射敏感性的变化呢？Crompton等[2]用6Gy的X射线照射C3H鼠纤维母细胞，分析其存活后代的DNA含量和放射敏感性，发现其存活后代的DNA出现较多的非整倍体，但其放射敏感性却没有变化。而Pelevina等[3]用HeLa和中国仓鼠细胞为研究对象，发现细胞照射后存活后代放射敏感性增高。然而更多的学者认为细胞受射线或其他的DNA 损伤剂作用后，其后代会产生抗性，即“adaptive response”[4，5]。不同的实验得到的结论不同，可能是由于各实验用的射线剂量和放射敏感性的评价方法有所差异，也可能不同的细胞对射线的反应就存在如此的差异。本研究发现，HepG2细胞经2Gy照射后其后代生长特性改变，克隆形成率降低，生长延缓，并且放射敏感性降低。照射后存活细胞后代放射敏感性降低的机制尚不清楚，目前存在两种假设：一种认为同一细胞群存在着放射敏感性不同的亚群，照射选择性地杀灭了敏感亚群，存活的后代是放射抗拒的亚群，因此放射敏感性降低；另一种认为细胞群受照射后存活后代细胞的亚结构(substructure)发生了变化，即射线诱导细胞产生了针对DNA损伤的更强的修复能力，因此面对再次射线作用时表现为抗性增加，敏感性下降[6]。本研究难以讨论后一种假设，但实验结果显然支持和补充了“亚群说”。受照射的肝癌细胞后代克隆源性细胞减少，因而克隆形成率降低，倍增时间延长，指数生长期的细胞进入放射敏感的G2期的比例降低，因此放射敏感性下降。p53作为细胞周期调控的一个重要元件，已知它的表达与细胞的放射敏感性密切相关。Chang等[7]研究表明细胞受照射后代p53的表达无变化，本研究结果与其相似。由于HepG2细胞具有野生型p53[8]，其受照射后存活的后代尽管放射敏感性下降，但p53的表达水平与HepG2相同，说明照射后存活后代放射敏感性的变化与p53表达无关。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，Ribeiro JCC, Barnetson AR, Fisher RJ,et al.Relationship between radiation response and p53 status in human bladder cancer cells.Int J Radiat Biol，1997,72:11-20.
2，Crompton NE， Emery GC， Shi Y，et al. Radiation-induced genetic instability: no association with changes in radiosensitivity or cell cycle checkpoints in C3H 10T1/2 mouse fibroblasts. Radiat Environ Biophys, 1998,36: 255-259.
, http://www.100md.com 3，Pelevina II, Gotlib Via, Kudriashova OV,et al. Properties of progeny of irradiated cells.Tsitologiia, 1998, 40: 467-477.
4，Joiner MC, Lambin P, Malaise EP,et al. Hypersensitivity to very-low single radiation doses: its relationship to the adaptive response and induced radioresistance. Mutat Res, 1996 ,358: 171-183.
5，Venkat S, Chaubey RC, Chauhan PS. Radio-adaptive response in human lymphocytes in vitro. Indian J Exp Biol, 1996, 34: 909-912.
, 百拇医药
6，Wouters BG, Skarsgard LD. Low-dose radiation sensitivity and induced radioresistance to cell killing in HT-29 cells is distinct from the "adaptive response" and can not be explained by a subpopulation of sensitive cells. Radiat Res, 1997 ,148: 435-442.
7，Chang L, Woloschak GE. Effect of passage number on cellular response to DNA-damaging agents: cell survival and gene expression. Cancer Lett, 1997 ,113: 77-86.
8，赵新泰，万大方，蒋惠秋, 等.11株肝癌细胞系染色体17P13.3和p53基因状况的研究.肿瘤,1998，18：251-254.
(收稿日期：1999-08-13)
, http://www.100md.com
单位：广州，第一军医大学南方医院放射治疗中心 510515
关键词：HepG2细胞系；放射敏感性；p53
中华放射肿瘤学杂志000215 【摘要】 目的 探讨肝癌细胞照射后存活后代生长特性及放射敏感性的变化。 方法 人肝癌细胞株HepG2和其照射后存活后代体外培养，测定其群体倍增时间、放射敏感性和p53的表达水平。结果 HepG2的群体倍增时间为(96.0±6.8)h,克隆形成率为(13.0±1.5)%，SF2为0.41±0.05。HepG2照射后存活后代群体倍增时间为(124.8 ±12.2)h(t=3.572, P<0.05)，克隆形成率为(5.0±0.6)%(t=8.537, P<0.01)，SF2为0.65±0.08(t=3.811, P<0.05)，p53表达水平无差别(t=0.778, P>0.05)。结论 肝癌细胞照射后存活后代生长延缓，放射敏感性降低，但与p53的表达无关。
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Radiosensitivity and growth characteristics of filial generation from irradiated hepatocarcinoma cells
SHI Weimin CHEN Longhua
(Department of Radiation Oncology, Nanfang Hospital,First Military Medical University, Guangzhou 510515,China)
【Abstract】 Objective To investigate the change of radiosensitivity and growth features of the surviving progeny from the irradiated hepatocarcinoma cells. Methods To cultured human hepatocarcinoma cells—HepG2 and the progeny of irradiated HepG2, plating efficiency(PE), population doubling time(PDT),radiosensitivity index SF2 and the expression level of p53 were measured. Results The PDT of HepG2 was (96.0±6.8)hrs,PE (13.0±1.5)%，SF2 0.43±0.06.The PDT of the filial cells was (124.8 ±12.2)hrs(t=3.572, P<0.05)，PE (5.0±0.6)%(t=8.537, P<0.01)，SF2 0.65±0.08(t=3.811, P<0.05). There was no statistical difference in the expression level of p53 between HepG2 and its progeny(t=0.778, P>0.05). Conclusions In the present study,growth delay and declined radiosensitivity are confirmed in the progeny of irradiated hepatocarcinoma cells while these changes are not correlated to the p53 expression.
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【Key words】 HepG2 cell line;Radiosensitivity;p53
肝癌细胞对放射线有相当的敏感性，但肝癌放射治疗后常残留病灶。放射治疗后复发的肝癌细胞的放射敏感性目前并不清楚，本研究拟应用体外实验方法初步评价肝癌细胞照射后存活后代放射敏感性的变化，旨在为临床放射治疗提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 细胞培养：人肝癌细胞株HepG2为本院消化研究所保存。HepG2照射后存活后代为HepG2经2Gy照射后存活细胞传代15代的细胞。所有细胞在含10%小牛血清的RPMI 1640(GIBCO)培养基中，37℃，5%CO2的培养箱中培养。
1.2 细胞群体倍增时间(population doubling time,PDT)：指数生长期的细胞经质量浓度为2.5g/L胰蛋白酶消化成单细胞后，1×105个细胞接种于直径6cm培养皿中，分别于培养48，72，96，120，144h时消化，计数。实验重复3次，取均数，绘制细胞指数生长曲线，计算细胞群体倍增时间。
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1.3 克隆形成实验：处于指数生长期的细胞经质量浓度为2.5g/L 胰蛋白酶消化后，按照射剂量将102～105个细胞接种于直径3cm培养皿中，分别给予0～10Gy单剂量照射，培养12～14 d后终止培养，甲醇固定，Giemsa染色，镜下计数超过50个细胞的克隆，计算细胞存活分数(SF)。每个剂量点设3个平行样品，实验重复3次，取均数。以线性二次方程S=e-(αD+βD2)及多靶单击模型S=1-(1-
e-KD )N拟合细胞存活曲线，计算细胞敏感性参数α，SF2，D0，N。
1.4 流式细胞仪检测细胞p53蛋白表达水平：细胞p53蛋白的流式细胞仪检测按Ribeiro的方法[1]。即：细胞生长至60%汇聚时用胰蛋白酶或EDTA消化，PBS漂洗后重悬于1mL预冷的PBS中，用体积份数为0.70甲醇固定。每份样品5×105个细胞与1μg/mL一抗(鼠抗人p53蛋白，国产)在冰上共同孵育1h,PBS漂洗2次，与FITC标记的二抗(羊抗鼠IgG，国产)于冰上共同孵育30min, 最后PBS漂洗2次，流式细胞仪(Epics Elite，Couter Corporation,USA)检测荧光强度，分析细胞抗原表达强度。
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1.5 统计方法：用SPSS 8.0统计软件，细胞指数生长及细胞存活曲线用平方回归拟合，各组细胞参数用均数±标准差
±s，两组间比较用t检验。2 结果
2.1 照射后存活后代的克隆形成率降低：HepG2的克隆形成率为(13.0±1.5)%，照射后存活后代的克隆形成率为(5.0±0.6)%，t=8.537, P<0.01。
2.2 照射后存活后代的细胞群体倍增时间延长：细胞生长曲线见图1。HepG2的PDT为(96.0 ±6.8)h,照射后存活后代PDT为(124.8 ±12.2)h，t=3.572, P<0.05。
, 百拇医药 图1 HepG2及受照后代细胞生长曲线
2.3 照射后存活后代的放射敏感性降低：细胞存活曲线见图2。HepG2的α为0.37Gy-1，D0为0.42 Gy，N为2.45， SF2为0.41±0.05。 照射后存活后代的α为0.08Gy-1，D0为0.58 Gy，N为1.04，SF2为0.66±0.08，t=3.811, P<0.05。
2.4 照射后存活后代p53蛋白表达水平无变化：p53蛋白的流式细胞仪检测结果见图3。HepG2的p53阳性率为(37±11)%，照射后存活后代的p53阳性率为(45±14)%，t=0.778,P>0.05。
图2 HepG2及照后代细胞存活曲线
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图3 HepG2及受照后代细胞p53蛋白表达的流式细胞仪检测结果
3 讨论
目前已有大量研究表明，放射可以诱发细胞基因组的不稳定性，其表现形式多样，并且可以随细胞分裂而传递下去，在其存活后代中出现延迟表达。但细胞基因组的不稳定性是否会导致其存活后代的放射敏感性的变化呢？Crompton等[2]用6Gy的X射线照射C3H鼠纤维母细胞，分析其存活后代的DNA含量和放射敏感性，发现其存活后代的DNA出现较多的非整倍体，但其放射敏感性却没有变化。而Pelevina等[3]用HeLa和中国仓鼠细胞为研究对象，发现细胞照射后存活后代放射敏感性增高。然而更多的学者认为细胞受射线或其他的DNA 损伤剂作用后，其后代会产生抗性，即“adaptive response”[4，5]。不同的实验得到的结论不同，可能是由于各实验用的射线剂量和放射敏感性的评价方法有所差异，也可能不同的细胞对射线的反应就存在如此的差异。本研究发现，HepG2细胞经2Gy照射后其后代生长特性改变，克隆形成率降低，生长延缓，并且放射敏感性降低。照射后存活细胞后代放射敏感性降低的机制尚不清楚，目前存在两种假设：一种认为同一细胞群存在着放射敏感性不同的亚群，照射选择性地杀灭了敏感亚群，存活的后代是放射抗拒的亚群，因此放射敏感性降低；另一种认为细胞群受照射后存活后代细胞的亚结构(substructure)发生了变化，即射线诱导细胞产生了针对DNA损伤的更强的修复能力，因此面对再次射线作用时表现为抗性增加，敏感性下降[6]。本研究难以讨论后一种假设，但实验结果显然支持和补充了“亚群说”。受照射的肝癌细胞后代克隆源性细胞减少，因而克隆形成率降低，倍增时间延长，指数生长期的细胞进入放射敏感的G2期的比例降低，因此放射敏感性下降。p53作为细胞周期调控的一个重要元件，已知它的表达与细胞的放射敏感性密切相关。Chang等[7]研究表明细胞受照射后代p53的表达无变化，本研究结果与其相似。由于HepG2细胞具有野生型p53[8]，其受照射后存活的后代尽管放射敏感性下降，但p53的表达水平与HepG2相同，说明照射后存活后代放射敏感性的变化与p53表达无关。
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参 考 文 献
1，Ribeiro JCC, Barnetson AR, Fisher RJ,et al.Relationship between radiation response and p53 status in human bladder cancer cells.Int J Radiat Biol，1997,72:11-20.
2，Crompton NE， Emery GC， Shi Y，et al. Radiation-induced genetic instability: no association with changes in radiosensitivity or cell cycle checkpoints in C3H 10T1/2 mouse fibroblasts. Radiat Environ Biophys, 1998,36: 255-259.
, http://www.100md.com 3，Pelevina II, Gotlib Via, Kudriashova OV,et al. Properties of progeny of irradiated cells.Tsitologiia, 1998, 40: 467-477.
4，Joiner MC, Lambin P, Malaise EP,et al. Hypersensitivity to very-low single radiation doses: its relationship to the adaptive response and induced radioresistance. Mutat Res, 1996 ,358: 171-183.
5，Venkat S, Chaubey RC, Chauhan PS. Radio-adaptive response in human lymphocytes in vitro. Indian J Exp Biol, 1996, 34: 909-912.
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6，Wouters BG, Skarsgard LD. Low-dose radiation sensitivity and induced radioresistance to cell killing in HT-29 cells is distinct from the "adaptive response" and can not be explained by a subpopulation of sensitive cells. Radiat Res, 1997 ,148: 435-442.
7，Chang L, Woloschak GE. Effect of passage number on cellular response to DNA-damaging agents: cell survival and gene expression. Cancer Lett, 1997 ,113: 77-86.
8，赵新泰，万大方，蒋惠秋, 等.11株肝癌细胞系染色体17P13.3和p53基因状况的研究.肿瘤,1998，18：251-254.
(收稿日期：1999-08-13)
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