牙龈卟啉单胞菌在龈下菌斑中的分布
作者：吴波 章锦才 黄萍 张蕴惠
单位：成都华西医科大学口腔医学院 610041
关键词：牙周炎；牙龈卟啉单胞菌；16；SrRNA；聚合酶链反应
实用口腔医学杂志000201 〔摘要〕 目的：研究牙龈卟啉单胞菌在牙周炎患者病变部位和健康部位龈下 菌班中的分布情况。方法：选择64例成年牙周炎患者，取龈 下菌斑，经厌氧培养，挑取产黑色素菌落，经多聚酶链反应鉴定牙龈卟啉单胞菌。结果：产黑色素G厌氧杆菌和牙龈卟啉单胞菌的患者检出率分别是67.2% 和60.9%。牙龈卟啉单胞菌在病变部位和健康部位的检出率分别是35.9%和28.1%，二者差异 无统计学意义；牙龈卟啉单胞菌在病变部位和健康部位的检出株数分别是122株和85株，占 产黑色素G厌氧杆菌检出株数的32.3%和35.9%，差异无统计学意义。结论： 牙龈卟啉单胞菌可能作为内源性致病菌在特定条件下过度生长而导致牙周破坏 。
, http://www.100md.com
中图分类号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)02-0087-03
Distribution of porphyromonas gingivalis in subgingival plaques of patients with adult periodontitis
Wu Bo,Zhang Jincai,Huang Ping
(College of Stomatology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
〔Abstract〕Objective:To determine the distribution of porphyromona s gingivalis (Pg) subgingivally in diseased and healthy sites of adult periodo ntitis (AP) patients.Methods:Samples of subgingival plaque were collected from 64 AP patients and cultivated under anaerobic conditions fo r isolation of black-pigmented colonies from which Pg strains were identifi ed with polymerase chain reaction assay.Results:The positi ve rates of black-pigmented anaerobic strains and Pg among the patients wer e 67.2% and 60.9% respectively.Pg was found to be positive in 35.9% of the d iseased sites and 28.1% of the healthy sites (P>0.05).122 and 85 strains of Pg were isolated from diseased and healthy sites,which constituted 32.3% and 35.9% of the total isolated black-pigmented anaerobic strains respectively.Conclusion:Pg is possibly a commensal strain in human ora l cavity and may overgrow under pathological conditions to cause periodontal inf ection as an opportunistic pathogen.
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Key words Periodontitis; Porphyromonas gingivalis; 16S rRNA; Pol ymerase chain reaction
牙周炎是细菌导致的感染性疾病。牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis,Pg )是成年牙周炎(AP)的主要致病菌之一。但Pg是内源性致病菌还是外源性致病菌尚有争 议。外源性致病菌在人群中检出率低，克隆型少，健康人群或部位病原菌水平低或无，预防 和治疗措施为清除该菌。而内源性致病菌则在人群中检出率高，存在多种克隆型，因过度生 长而致病，预防措施是抑制过度生长。如能明确Pg是哪一类致病菌，即可采取相应的治 疗措施〔1〕。本文根据已报道的针对Pg 16S rRNA设计的引物〔2〕，采 用多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测AP病变部位及健康部位的Pg检 出率和数量，对其外源性或内源性致病菌的地位作初步探讨。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 本研究采用的标准株包括Pg ATCC33277、W83，中间型普里沃菌(Pi) ATCC 25611，变黑普里沃菌(Pn)ATCC37665，产黑色素普里沃菌(Pm)ATCC25845，不 解糖卟啉单胞菌(Pa)ATCC25260，躯体普里沃菌(Pc)ATCC33547，小齿普里沃菌(P d)ATCC33185由卫生部口腔生物医学工程重点实验室提供。临床分离614株产黑色素G 厌氧杆菌菌株。
1.1.2 引物合成 根据Garcia等报道的16S rRNA引物序列，由美国GIBCO BRL公司合成引物 1(P1)和引物2(P2)，P1-5'CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG3'和P2-5'TACATAGAAG CCCCGAAGGAAGACG3'扩增片段为527 bp。
, 百拇医药
1.1.3 试剂 本研究采用的主要酶和试剂包括Taq DNA聚合酶、10×Buffer缓冲液、dNTP、 PBR322/Hae Ⅲ等由美国GIBCO BRL公司提供。
1.2 方法
1.2.1 病例选择 64例AP患者，年龄21～72岁，全身无系统性疾病，3月内无抗生素治疗史 。每位患者至少有两个牙周袋深≥4 mm，探诊明显出血。每位患者选择两个牙周正常(牙龈 沟深≤2 mm，探诊无出血，牙龈无明显炎症)的牙位作为健康部位。
1.2.2 标本的采集及厌氧培养 每个取样部位插入两根无菌纸尖至袋底或龈沟底，停留15 s，放入装有1 ml预还原转送液的离心管。振荡，稀释，接种于牛心脑浸液平皿，37 ℃，在厌氧环境(含CO2、H2、N2的体积分数分别为10%、10%、80%)培养5～7 d。挑 取黑色菌落，镜检为G杆菌者，取单个菌落，放入装有无菌蒸馏水的离心管内。
, 百拇医药
1.2.3 PCR反应 以Pg ATCC33277的DNA为模板作阳性对照，以加除Pg ATCC33277 DNA外的PCR系统所有其他成份及加Pg ATCC33277 DNA模板不加引物为阴性对照，分别以 8种标准株细菌DNA和614株临床标本DNA为模板进行PCR检测。将混悬有单个菌落的离心管煮沸5 min，离心1164 g×5 min，取上清液作为模板DNA备用。PCR扩增总反应体 系50 μl，其中三蒸水30 μl,10×Buffer缓冲液5 μl，2.5 mmol/L Mg2+5 μl，d NTP(含4种脱氧核苷酸1.25 mmol/L)4 μl,Taq DNA聚合酶2.5 U,引物(P1P2)50 μmol/L各0 .5 μl,模板DNA5 μl。在0.5 ml的离心管中，依次加入以上试剂，混匀，加入20 μl石蜡 油，进行PCR反应。PCR反应程序：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火70 ℃ 45 s ，延伸72 ℃ 30 s，38次循环，延伸72 ℃ 10 min。
, 百拇医药
1.2.4 PCR扩增产物的检测 取扩增产物10 μl，加样于质量浓度为2%的琼脂糖(含0.5 mg/ L溴化乙锭)凝胶，以PBR322/Hae Ⅲ为分子量大小参照物电泳，电泳结果在紫外光下观察照 相。
2 结 果
2.1 引物特异性的检测
该引物只与Pg ATCC33277、W83反应，产527bp的特异片段，而不与Pi ATCC25611、 ATCC28261，Pn ATCC37665,Pm ATCC25845,Pa ATCC25260,Pc ATCC335 74,Pd ATCC33185反应。证明该引物特异性强，可用于Pg临床株的检测。
2.2 产黑色素G厌氧杆菌和Pg的个体检出率
见表1。
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表1 产黑色素G-类杆菌和Pg的个体检出率
受试例数
检出例数
检出率(%)
产黑色素G-厌氧杆菌
64
43
67.2
Pg
64
39
60.9
, 百拇医药
2.3 Pg在病变部位和健康部位的检出率
见表2，经卡方检验，病变部位与健康部位的检出率差异无统计学意义(P>0.0 5)。表2 Pg在病变部位和健康部位的检出率 部位
受检部位
检出阳性部位
检出率(%)
病变
128
46
35.9
健康
128
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36
28.1
2.4 在病变部位和健康部位分离的Pg菌株数及其占所分离的产黑色素G厌氧杆菌菌 株数的比率
见表3，经卡方检验，病变部位与健康部位的Pg分离株占所分离的产黑色素G厌氧杆 菌总株数的比率在病变部位与健康部位间差异无统计学意义(P>0.05)。表3 病变部位和健康部位Pg分离株数及占产黑色G厌氧杆菌分离株数的比率
病变部位
健康部位
总计
Pg
122
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85
207
产黑色素G-类杆菌
377
237
614
Pg/产黑色素G
32.3
35.9
33.7
厌氧杆菌 %
3 讨 论
, 百拇医药
3.1 在牙周病的细菌检测中，已有多种方法可供选择。传统方法如培养法、酶法、免疫法 ，分子生物学方法如PCR法、DNA探针法、限制性内切酶法等，均各有优缺点。PCR法简便快 捷，敏感性高，可检测10～100个细菌〔3〕。本实验采用细菌培养法加PCR法以兼顾 细菌保种和敏感性。引物的选择是决定PCR灵敏度与准确度的一个关键因素。16S rRNA在细 菌的系统发育中堪称“进化计时器”，既含保守序列，又含可变序列。针对种间的可变序列 设计引物，可用于细菌的种类鉴定。本实验的一对引物即根据此原理设计，实验证实该引物 只与Pg33277、W83反应，扩增出527 bp的片段，而与其他异种细菌如Pi，Pn， Pm，Pa，Pc，Pd等均无交叉反应。所以该引物具有高度特异性，可用于 Pg的鉴定。
3.2 本实验AP龈下菌斑Pg的个体阳性率为60.9%。Slots〔4〕报道龈下菌斑 Pg阳性率细菌培养法为34.5%，直接PCR法为63.4%。Haffajee〔5〕对90例牙周炎 患者的2299个位点用NDA探针检测出Pg的阳性率为91%。Soder〔6〕对20名重度牙 周炎的198个病变位点用DNA探针了解牙周病原菌的检出率，Pg为95%。本实验的结果高 于通常的细菌培养法，原因在于细菌培养之后采用灵敏度高的PCR法而不是生化表型鉴定法 。但与DNA探针法相比，本实验的检出率偏低，原因可能有：本实验中每一个体分别选取2个 病变位点和健康位点，位点数少于Haffajee和Soder等；本实验在病例的选择上包括中至重 度牙周炎而Soder则选择重度牙周炎；本实验结合培养法和PCR法，所以敏感性可能低于DNA 探针；Pg在不同种族和不地区也许存在分布上的差异。因为牙周感染是多种细菌的混合 感染，而不同地区不同人种对不同的细菌的易感性存在差异。
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3.3 本研究结果表明：Pg在AP患者的健康部位的检出率也非常高(28.1%)，稍低于病变 部位的检出率(35.9%)，但这种差异无统计学意义。有理由认为这种差异是由于Pg在健 康部位存在的量少于病变部位，采样不易采到所致。Pg作为最主要的致病菌已被大量的 研究所证实，但Pg是外源性致病菌还是内源性致病菌尚有争议。我们的研究结果支持 Pg是内源性致病菌，因为Pg不仅在牙周病变部位，在牙周健康部位也较广泛地存在， 但不能排除病变部位的Pg与健康部位的Pg有不同的基因型，存在毒力的差异。在感 染微生物学领域，这是一个普遍的现象，即致病菌存在多种基因型，不同基因型间存在毒力 的差异。只有少数有毒力的基因型才可能致病。那么，Pg是否存在特异致病的毒力基因 型，还需作进一步的研究。
本课题由国家自然科学基金资助，编号为 39300146
参考文献
1，Greenstein G,Lamster I.Bacterial transmission in periodontal diseases:A critical review.J Periodontol,1997,68:421
, http://www.100md.com
2，Garcia L,Tercero JC,Legido B,et al.Rapid detection of Actinobacillus actin omycetemcomitans,Prevotella intermedia and Porphyromona gingivalis by multiplex PCR.J Periodontal Res,1998,33(1):59
3，Watanabe K,Frommel TO.Porphyromonas gingivalis,Actinobacillus actinomycetemcom itans and Treponema denticola detection in oral plaque samples using the polymer ase chain reaction.J Clin Periodontol,1996,23:212
4，Slots J,Ashimoto A,Flynn J,et al.Detection of putative periodontal pathog ens in subgingival specimens by 16S ribosomal DNA amplification with the polymer ase chain reaction.Clin Infect Dis,1995,20(Suppl 2):S304
, 百拇医药
5，Haffajee AD,Socransky SS,Smith C,et al.The use of DNA probes to examine th e distribution of subgingival species in subiects with different levels of perio dontal destruction.J Clin Periodontol,1992,19:84
6，Soder PO,Jin LJ,Soder B.DNA probe detection of periodontopathogens in advanced periodontitis. Scand J Dent Res,1993,101:363
(收稿：1999-09-05 修回：1999-12-30), 百拇医药
单位：成都华西医科大学口腔医学院 610041
关键词：牙周炎；牙龈卟啉单胞菌；16；SrRNA；聚合酶链反应
实用口腔医学杂志000201 〔摘要〕 目的：研究牙龈卟啉单胞菌在牙周炎患者病变部位和健康部位龈下 菌班中的分布情况。方法：选择64例成年牙周炎患者，取龈 下菌斑，经厌氧培养，挑取产黑色素菌落，经多聚酶链反应鉴定牙龈卟啉单胞菌。结果：产黑色素G厌氧杆菌和牙龈卟啉单胞菌的患者检出率分别是67.2% 和60.9%。牙龈卟啉单胞菌在病变部位和健康部位的检出率分别是35.9%和28.1%，二者差异 无统计学意义；牙龈卟啉单胞菌在病变部位和健康部位的检出株数分别是122株和85株，占 产黑色素G厌氧杆菌检出株数的32.3%和35.9%，差异无统计学意义。结论： 牙龈卟啉单胞菌可能作为内源性致病菌在特定条件下过度生长而导致牙周破坏 。
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中图分类号：R780.2 文献标识码：A 文章编号：1001-3733(2000)02-0087-03
Distribution of porphyromonas gingivalis in subgingival plaques of patients with adult periodontitis
Wu Bo,Zhang Jincai,Huang Ping
(College of Stomatology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
〔Abstract〕Objective:To determine the distribution of porphyromona s gingivalis (Pg) subgingivally in diseased and healthy sites of adult periodo ntitis (AP) patients.Methods:Samples of subgingival plaque were collected from 64 AP patients and cultivated under anaerobic conditions fo r isolation of black-pigmented colonies from which Pg strains were identifi ed with polymerase chain reaction assay.Results:The positi ve rates of black-pigmented anaerobic strains and Pg among the patients wer e 67.2% and 60.9% respectively.Pg was found to be positive in 35.9% of the d iseased sites and 28.1% of the healthy sites (P>0.05).122 and 85 strains of Pg were isolated from diseased and healthy sites,which constituted 32.3% and 35.9% of the total isolated black-pigmented anaerobic strains respectively.Conclusion:Pg is possibly a commensal strain in human ora l cavity and may overgrow under pathological conditions to cause periodontal inf ection as an opportunistic pathogen.
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Key words Periodontitis; Porphyromonas gingivalis; 16S rRNA; Pol ymerase chain reaction
牙周炎是细菌导致的感染性疾病。牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis,Pg )是成年牙周炎(AP)的主要致病菌之一。但Pg是内源性致病菌还是外源性致病菌尚有争 议。外源性致病菌在人群中检出率低，克隆型少，健康人群或部位病原菌水平低或无，预防 和治疗措施为清除该菌。而内源性致病菌则在人群中检出率高，存在多种克隆型，因过度生 长而致病，预防措施是抑制过度生长。如能明确Pg是哪一类致病菌，即可采取相应的治 疗措施〔1〕。本文根据已报道的针对Pg 16S rRNA设计的引物〔2〕，采 用多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测AP病变部位及健康部位的Pg检 出率和数量，对其外源性或内源性致病菌的地位作初步探讨。
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 本研究采用的标准株包括Pg ATCC33277、W83，中间型普里沃菌(Pi) ATCC 25611，变黑普里沃菌(Pn)ATCC37665，产黑色素普里沃菌(Pm)ATCC25845，不 解糖卟啉单胞菌(Pa)ATCC25260，躯体普里沃菌(Pc)ATCC33547，小齿普里沃菌(P d)ATCC33185由卫生部口腔生物医学工程重点实验室提供。临床分离614株产黑色素G 厌氧杆菌菌株。
1.1.2 引物合成 根据Garcia等报道的16S rRNA引物序列，由美国GIBCO BRL公司合成引物 1(P1)和引物2(P2)，P1-5'CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG3'和P2-5'TACATAGAAG CCCCGAAGGAAGACG3'扩增片段为527 bp。
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1.1.3 试剂 本研究采用的主要酶和试剂包括Taq DNA聚合酶、10×Buffer缓冲液、dNTP、 PBR322/Hae Ⅲ等由美国GIBCO BRL公司提供。
1.2 方法
1.2.1 病例选择 64例AP患者，年龄21～72岁，全身无系统性疾病，3月内无抗生素治疗史 。每位患者至少有两个牙周袋深≥4 mm，探诊明显出血。每位患者选择两个牙周正常(牙龈 沟深≤2 mm，探诊无出血，牙龈无明显炎症)的牙位作为健康部位。
1.2.2 标本的采集及厌氧培养 每个取样部位插入两根无菌纸尖至袋底或龈沟底，停留15 s，放入装有1 ml预还原转送液的离心管。振荡，稀释，接种于牛心脑浸液平皿，37 ℃，在厌氧环境(含CO2、H2、N2的体积分数分别为10%、10%、80%)培养5～7 d。挑 取黑色菌落，镜检为G杆菌者，取单个菌落，放入装有无菌蒸馏水的离心管内。
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1.2.3 PCR反应 以Pg ATCC33277的DNA为模板作阳性对照，以加除Pg ATCC33277 DNA外的PCR系统所有其他成份及加Pg ATCC33277 DNA模板不加引物为阴性对照，分别以 8种标准株细菌DNA和614株临床标本DNA为模板进行PCR检测。将混悬有单个菌落的离心管煮沸5 min，离心1164 g×5 min，取上清液作为模板DNA备用。PCR扩增总反应体 系50 μl，其中三蒸水30 μl,10×Buffer缓冲液5 μl，2.5 mmol/L Mg2+5 μl，d NTP(含4种脱氧核苷酸1.25 mmol/L)4 μl,Taq DNA聚合酶2.5 U,引物(P1P2)50 μmol/L各0 .5 μl,模板DNA5 μl。在0.5 ml的离心管中，依次加入以上试剂，混匀，加入20 μl石蜡 油，进行PCR反应。PCR反应程序：预变性94 ℃ 5 min，变性94 ℃ 30 s，退火70 ℃ 45 s ，延伸72 ℃ 30 s，38次循环，延伸72 ℃ 10 min。
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1.2.4 PCR扩增产物的检测 取扩增产物10 μl，加样于质量浓度为2%的琼脂糖(含0.5 mg/ L溴化乙锭)凝胶，以PBR322/Hae Ⅲ为分子量大小参照物电泳，电泳结果在紫外光下观察照 相。
2 结 果
2.1 引物特异性的检测
该引物只与Pg ATCC33277、W83反应，产527bp的特异片段，而不与Pi ATCC25611、 ATCC28261，Pn ATCC37665,Pm ATCC25845,Pa ATCC25260,Pc ATCC335 74,Pd ATCC33185反应。证明该引物特异性强，可用于Pg临床株的检测。
2.2 产黑色素G厌氧杆菌和Pg的个体检出率
见表1。
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表1 产黑色素G-类杆菌和Pg的个体检出率
受试例数
检出例数
检出率(%)
产黑色素G-厌氧杆菌
64
43
67.2
Pg
64
39
60.9
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2.3 Pg在病变部位和健康部位的检出率
见表2，经卡方检验，病变部位与健康部位的检出率差异无统计学意义(P>0.0 5)。表2 Pg在病变部位和健康部位的检出率 部位
受检部位
检出阳性部位
检出率(%)
病变
128
46
35.9
健康
128
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36
28.1
2.4 在病变部位和健康部位分离的Pg菌株数及其占所分离的产黑色素G厌氧杆菌菌 株数的比率
见表3，经卡方检验，病变部位与健康部位的Pg分离株占所分离的产黑色素G厌氧杆 菌总株数的比率在病变部位与健康部位间差异无统计学意义(P>0.05)。表3 病变部位和健康部位Pg分离株数及占产黑色G厌氧杆菌分离株数的比率
病变部位
健康部位
总计
Pg
122
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85
207
产黑色素G-类杆菌
377
237
614
Pg/产黑色素G
32.3
35.9
33.7
厌氧杆菌 %
3 讨 论
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3.1 在牙周病的细菌检测中，已有多种方法可供选择。传统方法如培养法、酶法、免疫法 ，分子生物学方法如PCR法、DNA探针法、限制性内切酶法等，均各有优缺点。PCR法简便快 捷，敏感性高，可检测10～100个细菌〔3〕。本实验采用细菌培养法加PCR法以兼顾 细菌保种和敏感性。引物的选择是决定PCR灵敏度与准确度的一个关键因素。16S rRNA在细 菌的系统发育中堪称“进化计时器”，既含保守序列，又含可变序列。针对种间的可变序列 设计引物，可用于细菌的种类鉴定。本实验的一对引物即根据此原理设计，实验证实该引物 只与Pg33277、W83反应，扩增出527 bp的片段，而与其他异种细菌如Pi，Pn， Pm，Pa，Pc，Pd等均无交叉反应。所以该引物具有高度特异性，可用于 Pg的鉴定。
3.2 本实验AP龈下菌斑Pg的个体阳性率为60.9%。Slots〔4〕报道龈下菌斑 Pg阳性率细菌培养法为34.5%，直接PCR法为63.4%。Haffajee〔5〕对90例牙周炎 患者的2299个位点用NDA探针检测出Pg的阳性率为91%。Soder〔6〕对20名重度牙 周炎的198个病变位点用DNA探针了解牙周病原菌的检出率，Pg为95%。本实验的结果高 于通常的细菌培养法，原因在于细菌培养之后采用灵敏度高的PCR法而不是生化表型鉴定法 。但与DNA探针法相比，本实验的检出率偏低，原因可能有：本实验中每一个体分别选取2个 病变位点和健康位点，位点数少于Haffajee和Soder等；本实验在病例的选择上包括中至重 度牙周炎而Soder则选择重度牙周炎；本实验结合培养法和PCR法，所以敏感性可能低于DNA 探针；Pg在不同种族和不地区也许存在分布上的差异。因为牙周感染是多种细菌的混合 感染，而不同地区不同人种对不同的细菌的易感性存在差异。
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3.3 本研究结果表明：Pg在AP患者的健康部位的检出率也非常高(28.1%)，稍低于病变 部位的检出率(35.9%)，但这种差异无统计学意义。有理由认为这种差异是由于Pg在健 康部位存在的量少于病变部位，采样不易采到所致。Pg作为最主要的致病菌已被大量的 研究所证实，但Pg是外源性致病菌还是内源性致病菌尚有争议。我们的研究结果支持 Pg是内源性致病菌，因为Pg不仅在牙周病变部位，在牙周健康部位也较广泛地存在， 但不能排除病变部位的Pg与健康部位的Pg有不同的基因型，存在毒力的差异。在感 染微生物学领域，这是一个普遍的现象，即致病菌存在多种基因型，不同基因型间存在毒力 的差异。只有少数有毒力的基因型才可能致病。那么，Pg是否存在特异致病的毒力基因 型，还需作进一步的研究。
本课题由国家自然科学基金资助，编号为 39300146
参考文献
1，Greenstein G,Lamster I.Bacterial transmission in periodontal diseases:A critical review.J Periodontol,1997,68:421
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2，Garcia L,Tercero JC,Legido B,et al.Rapid detection of Actinobacillus actin omycetemcomitans,Prevotella intermedia and Porphyromona gingivalis by multiplex PCR.J Periodontal Res,1998,33(1):59
3，Watanabe K,Frommel TO.Porphyromonas gingivalis,Actinobacillus actinomycetemcom itans and Treponema denticola detection in oral plaque samples using the polymer ase chain reaction.J Clin Periodontol,1996,23:212
4，Slots J,Ashimoto A,Flynn J,et al.Detection of putative periodontal pathog ens in subgingival specimens by 16S ribosomal DNA amplification with the polymer ase chain reaction.Clin Infect Dis,1995,20(Suppl 2):S304
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5，Haffajee AD,Socransky SS,Smith C,et al.The use of DNA probes to examine th e distribution of subgingival species in subiects with different levels of perio dontal destruction.J Clin Periodontol,1992,19:84
6，Soder PO,Jin LJ,Soder B.DNA probe detection of periodontopathogens in advanced periodontitis. Scand J Dent Res,1993,101:363
(收稿：1999-09-05 修回：1999-12-30), 百拇医药