ELISA法检测梅毒螺旋体特异性抗体
作者：沈财成 姜红鹰 楼文文 林盈
单位：沈财成(温州医学院 检验系，浙江 温州 325027)；姜红鹰(邵逸夫医院，浙江 杭州 310000)；楼文文(温州医学院附属第二医院，浙江 温州 325027)；林盈(温州市中心血站，浙江 温州 325000)
关键词：ELISA；梅毒螺旋体；血源筛查
温州医学院学报000241
[摘 要] 目的:建立一种可用于血源筛查检测梅毒螺旋体特异性抗体的方法。 方法:采用重组表达的梅毒螺旋体表面膜蛋白P47和P15作为抗原建立酶联免疫吸附试验(ELISA)法，与甲苯胺红卡片试验(TRUST)法对比检测了75例梅毒病人和127例相关疾病以及1061例献血员的血清，不符合者用螺旋体血球凝集试验(TPHA)法验证。 结果:ELISA与TPHA结果完全符合，TRUST法有6例假阴性和4例假阳性。结论:ELISA法检测梅毒螺旋体特异性抗体具有敏感性高、特异性好、自动化程度高、易于标准化等优点，适合血源筛查和临床梅毒病人确诊试验用。
, 百拇医药
[中图分类号] R446.62 [文献标识码] B [文章编号] 1000-2138(2000)02-0167-03
梅毒是一种性传播性疾病，可通过血源传播，该病在我国出现上升趋势[1]。检测梅毒螺旋体有两类血清学试验：一类检测抗心磷脂抗体，方法有RPR、TRUST和ELISA[2]；另一种检测特异性抗体，方法有TPHA、荧光螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)、胶体金法[3]、胶乳法[4]，未见ELISA法报道。检测抗心磷脂抗体的方法具有较高的生物假阴性和假阳性，严重威胁着输血安全。目前，诊断梅毒常用快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)或TRUST筛选后再用TPHA确证。但TPHA在梅毒早期敏感性较差，而且操作时间长，不易于自动化，试剂稳定差,不适合大批量标本检测。为提高梅毒检测的特异性、敏感性和自动化程度，我们采用基因重组的梅毒螺旋体抗原建立了ELISA法，现报道如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 对象
1.1.1 1061例献血员血清由温州市中心血站提供。
1.1.2 75例梅毒血清，有典型临床表现，经FTA-ABS检查证实。其中15例为一期梅毒、15例为早期潜伏梅毒、45例为二期梅毒，由上海市皮肤病性病防治中心提供。
1.1.3 127例门诊病人(其中22例类风湿关节炎、55例慢性迁移性肝炎、50例为晚期妊娠)由温州医学院附属第二医院提供。
1.2 对照试验
1.2.1 甲苯胺红卡片试验(TRUST)：上海荣盛生物技术有限公司生产，批号：980421。
1.2.2 梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)试剂盒：日本富士生物株式会社生产，批号：VN 80620。
, 百拇医药
1.3 ELISA法
1.3.1 梅毒螺旋体特异性抗原TMPA 74KD(P47)，TMPA 42KD(P15)，抗人IgG、IgM酶结合物由美国TG公司提供，按参考文献[5，7]方法设计。
1.3.2 ELISA法操作方法：在包被抗原的微孔中加入10μl样品稀释液和待测血清10μl 37℃孵育30分钟，用洗涤液洗4次；加入100μl酶结合物37℃孵育20分钟，用洗涤液洗4次；加入100μl TMB显色液，37℃暗处放置10分钟；加入100μl终止液，用双波长450nm/650nm读取吸光度。Cut off值＝阴性对照平均值+0.16(+0.16为1000例正常人检测吸光度的3SD)。
1.3.3 所有血清(浆)标本分别用ELISA和TRUST法测定，对结果不符合者用TPHA验证。TPHA、TRUST严格按说明书操作和判断结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1 1061例献血员血浆均经过TRUST初筛合格后采取的。分别用TRUST和ELISA法对比检测，TRUST阴性1059例，2例可疑；ELISA法阴性1055例，6例阳性，经TPHA验证均为阳性，其中包括TRUST可疑2例。
2.2 75例梅毒病人血清检测，分别用TRUST、ELISA、TPHA测定，均阳性73例，均阴性2例，符合率100%,2例阴性病人血清是取自于有生殖器溃疡的梅毒病人。结果见表1。
表1 三种试验检测梅毒病人血清结果比较
例数
阳性
TRUST
ELISA
, 百拇医药
TPHA
一期梅毒
15
13
13
13
二期梅毒
45
45
45
45
早期潜伏梅毒
15
, 百拇医药 15
15
15
2.3 对127例门诊病人分别用TRUST和ELISA检测，4例TRUST阳性病人临床无支持梅毒诊断依据，经TPHA验证均阴性，系生物假阳性引起。结果见表2。表2 相关疾病TRUST、ELISA检测结果比较
例数
阳性
TRUST
ELISA
TPHA
类风湿性关节炎
22
, 百拇医药
3
0
0
慢性迁移性肝炎
55
0
0
0
晚 期 妊 娠
50
1
0
0
3 讨论
, 百拇医药
对苍白螺旋体的抗原研究表明，苍白螺旋体存在11～23种多肽抗原，其中15.5KD、42KD、45KD、74KD蛋白被证实为苍白螺旋体特异性抗原[6]，而74KD(P47)蛋白在人及动物体内免疫原性最强，该抗体在梅毒各个病程血清中都可以检测到，42KD(P15)与74KD(P47)具有较高的互补性，敏感性可达到100%[7]。利用基因重组技术获得P47和P15作为复合抗原，检测梅毒螺旋体抗体具有特异性、敏感性高等优点。本研究表明在1263例中，总准确度达99.84%。但2例生殖器溃疡病人却表现为阴性，表明敏感性还存在不足。
在血源梅毒筛选试验中，因RPR、TRUST操作方便，成本低廉而广泛使用。但因实验影响因素多，如试剂运输不当、保存不当、反应温度、混匀强度和时间等，结果判断主观性较强，而且敏感性差，严重威胁着献血安全，因此均非理想的筛选方法。在1061例初筛阴性的血清中有2例因试剂更换和操作人员不同结果判断为可疑，TRUST假阴性率达0.565%，应引起重视。梅毒相关疾病检测表明：TRUST法生物假阳性较高。
, 百拇医药
ELISA法是一种理想的、适用于筛查大批量血源标本的方法。我国献血员筛查规定HBsAg、HIV、HCV、梅毒和GPT为必检项目。前三者都采用ELISA法，只有梅毒还用TRUST或RPR凭肉眼判断，自动化程度低。随着自动化酶联免疫分析仪的普及，ELISA法检测梅毒可以与其他筛查项目(包括GPT)共用同一份标本自动完成检测，对减少标本差错，提高检测准确度，提高自动化程度等都有重要意义。在降低成本前提下，ELISA法必将取代TRUST或RPR法。
目前，我国用于临床梅毒病人检查的试验大都用RPR或TRUST筛查，用TPHA确证。由于TPHA操作复杂，试剂稳定性差，成本高，结果判断主观性强，而且生物假阴性高。因此，它也不是理想的确证试验。本研究表明ELISA和TPHA符合率达100%，但若扩大研究范围，比较ELISA和TPHA对诊断梅毒的敏感度和病情判断以及疗效观察等方面还有待进一步研究。
作者简介：沈财成(1967-),男,浙江金华人,讲师,主要从事临床检验新技术、新方法的研究。
, http://www.100md.com
参考文献
[1] 全国梅毒流行病学调查协作组.1990年至1994年全国38个城市监测点梅毒流行病学调查报告[J].中华皮肤科杂志， 1996，29(3)：152-156.
[2] 邓建红，黄文明，李定，等.ELISA法与RPR法筛选梅毒的对比研究[J].中国皮肤性病学杂志，1998，12(1)：7-8.
[3] 徐元宏，陈莉，张敏，等.胶体金法检测梅毒螺旋体特异性抗体的初步观察[J].中华皮肤科杂志，1998，31(3)：192-193.
[4] 范亚民，缑宇虹.梅毒螺旋体特异性抗体快速检测胶乳试剂的研制[J]. 中国皮肤性病学杂志，1996，10(3)：170-173.
[5] Farshy CE，Hunter EF,Larsen SA,et al.Double-conjugated e-
, 百拇医药
nzyme-linked immunosorbent assay for immuonogloblins G and M against treponema pallidum[J]. J Clin Microbiol，1984，20(6)：1109-1113.
[6] Chamberlain NR， Radolf JD，Hsu PL，et al. Genetic and phy-
sicochemical characterization of the recombinant DNA-derived 47-kilodalton surface immunogen of treponema pallidum subsp[J]. Infect Immun, 1988，56(1)：71-78.
[7] Lefever JC, Bertrand MA, Baariaud R,et al. Evaluation of t-
he captia enzyme immunoassays for detection of immunoglobulins G and M to treponema pallidum in syphilis[J]. J Clin microbiol，1990，28(8)：1704-1707.
收稿日期：1999-10-22
修回日期：1999-12-08, 百拇医药
单位：沈财成(温州医学院 检验系，浙江 温州 325027)；姜红鹰(邵逸夫医院，浙江 杭州 310000)；楼文文(温州医学院附属第二医院，浙江 温州 325027)；林盈(温州市中心血站，浙江 温州 325000)
关键词：ELISA；梅毒螺旋体；血源筛查
温州医学院学报000241
[摘 要] 目的:建立一种可用于血源筛查检测梅毒螺旋体特异性抗体的方法。 方法:采用重组表达的梅毒螺旋体表面膜蛋白P47和P15作为抗原建立酶联免疫吸附试验(ELISA)法，与甲苯胺红卡片试验(TRUST)法对比检测了75例梅毒病人和127例相关疾病以及1061例献血员的血清，不符合者用螺旋体血球凝集试验(TPHA)法验证。 结果:ELISA与TPHA结果完全符合，TRUST法有6例假阴性和4例假阳性。结论:ELISA法检测梅毒螺旋体特异性抗体具有敏感性高、特异性好、自动化程度高、易于标准化等优点，适合血源筛查和临床梅毒病人确诊试验用。
, 百拇医药
[中图分类号] R446.62 [文献标识码] B [文章编号] 1000-2138(2000)02-0167-03
梅毒是一种性传播性疾病，可通过血源传播，该病在我国出现上升趋势[1]。检测梅毒螺旋体有两类血清学试验：一类检测抗心磷脂抗体，方法有RPR、TRUST和ELISA[2]；另一种检测特异性抗体，方法有TPHA、荧光螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)、胶体金法[3]、胶乳法[4]，未见ELISA法报道。检测抗心磷脂抗体的方法具有较高的生物假阴性和假阳性，严重威胁着输血安全。目前，诊断梅毒常用快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)或TRUST筛选后再用TPHA确证。但TPHA在梅毒早期敏感性较差，而且操作时间长，不易于自动化，试剂稳定差,不适合大批量标本检测。为提高梅毒检测的特异性、敏感性和自动化程度，我们采用基因重组的梅毒螺旋体抗原建立了ELISA法，现报道如下。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 对象
1.1.1 1061例献血员血清由温州市中心血站提供。
1.1.2 75例梅毒血清，有典型临床表现，经FTA-ABS检查证实。其中15例为一期梅毒、15例为早期潜伏梅毒、45例为二期梅毒，由上海市皮肤病性病防治中心提供。
1.1.3 127例门诊病人(其中22例类风湿关节炎、55例慢性迁移性肝炎、50例为晚期妊娠)由温州医学院附属第二医院提供。
1.2 对照试验
1.2.1 甲苯胺红卡片试验(TRUST)：上海荣盛生物技术有限公司生产，批号：980421。
1.2.2 梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)试剂盒：日本富士生物株式会社生产，批号：VN 80620。
, 百拇医药
1.3 ELISA法
1.3.1 梅毒螺旋体特异性抗原TMPA 74KD(P47)，TMPA 42KD(P15)，抗人IgG、IgM酶结合物由美国TG公司提供，按参考文献[5，7]方法设计。
1.3.2 ELISA法操作方法：在包被抗原的微孔中加入10μl样品稀释液和待测血清10μl 37℃孵育30分钟，用洗涤液洗4次；加入100μl酶结合物37℃孵育20分钟，用洗涤液洗4次；加入100μl TMB显色液，37℃暗处放置10分钟；加入100μl终止液，用双波长450nm/650nm读取吸光度。Cut off值＝阴性对照平均值+0.16(+0.16为1000例正常人检测吸光度的3SD)。
1.3.3 所有血清(浆)标本分别用ELISA和TRUST法测定，对结果不符合者用TPHA验证。TPHA、TRUST严格按说明书操作和判断结果。
, 百拇医药
2 结果
2.1 1061例献血员血浆均经过TRUST初筛合格后采取的。分别用TRUST和ELISA法对比检测，TRUST阴性1059例，2例可疑；ELISA法阴性1055例，6例阳性，经TPHA验证均为阳性，其中包括TRUST可疑2例。
2.2 75例梅毒病人血清检测，分别用TRUST、ELISA、TPHA测定，均阳性73例，均阴性2例，符合率100%,2例阴性病人血清是取自于有生殖器溃疡的梅毒病人。结果见表1。
表1 三种试验检测梅毒病人血清结果比较
例数
阳性
TRUST
ELISA
, 百拇医药
TPHA
一期梅毒
15
13
13
13
二期梅毒
45
45
45
45
早期潜伏梅毒
15
, 百拇医药 15
15
15
2.3 对127例门诊病人分别用TRUST和ELISA检测，4例TRUST阳性病人临床无支持梅毒诊断依据，经TPHA验证均阴性，系生物假阳性引起。结果见表2。表2 相关疾病TRUST、ELISA检测结果比较
例数
阳性
TRUST
ELISA
TPHA
类风湿性关节炎
22
, 百拇医药
3
0
0
慢性迁移性肝炎
55
0
0
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晚 期 妊 娠
50
1
0
0
3 讨论
, 百拇医药
对苍白螺旋体的抗原研究表明，苍白螺旋体存在11～23种多肽抗原，其中15.5KD、42KD、45KD、74KD蛋白被证实为苍白螺旋体特异性抗原[6]，而74KD(P47)蛋白在人及动物体内免疫原性最强，该抗体在梅毒各个病程血清中都可以检测到，42KD(P15)与74KD(P47)具有较高的互补性，敏感性可达到100%[7]。利用基因重组技术获得P47和P15作为复合抗原，检测梅毒螺旋体抗体具有特异性、敏感性高等优点。本研究表明在1263例中，总准确度达99.84%。但2例生殖器溃疡病人却表现为阴性，表明敏感性还存在不足。
在血源梅毒筛选试验中，因RPR、TRUST操作方便，成本低廉而广泛使用。但因实验影响因素多，如试剂运输不当、保存不当、反应温度、混匀强度和时间等，结果判断主观性较强，而且敏感性差，严重威胁着献血安全，因此均非理想的筛选方法。在1061例初筛阴性的血清中有2例因试剂更换和操作人员不同结果判断为可疑，TRUST假阴性率达0.565%，应引起重视。梅毒相关疾病检测表明：TRUST法生物假阳性较高。
, 百拇医药
ELISA法是一种理想的、适用于筛查大批量血源标本的方法。我国献血员筛查规定HBsAg、HIV、HCV、梅毒和GPT为必检项目。前三者都采用ELISA法，只有梅毒还用TRUST或RPR凭肉眼判断，自动化程度低。随着自动化酶联免疫分析仪的普及，ELISA法检测梅毒可以与其他筛查项目(包括GPT)共用同一份标本自动完成检测，对减少标本差错，提高检测准确度，提高自动化程度等都有重要意义。在降低成本前提下，ELISA法必将取代TRUST或RPR法。
目前，我国用于临床梅毒病人检查的试验大都用RPR或TRUST筛查，用TPHA确证。由于TPHA操作复杂，试剂稳定性差，成本高，结果判断主观性强，而且生物假阴性高。因此，它也不是理想的确证试验。本研究表明ELISA和TPHA符合率达100%，但若扩大研究范围，比较ELISA和TPHA对诊断梅毒的敏感度和病情判断以及疗效观察等方面还有待进一步研究。
作者简介：沈财成(1967-),男,浙江金华人,讲师,主要从事临床检验新技术、新方法的研究。
, http://www.100md.com
参考文献
[1] 全国梅毒流行病学调查协作组.1990年至1994年全国38个城市监测点梅毒流行病学调查报告[J].中华皮肤科杂志， 1996，29(3)：152-156.
[2] 邓建红，黄文明，李定，等.ELISA法与RPR法筛选梅毒的对比研究[J].中国皮肤性病学杂志，1998，12(1)：7-8.
[3] 徐元宏，陈莉，张敏，等.胶体金法检测梅毒螺旋体特异性抗体的初步观察[J].中华皮肤科杂志，1998，31(3)：192-193.
[4] 范亚民，缑宇虹.梅毒螺旋体特异性抗体快速检测胶乳试剂的研制[J]. 中国皮肤性病学杂志，1996，10(3)：170-173.
[5] Farshy CE，Hunter EF,Larsen SA,et al.Double-conjugated e-
, 百拇医药
nzyme-linked immunosorbent assay for immuonogloblins G and M against treponema pallidum[J]. J Clin Microbiol，1984，20(6)：1109-1113.
[6] Chamberlain NR， Radolf JD，Hsu PL，et al. Genetic and phy-
sicochemical characterization of the recombinant DNA-derived 47-kilodalton surface immunogen of treponema pallidum subsp[J]. Infect Immun, 1988，56(1)：71-78.
[7] Lefever JC, Bertrand MA, Baariaud R,et al. Evaluation of t-
he captia enzyme immunoassays for detection of immunoglobulins G and M to treponema pallidum in syphilis[J]. J Clin microbiol，1990，28(8)：1704-1707.
收稿日期：1999-10-22
修回日期：1999-12-08, 百拇医药