氢氧化铝致猫慢性局限性癫痫模型的研究
作者：张伟丽 栾国明 闫丽 蒙和
单位：(北京市神经外科研究所)
关键词：氢氧化铝；癫痫；动物模型
首都医科大学学报000216 提要： 为研究氢氧化铝在猫慢性局限性癫痫形成中的作用，在猫运动区皮质注射不同剂量的氢氧化铝乳剂后，观察不同时间内其行为、脑电图的改变，并进行组织病理学分析。结果表明在运动区皮质注射氢氧化铝可引起注射部位损伤及动物脑电图的异常改变，剂量不同，损伤程度也不同，但均未发现连续性癫痫发作，也未观察到有否偶发。提示，氢氧化铝可造成猫脑电图的异常改变，但作为慢性局限性实验癫痫模型尚有待研究。
中图分类号： R742.1
Alumina Cream-induced Focal
, 百拇医药
Motor Epilepsy in Cats
Zhang Weili Luan Guoming Yan Li Meng He
(Beijing Neurosurgical Institute)
Abstract: Various dosages of alumina cream were spectively injected into the unilateral motor areas in cats in order to study its effect on the development of chronic focal epilepsy. The changes of cats′ behaviors, histological analysis and electroencephalographic(EEG) were observed from two to four months. Histological analysis showed that alumina cream produced an epileptic foci. Spikes were recorded easily during EEG monitoring when injection dosage was increased to 100～150 μL. But none of the cats were observed to occur spontaneous seizures. These results indicated that alumina cream could induced the abnormal changes of EEG in cats, however, because spontaneous seizures were less predicatable and were not observed, the reliability of this preparation in cats as a model of chronic focal epilepsy was debatable.
, 百拇医药
Key words: alumina; epilepsy; animal model
在众多可引发局部癫痫样放电的慢性实验动物模型中，在实验动物脑内局部应用铝胶是一可行的方法[1]。猴等灵长类动物对氢氧化铝的敏感性高，但其价格昂贵。因此在1998年我们使用猫这一常用的实验动物，采用不同的实验剂量从行为、脑电图及病理观察等3方面研究了氢氧化铝的致痫作用。
1 材料和方法
动物分组：健康家猫(自购)12只，雌雄不限，体质量2.5～3.5 kg。分为2组：①假手术对照组(2只)；②实验组(10只)：在猫运动区皮质注射4%氢氧化铝乳剂，共注射4点。根据不同的注射剂量将动物分为3组，即A组(3只)：剂量分别是3、5、10 μL；B组(3只)：剂量分别是20、50、70 μL；C组(4只)：剂量分别是100和150 μL。
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手术方法：以2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射。麻醉后剃去头顶之毛，固定于动物用脑立体定位仪上，消毒，铺无菌洞巾。颅正中直切口，根据SNIDER RS和NIENCER WT的猫立体定位图谱在矢状缝左侧4 mm，冠状缝后3 mm处钻孔，扩大骨窗约1 cm×1.5cm，暴露左侧大脑半球。再用ASA-601T射频热凝器(深圳安科高技术有限公司)作为刺激器，刺激强度5～6 V，波宽1 ms，频率20 Hz，刺激波为断续波，以引起对侧后肢肌肉收缩的刺激点处皮质定为运动中枢。将实验组动物用微量注射器将4%灭菌氢氧化铝乳剂注射到运动区皮质内，避开皮质血管区，与皮质呈45°刺入皮质下，约60 s注完，注射4点，每点相距2～3 mm[2]。假手术对照组不作处理。然后用明胶海绵覆盖骨窗，以保护脑组织，缝合头皮。
记录脑电图：采用八导生理记录仪(日本光电公司)，分别于术前、术后不同时间记录脑电图。采用单极导联，记录电极为针单极，记录点为双额和双顶，参考单极置于眉中央，采集频率为250 Hz，走纸速度为2.5 cm/s，滤波30 Hz。
, 百拇医药
病理标本留取：猫存活2～4个月后，用10% KCl 5 mL心脏注射使其猝死，快速取出大脑组织，固定于10%甲醛溶液中。充分固定后，石蜡包埋，将注药侧运动皮质和相应对照侧皮质切片，厚度为5 μm，HE染色和Nissl染色，光镜观察病理学改变。
统计学处理：采用四格表确切概率计算法。
2 结果
术后癫痫发作情况：2组动物术后均无偏瘫等功能损害。实验组动物注射剂量为3 μL(A组)、50 μL(B组)和100 μL(C组)的3例术后不明原因地进食减少，连续3 d肌注80万 U青霉素后有所改善，但几天后进食又减少，故处死，暴露大脑后发现有轻度感染。其余动物生长良好，饲养2～4个月均未观察到肢体抽搐等连续的癫痫发作症状，是否有偶发亦未观察到。
脑电图表现：①假手术对照组动物在术后2、5、8、11周分别记录脑电图，均无异常脑波存在。②实验组A组有1只(剂量为10 μL)在术后8周和18周出现多发棘波(12.5%，2/16，表1，图1)，B组2只(剂量分别为20 μL和70 μL)分别在术后12周和16周出现多发兴奋波群(11.8%，2/17，表1，图2)，C组3只(剂量分别为100 μL 1只和150 μL 2只)从术后10周开始到18周的不同时间里，多次出现兴奋性棘波群或棘慢波群(46.2%，12/26，表1，图3)，C组比A、B组癫性放电次数显著增多(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 实验组EEG监测痫性放电发生次数 组别
n
痫性放电
正常波形
A
3
2
14
B
3
2
15
C
, http://www.100md.com
4
12**
14
**与A、B组比较P<0.01
图1 A组动物术后8周的脑电图
示左额兴奋性棘波群
图2 B组动物术后12周的脑电图
示左额兴奋性波群
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图3 C组动物术后10周的脑电图
示全导棘慢波群
病理结果：①假手术对照组：左右两侧运动区大脑皮质结构清晰，仅有轻度蛛网膜下腔陈旧性出血，神经元胞核清楚，结构正常。②实验组：3组动物对照侧皮质结构均正常，注药侧可见蛛网膜下腔陈旧性出血，软脑膜受损，有胶质细胞增生，Ⅲ～V层有注射药物形成的损伤灶，内有陈旧性出血，胶质细胞增生，周围的神经元核固缩或消失，尼氏体消失。C组动物的损伤灶比A、B 2组范围大且严重，形成一空腔。
3 讨论
人类癫痫是以神经元过度放电和抑制交替发生为特征的、反复产生的发作性脑功能异常。由于致痫部位不同及过度放电和过度抑制所占比例的不同，而衍生出各种不同的临床癫痫发作类型，因此与之相应的癫痫动物模型也就多种多样。点燃效应是1种较理想的慢性实验性动物癫痫模型，可在多种动物形成，一旦被点燃而出现癫痫可持续很久时间，类似于人类的继发性全身大发作，但不是癫痫的局限性发作，而且技术要求高，电极昂贵[3]。在运动区皮质注射金属如钴也可造成局部活跃放电，但不能产生典型的慢性长期癫痫灶，发作强度4～6周后逐渐减弱或停止发作[4]。氢氧化铝慢性实验性癫痫模型主要用恒河猴作为实验对象，在运动区皮质注射氢氧化铝乳剂后可形成稳定的致痫灶，大约在35～60 d后才出现自发性临床发作，类似于人类临床部分性癫痫发作，症状可持续数月至数年，为实验研究提供充分的时间。但这种发作频率较低，平均每天1～2次[5]。
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本实验以猫为实验对象，在运动区皮质注射不同剂量的氢氧化铝乳剂后观察2～4个月，未观察到连续的自发性临床发作，考虑有以下原因：①氢氧化铝引起的癫痫发作延迟时间长，次数少，反复出现的偶发抽搐不可预见，造成观察上的困难，故需有连续录像监测系统；②猴等灵长类动物对氢氧化铝的损伤作用敏感，而猫、鼠等小动物不太敏感[6]。
注射氢氧化铝后不同时间记录的脑电图表明，氢氧化铝作用于运动区皮质，可引起皮质细胞出现癫痫样放电，而且随着剂量的加大，记录到的兴奋性棘波群或棘慢波群次数显著增多。组织病理学的结果表明，注药侧皮质有损伤灶，且随着剂量的加大，损伤程度加重，神经元消失，胶质细胞质增生明显。但致痫灶的对侧大脑半球的相应部位结构基本正常。
脑电图和病理学观察表明，氢氧化铝注射剂量在100～150 μL效果较好，但由于抽搐发作的不可预见性，癫痫发作症状不易捕捉，氢氧化铝致猫慢性局限性的癫痫模型尚有待研究。
, 百拇医药
参 考 文 献
1，裴印权,王大仁.实验性动物癫痫模型.国外医学神经精神疾病分册,1988,1:13～17
2，Lockard J S, Wyler A R. The influence of attending on seizure activity in epiletic monkeys. Epilepsia, 1979,20:157～168
3，McNamara J O. Analysis of the molecular basis of kindling development. Psychiatr Clin Neurosci,1995,49:s175～178
4，Koyama I. A morphological study of the cortical pyramidal neuron in the cobalt-induced epileptogenic focus of the cat. Jpn J Psychiatry Neurol,1992,46:351～352
, 百拇医药
5，Lockard J S, Levy R H. Carbamazepine plus stiripentol: Is polytheraphy by design possible? Epilepsia, 1988,29:476～478
6，Velasco M, Velasco F, Estrada-Villanueva F. Alumina cream-induced focal motor epilepsy in cats. Part I. Lesion size and temporal course. Epilepsia, 1973,14:3～14
收稿日期：1999-05-04, 百拇医药
单位：(北京市神经外科研究所)
关键词：氢氧化铝；癫痫；动物模型
首都医科大学学报000216 提要： 为研究氢氧化铝在猫慢性局限性癫痫形成中的作用，在猫运动区皮质注射不同剂量的氢氧化铝乳剂后，观察不同时间内其行为、脑电图的改变，并进行组织病理学分析。结果表明在运动区皮质注射氢氧化铝可引起注射部位损伤及动物脑电图的异常改变，剂量不同，损伤程度也不同，但均未发现连续性癫痫发作，也未观察到有否偶发。提示，氢氧化铝可造成猫脑电图的异常改变，但作为慢性局限性实验癫痫模型尚有待研究。
中图分类号： R742.1
Alumina Cream-induced Focal
, 百拇医药
Motor Epilepsy in Cats
Zhang Weili Luan Guoming Yan Li Meng He
(Beijing Neurosurgical Institute)
Abstract: Various dosages of alumina cream were spectively injected into the unilateral motor areas in cats in order to study its effect on the development of chronic focal epilepsy. The changes of cats′ behaviors, histological analysis and electroencephalographic(EEG) were observed from two to four months. Histological analysis showed that alumina cream produced an epileptic foci. Spikes were recorded easily during EEG monitoring when injection dosage was increased to 100～150 μL. But none of the cats were observed to occur spontaneous seizures. These results indicated that alumina cream could induced the abnormal changes of EEG in cats, however, because spontaneous seizures were less predicatable and were not observed, the reliability of this preparation in cats as a model of chronic focal epilepsy was debatable.
, 百拇医药
Key words: alumina; epilepsy; animal model
在众多可引发局部癫痫样放电的慢性实验动物模型中，在实验动物脑内局部应用铝胶是一可行的方法[1]。猴等灵长类动物对氢氧化铝的敏感性高，但其价格昂贵。因此在1998年我们使用猫这一常用的实验动物，采用不同的实验剂量从行为、脑电图及病理观察等3方面研究了氢氧化铝的致痫作用。
1 材料和方法
动物分组：健康家猫(自购)12只，雌雄不限，体质量2.5～3.5 kg。分为2组：①假手术对照组(2只)；②实验组(10只)：在猫运动区皮质注射4%氢氧化铝乳剂，共注射4点。根据不同的注射剂量将动物分为3组，即A组(3只)：剂量分别是3、5、10 μL；B组(3只)：剂量分别是20、50、70 μL；C组(4只)：剂量分别是100和150 μL。
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手术方法：以2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射。麻醉后剃去头顶之毛，固定于动物用脑立体定位仪上，消毒，铺无菌洞巾。颅正中直切口，根据SNIDER RS和NIENCER WT的猫立体定位图谱在矢状缝左侧4 mm，冠状缝后3 mm处钻孔，扩大骨窗约1 cm×1.5cm，暴露左侧大脑半球。再用ASA-601T射频热凝器(深圳安科高技术有限公司)作为刺激器，刺激强度5～6 V，波宽1 ms，频率20 Hz，刺激波为断续波，以引起对侧后肢肌肉收缩的刺激点处皮质定为运动中枢。将实验组动物用微量注射器将4%灭菌氢氧化铝乳剂注射到运动区皮质内，避开皮质血管区，与皮质呈45°刺入皮质下，约60 s注完，注射4点，每点相距2～3 mm[2]。假手术对照组不作处理。然后用明胶海绵覆盖骨窗，以保护脑组织，缝合头皮。
记录脑电图：采用八导生理记录仪(日本光电公司)，分别于术前、术后不同时间记录脑电图。采用单极导联，记录电极为针单极，记录点为双额和双顶，参考单极置于眉中央，采集频率为250 Hz，走纸速度为2.5 cm/s，滤波30 Hz。
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病理标本留取：猫存活2～4个月后，用10% KCl 5 mL心脏注射使其猝死，快速取出大脑组织，固定于10%甲醛溶液中。充分固定后，石蜡包埋，将注药侧运动皮质和相应对照侧皮质切片，厚度为5 μm，HE染色和Nissl染色，光镜观察病理学改变。
统计学处理：采用四格表确切概率计算法。
2 结果
术后癫痫发作情况：2组动物术后均无偏瘫等功能损害。实验组动物注射剂量为3 μL(A组)、50 μL(B组)和100 μL(C组)的3例术后不明原因地进食减少，连续3 d肌注80万 U青霉素后有所改善，但几天后进食又减少，故处死，暴露大脑后发现有轻度感染。其余动物生长良好，饲养2～4个月均未观察到肢体抽搐等连续的癫痫发作症状，是否有偶发亦未观察到。
脑电图表现：①假手术对照组动物在术后2、5、8、11周分别记录脑电图，均无异常脑波存在。②实验组A组有1只(剂量为10 μL)在术后8周和18周出现多发棘波(12.5%，2/16，表1，图1)，B组2只(剂量分别为20 μL和70 μL)分别在术后12周和16周出现多发兴奋波群(11.8%，2/17，表1，图2)，C组3只(剂量分别为100 μL 1只和150 μL 2只)从术后10周开始到18周的不同时间里，多次出现兴奋性棘波群或棘慢波群(46.2%，12/26，表1，图3)，C组比A、B组癫性放电次数显著增多(P<0.01)。
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表1 实验组EEG监测痫性放电发生次数 组别
n
痫性放电
正常波形
A
3
2
14
B
3
2
15
C
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4
12**
14
**与A、B组比较P<0.01
图1 A组动物术后8周的脑电图
示左额兴奋性棘波群
图2 B组动物术后12周的脑电图
示左额兴奋性波群
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图3 C组动物术后10周的脑电图
示全导棘慢波群
病理结果：①假手术对照组：左右两侧运动区大脑皮质结构清晰，仅有轻度蛛网膜下腔陈旧性出血，神经元胞核清楚，结构正常。②实验组：3组动物对照侧皮质结构均正常，注药侧可见蛛网膜下腔陈旧性出血，软脑膜受损，有胶质细胞增生，Ⅲ～V层有注射药物形成的损伤灶，内有陈旧性出血，胶质细胞增生，周围的神经元核固缩或消失，尼氏体消失。C组动物的损伤灶比A、B 2组范围大且严重，形成一空腔。
3 讨论
人类癫痫是以神经元过度放电和抑制交替发生为特征的、反复产生的发作性脑功能异常。由于致痫部位不同及过度放电和过度抑制所占比例的不同，而衍生出各种不同的临床癫痫发作类型，因此与之相应的癫痫动物模型也就多种多样。点燃效应是1种较理想的慢性实验性动物癫痫模型，可在多种动物形成，一旦被点燃而出现癫痫可持续很久时间，类似于人类的继发性全身大发作，但不是癫痫的局限性发作，而且技术要求高，电极昂贵[3]。在运动区皮质注射金属如钴也可造成局部活跃放电，但不能产生典型的慢性长期癫痫灶，发作强度4～6周后逐渐减弱或停止发作[4]。氢氧化铝慢性实验性癫痫模型主要用恒河猴作为实验对象，在运动区皮质注射氢氧化铝乳剂后可形成稳定的致痫灶，大约在35～60 d后才出现自发性临床发作，类似于人类临床部分性癫痫发作，症状可持续数月至数年，为实验研究提供充分的时间。但这种发作频率较低，平均每天1～2次[5]。
, http://www.100md.com
本实验以猫为实验对象，在运动区皮质注射不同剂量的氢氧化铝乳剂后观察2～4个月，未观察到连续的自发性临床发作，考虑有以下原因：①氢氧化铝引起的癫痫发作延迟时间长，次数少，反复出现的偶发抽搐不可预见，造成观察上的困难，故需有连续录像监测系统；②猴等灵长类动物对氢氧化铝的损伤作用敏感，而猫、鼠等小动物不太敏感[6]。
注射氢氧化铝后不同时间记录的脑电图表明，氢氧化铝作用于运动区皮质，可引起皮质细胞出现癫痫样放电，而且随着剂量的加大，记录到的兴奋性棘波群或棘慢波群次数显著增多。组织病理学的结果表明，注药侧皮质有损伤灶，且随着剂量的加大，损伤程度加重，神经元消失，胶质细胞质增生明显。但致痫灶的对侧大脑半球的相应部位结构基本正常。
脑电图和病理学观察表明，氢氧化铝注射剂量在100～150 μL效果较好，但由于抽搐发作的不可预见性，癫痫发作症状不易捕捉，氢氧化铝致猫慢性局限性的癫痫模型尚有待研究。
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参 考 文 献
1，裴印权,王大仁.实验性动物癫痫模型.国外医学神经精神疾病分册,1988,1:13～17
2，Lockard J S, Wyler A R. The influence of attending on seizure activity in epiletic monkeys. Epilepsia, 1979,20:157～168
3，McNamara J O. Analysis of the molecular basis of kindling development. Psychiatr Clin Neurosci,1995,49:s175～178
4，Koyama I. A morphological study of the cortical pyramidal neuron in the cobalt-induced epileptogenic focus of the cat. Jpn J Psychiatry Neurol,1992,46:351～352
, 百拇医药
5，Lockard J S, Levy R H. Carbamazepine plus stiripentol: Is polytheraphy by design possible? Epilepsia, 1988,29:476～478
6，Velasco M, Velasco F, Estrada-Villanueva F. Alumina cream-induced focal motor epilepsy in cats. Part I. Lesion size and temporal course. Epilepsia, 1973,14:3～14
收稿日期：1999-05-04, 百拇医药