蛇胆汁中牛磺胆酸含量测定方法的比较研究
作者：向一 石朝周 梅和珊 王凯平
单位：梅和珊(石家庄 050017 河北医科大学药学院)；向一 石朝周 王凯平(武汉 430030 同济医科大学药学院)
关键词：蛇胆汁；牛磺胆酸；含量测定
中国现代应用药学000309 摘要 目的：比较分析3种测定蛇胆汁中主要成分牛磺胆酸含量的方法， 制定科学合理统一的质量标准。方法：采用薄层层析-磷钼酸比色法、 薄层扫描法及高效液相色谱法对蛇胆汁中主要成分牛磺胆酸进行测定，并将结果进行比较分 析。结果：薄层层析-磷钼酸比色法、薄层扫描法及高效液相色谱法的 含量测定结果有一定差异，平均回收率分别为97.48%，98.51%和100.34%，RSD分别为4.6%，4.3%和1.5%。结论：高效液相色谱法灵敏、准确，可作为测定蛇胆汁中主成分牛磺胆酸含量的法定分析方法，建议制定统一的质量标准。
, http://www.100md.com
Method comparison for the determination of
taurocholic acid in snake bile
Xiang Yi
(Pharmacy School of Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Shi Chaozhou
(Pharmacy School of Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Mei Heshan
(Pharmacy School of Tongji Medical University,Wuhan 430030)
, http://www.100md.com
ABSTRACT OBJECTIVE：To compare the three methods for the det ermination of taruocholic acid in snake bile.METHODS:TLC-UV,TLCS an d HPLC were used.RESULTS:The results of the three methods were diffe rent and the average recoveries were 97.48% with RSD 4.6%,98.51% wit h RSD 4.3% and 100.34% with 1.5%,respectively.CONCLUSION:The HPLC method is the best for the determination of taurocholic acid in snake bile.
KEY WORDS snake bile,taurocholic acid,determination
, http://www.100md.com
蛇胆性甘、苦、寒、无毒，为一种常用中药，其功能为行气化痰、收风去湿 、清肝明目、平肝熄火。根据已有的文献报道[1～3]，其主要有效成分为牛磺胆酸 及钠盐，故应以牛磺胆酸及钠盐的含量多寡来确定蛇胆的质量优劣。《中国药典》95版附录 对药用蛇胆的品种作了规定，但未制定相应的质量标准；部分地方标准在进行蛇胆质量控制 时常采用硫酸-糠醛比色法测定总胆汁酸，但其结果根本不能反映蛇胆中主要有效成分的真 实含量。本文在综合及改进文献方法的基础上[4～7]，选用薄层分离-磷钼酸比色 法(方法1)、薄层扫描法(方法2)及高效液相色谱法(方法3)3种方法对蛇胆汁主要有效成分牛 磺胆酸进行了测定，并将结果进行了比较，以便为药用蛇胆及其含蛇胆制剂质量标准的合理 制定提供一定的科学依据。
1 仪器与试药
岛津(日 本)CS-930型色谱扫描仪；Waters 616型高效液相色谱仪；721型分光光度计(上海分析仪器 三厂)。
, http://www.100md.com
薄层板(20cm×15cm);硅胶G加入0.5% CMC-Na上清液湿法铺板，晾干，105℃活化 1h;磷钼酸显色剂：磷钼酸1.0g,加冰醋酸40ml溶解，临用时加硫酸5ml;稀释液：冰醋酸、蒸 馏水及硫酸各10ml混合；其它试剂均为分析纯。
牛磺胆酸钠标准溶液：精密称取干燥至恒 重的牛磺胆酸钠(TCA-Na)对照品(美国Sigma公司)50mg,用95%乙醇溶解定容至25ml;蛇胆汁 样品溶液：取新鲜蛇(购于集贸市场)胆汁，加入等体积的50%乙醇液，离心后得上清液。
2 实验方法与结果
2.1 方法1
2.1.1 线性关系 分别取牛磺胆酸钠标准溶液3,5,10,15,20和25μl 点样于硅胶G板上，用溶剂系统氯仿-甲醇-水(65∶28∶4)进行薄层分离，显色后取下牛磺 胆酸钠斑点及相应位置处的空白硅胶G，各加入2ml磷钼酸显色剂，于85℃油浴保温1h后，吸 取上清液于690nm处测定溶液吸收度，以浓度c(μg/ml)为纵坐标，吸收度值A为横坐标，得回归方程为：c=-0.672+7.364A,r=0.9952。
, 百拇医药
2.1.2 样品测定 取蛇胆汁样品溶液1.5ml,用95%乙醇稀释定容成25 ml。取该溶液20μl点样于硅胶G板上，同上法操作，由回归方程计算蛇胆汁中牛磺胆酸钠的 含量，结果见表1。
2.2 方法2
2.2.1 线性关系 将牛磺胆酸钠标准溶液稀释1倍后，用微量进样器 精密吸取该溶液0.25,0.5,1.0,1.5,2.0和2.5μl分别点样于硅胶G板上，以氯仿-异丙醇- 冰醋酸-水(25∶30∶4∶1)为展开剂，展开2次，每次10cm,以10%磷钼酸乙醇液为显色剂， 于105℃加热约5min。在薄层板上用另一同样大小的玻璃板覆盖，胶布固定。单波长(620nm) 反射式锯齿扫描;SX=3，狭缝1.2mm×1.2mm;线性校正CH=1;灵敏度：中。薄层分离与测定后 ，以点样量X(μg)为横坐标，相应的斑点峰面积积分值为纵坐标，得回归方程 为:Y=20742.18X+508.66,r=0.9984,结果表明峰面积(Y)与点样量(X)间呈良好 的线性关系。
, http://www.100md.com
2.2.2 精密度试验 在同一薄层板上随行点4个同样 量的稀释标准溶液及4个同样量的样品溶液，测量积分值，重复测定3块，牛磺胆酸的 RSD为4.2%。
2.2.3 样品测定 取蛇胆汁样品溶液1ml,用95%乙 醇稀释定容成50ml。取该溶液及稀释标准溶液按随行标准法点样于同一硅胶G板上，同上法 操作，牛磺胆酸斑点的Rf值为0.22,邻近斑点Rf值0.46,分离 度良好。用外标两点法计算蛇胆汁中牛磺胆酸钠的含量，结果见表1。
2.3 方法3
2.3.1 线性关系 分别量取牛磺胆 酸钠标准溶液0.6,1.0,1.4,1.8,2.6和3.0ml于6个10ml量瓶中，用蒸馏水定容、摇 匀，得6种对照品溶液。Nova Pak C18(4μm)色谱柱,ODS预柱，乙腈-水(1∶2,10%磷 酸调pH为3.08),柱温40℃，UV 210nm处检测。进样，仪器记录峰面积，以峰面积均值Y为纵坐标，进样浓度X(mg/ml)为横坐标，得回归方程为Y=201368.57X+83 .14,r=0.9996,结果表明峰面积(Y)与进样浓度(X)间呈良好的线性关系。
, http://www.100md.com
2.3.2 精密度试验 同一样品溶液4h内重复进样(n=5),结果R SD为1.06%。
2.3.3 样品测定 取蛇胆汁样品溶液1ml,用95 %乙醇稀释定容成50ml,微孔滤膜过滤后进样，牛磺胆酸组分的保留时间为2.2min,且与前后 峰的分离度均>2,故蛇胆汁中的其它组分对牛磺胆酸的含量测定没有影响。根据外标法计算 蛇胆汁中牛磺胆酸钠的含量，结果见表1。
表1 样品测定结果/mg.ml-1 方 法
测定次数 和结果
平均值
1
2
3
, 百拇医药
4
5
1
27.12
22.73
26.50
23.97
2 6.70
25.40
2
23.51
25.09
22.96
, 百拇医药
23.18
22.36
23.42
3
22.37
22.80
22.57
22.40
22.46
22.52
2.4 回收率的测定
取牛磺胆酸钠标准溶液和蛇胆汁样品溶液，分别配 制加样回收试验溶液，根据以上3种实验方法分别进行测定，结果见表2。表2 回收率测定结果/n=5 方 法
, 百拇医药
加入量/mg.ml-1
平均回收 率/%
RSD/%
1
0.3333
97.48
4.6
2
0.6700
98.51
4.3
3
, http://www.100md.com
0.1549
100.34
1.5
3 讨 论
3.1 方法1测定结果偏高 ，重现性较差，其原因是由于该方法实验步骤较多，操作繁琐，实验条件较难控制。但该方 法所用仪器、试剂易得。
3.2 方法2采用直接薄层扫描测定蛇胆汁 中主要有效成分牛磺胆酸的含量，其准确度和精密度不及方法3好，但优于方法1，且该方法 简便、快速，对于组分较多的含蛇胆汁制剂来说[5]，不失为一种既简便又易于常 规分析的含量测定方法。
3.3 高效液相色谱法(方法3)测得结果的准确 度和精密度均较方法1、方法2好，是测定蛇胆汁中主要成分牛磺胆酸含量较好的方法，可作 为蛇胆汁质量标准中的法定分析方法。但不足的地方是：流动相的pH值(pH=3)偏酸，影响色 谱柱寿命；柱前使用预柱可减少其它共存组分的干扰，但测定成本增高。
, http://www.100md.com
参考文献
1，张穗.十种蛇胆胆汁酸成分薄层层析分析.中成药，1989 ，(3)∶35.
2，朱强，石朝周，孙汉清.牛磺胆酸 钠的合成及其药理作用.中国药学杂志，1997，(4)∶236.
3，石朝周.中国专利，95112441，2(CN114657A).
4，郑崇直，罗国芳，管重庆，等.胆汁中结合胆汁酸的薄层 分离与定量测定.上海医学，1983，(1)∶38.
5，胡梅素，吕圭源.蛇胆及其制剂中牛磺胆酸含量比较.中 草药，1994，25(12)∶659.
6，宋占军，邓振华. 薄层扫描测定熊胆中结合胆汁酸的含量.药物分析杂志，1993，13(3)∶194.
7，刘卓妍，董元伟，梁意红，等.高效液相法测定蛇胆及蛇 胆川贝液中牛磺胆酸含量.中成药，1994，16(2)∶13.
收稿日期：1999-05-04, 百拇医药
单位：梅和珊(石家庄 050017 河北医科大学药学院)；向一 石朝周 王凯平(武汉 430030 同济医科大学药学院)
关键词：蛇胆汁；牛磺胆酸；含量测定
中国现代应用药学000309 摘要 目的：比较分析3种测定蛇胆汁中主要成分牛磺胆酸含量的方法， 制定科学合理统一的质量标准。方法：采用薄层层析-磷钼酸比色法、 薄层扫描法及高效液相色谱法对蛇胆汁中主要成分牛磺胆酸进行测定，并将结果进行比较分 析。结果：薄层层析-磷钼酸比色法、薄层扫描法及高效液相色谱法的 含量测定结果有一定差异，平均回收率分别为97.48%，98.51%和100.34%，RSD分别为4.6%，4.3%和1.5%。结论：高效液相色谱法灵敏、准确，可作为测定蛇胆汁中主成分牛磺胆酸含量的法定分析方法，建议制定统一的质量标准。
, http://www.100md.com
Method comparison for the determination of
taurocholic acid in snake bile
Xiang Yi
(Pharmacy School of Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Shi Chaozhou
(Pharmacy School of Tongji Medical University,Wuhan 430030)
Mei Heshan
(Pharmacy School of Tongji Medical University,Wuhan 430030)
, http://www.100md.com
ABSTRACT OBJECTIVE：To compare the three methods for the det ermination of taruocholic acid in snake bile.METHODS:TLC-UV,TLCS an d HPLC were used.RESULTS:The results of the three methods were diffe rent and the average recoveries were 97.48% with RSD 4.6%,98.51% wit h RSD 4.3% and 100.34% with 1.5%,respectively.CONCLUSION:The HPLC method is the best for the determination of taurocholic acid in snake bile.
KEY WORDS snake bile,taurocholic acid,determination
, http://www.100md.com
蛇胆性甘、苦、寒、无毒，为一种常用中药，其功能为行气化痰、收风去湿 、清肝明目、平肝熄火。根据已有的文献报道[1～3]，其主要有效成分为牛磺胆酸 及钠盐，故应以牛磺胆酸及钠盐的含量多寡来确定蛇胆的质量优劣。《中国药典》95版附录 对药用蛇胆的品种作了规定，但未制定相应的质量标准；部分地方标准在进行蛇胆质量控制 时常采用硫酸-糠醛比色法测定总胆汁酸，但其结果根本不能反映蛇胆中主要有效成分的真 实含量。本文在综合及改进文献方法的基础上[4～7]，选用薄层分离-磷钼酸比色 法(方法1)、薄层扫描法(方法2)及高效液相色谱法(方法3)3种方法对蛇胆汁主要有效成分牛 磺胆酸进行了测定，并将结果进行了比较，以便为药用蛇胆及其含蛇胆制剂质量标准的合理 制定提供一定的科学依据。
1 仪器与试药
岛津(日 本)CS-930型色谱扫描仪；Waters 616型高效液相色谱仪；721型分光光度计(上海分析仪器 三厂)。
, http://www.100md.com
薄层板(20cm×15cm);硅胶G加入0.5% CMC-Na上清液湿法铺板，晾干，105℃活化 1h;磷钼酸显色剂：磷钼酸1.0g,加冰醋酸40ml溶解，临用时加硫酸5ml;稀释液：冰醋酸、蒸 馏水及硫酸各10ml混合；其它试剂均为分析纯。
牛磺胆酸钠标准溶液：精密称取干燥至恒 重的牛磺胆酸钠(TCA-Na)对照品(美国Sigma公司)50mg,用95%乙醇溶解定容至25ml;蛇胆汁 样品溶液：取新鲜蛇(购于集贸市场)胆汁，加入等体积的50%乙醇液，离心后得上清液。
2 实验方法与结果
2.1 方法1
2.1.1 线性关系 分别取牛磺胆酸钠标准溶液3,5,10,15,20和25μl 点样于硅胶G板上，用溶剂系统氯仿-甲醇-水(65∶28∶4)进行薄层分离，显色后取下牛磺 胆酸钠斑点及相应位置处的空白硅胶G，各加入2ml磷钼酸显色剂，于85℃油浴保温1h后，吸 取上清液于690nm处测定溶液吸收度，以浓度c(μg/ml)为纵坐标，吸收度值A为横坐标，得回归方程为：c=-0.672+7.364A,r=0.9952。
, 百拇医药
2.1.2 样品测定 取蛇胆汁样品溶液1.5ml,用95%乙醇稀释定容成25 ml。取该溶液20μl点样于硅胶G板上，同上法操作，由回归方程计算蛇胆汁中牛磺胆酸钠的 含量，结果见表1。
2.2 方法2
2.2.1 线性关系 将牛磺胆酸钠标准溶液稀释1倍后，用微量进样器 精密吸取该溶液0.25,0.5,1.0,1.5,2.0和2.5μl分别点样于硅胶G板上，以氯仿-异丙醇- 冰醋酸-水(25∶30∶4∶1)为展开剂，展开2次，每次10cm,以10%磷钼酸乙醇液为显色剂， 于105℃加热约5min。在薄层板上用另一同样大小的玻璃板覆盖，胶布固定。单波长(620nm) 反射式锯齿扫描;SX=3，狭缝1.2mm×1.2mm;线性校正CH=1;灵敏度：中。薄层分离与测定后 ，以点样量X(μg)为横坐标，相应的斑点峰面积积分值为纵坐标，得回归方程 为:Y=20742.18X+508.66,r=0.9984,结果表明峰面积(Y)与点样量(X)间呈良好 的线性关系。
, http://www.100md.com
2.2.2 精密度试验 在同一薄层板上随行点4个同样 量的稀释标准溶液及4个同样量的样品溶液，测量积分值，重复测定3块，牛磺胆酸的 RSD为4.2%。
2.2.3 样品测定 取蛇胆汁样品溶液1ml,用95%乙 醇稀释定容成50ml。取该溶液及稀释标准溶液按随行标准法点样于同一硅胶G板上，同上法 操作，牛磺胆酸斑点的Rf值为0.22,邻近斑点Rf值0.46,分离 度良好。用外标两点法计算蛇胆汁中牛磺胆酸钠的含量，结果见表1。
2.3 方法3
2.3.1 线性关系 分别量取牛磺胆 酸钠标准溶液0.6,1.0,1.4,1.8,2.6和3.0ml于6个10ml量瓶中，用蒸馏水定容、摇 匀，得6种对照品溶液。Nova Pak C18(4μm)色谱柱,ODS预柱，乙腈-水(1∶2,10%磷 酸调pH为3.08),柱温40℃，UV 210nm处检测。进样，仪器记录峰面积，以峰面积均值Y为纵坐标，进样浓度X(mg/ml)为横坐标，得回归方程为Y=201368.57X+83 .14,r=0.9996,结果表明峰面积(Y)与进样浓度(X)间呈良好的线性关系。
, http://www.100md.com
2.3.2 精密度试验 同一样品溶液4h内重复进样(n=5),结果R SD为1.06%。
2.3.3 样品测定 取蛇胆汁样品溶液1ml,用95 %乙醇稀释定容成50ml,微孔滤膜过滤后进样，牛磺胆酸组分的保留时间为2.2min,且与前后 峰的分离度均>2,故蛇胆汁中的其它组分对牛磺胆酸的含量测定没有影响。根据外标法计算 蛇胆汁中牛磺胆酸钠的含量，结果见表1。
表1 样品测定结果/mg.ml-1 方 法
测定次数 和结果
平均值
1
2
3
, 百拇医药
4
5
1
27.12
22.73
26.50
23.97
2 6.70
25.40
2
23.51
25.09
22.96
, 百拇医药
23.18
22.36
23.42
3
22.37
22.80
22.57
22.40
22.46
22.52
2.4 回收率的测定
取牛磺胆酸钠标准溶液和蛇胆汁样品溶液，分别配 制加样回收试验溶液，根据以上3种实验方法分别进行测定，结果见表2。表2 回收率测定结果/n=5 方 法
, 百拇医药
加入量/mg.ml-1
平均回收 率/%
RSD/%
1
0.3333
97.48
4.6
2
0.6700
98.51
4.3
3
, http://www.100md.com
0.1549
100.34
1.5
3 讨 论
3.1 方法1测定结果偏高 ，重现性较差，其原因是由于该方法实验步骤较多，操作繁琐，实验条件较难控制。但该方 法所用仪器、试剂易得。
3.2 方法2采用直接薄层扫描测定蛇胆汁 中主要有效成分牛磺胆酸的含量，其准确度和精密度不及方法3好，但优于方法1，且该方法 简便、快速，对于组分较多的含蛇胆汁制剂来说[5]，不失为一种既简便又易于常 规分析的含量测定方法。
3.3 高效液相色谱法(方法3)测得结果的准确 度和精密度均较方法1、方法2好，是测定蛇胆汁中主要成分牛磺胆酸含量较好的方法，可作 为蛇胆汁质量标准中的法定分析方法。但不足的地方是：流动相的pH值(pH=3)偏酸，影响色 谱柱寿命；柱前使用预柱可减少其它共存组分的干扰，但测定成本增高。
, http://www.100md.com
参考文献
1，张穗.十种蛇胆胆汁酸成分薄层层析分析.中成药，1989 ，(3)∶35.
2，朱强，石朝周，孙汉清.牛磺胆酸 钠的合成及其药理作用.中国药学杂志，1997，(4)∶236.
3，石朝周.中国专利，95112441，2(CN114657A).
4，郑崇直，罗国芳，管重庆，等.胆汁中结合胆汁酸的薄层 分离与定量测定.上海医学，1983，(1)∶38.
5，胡梅素，吕圭源.蛇胆及其制剂中牛磺胆酸含量比较.中 草药，1994，25(12)∶659.
6，宋占军，邓振华. 薄层扫描测定熊胆中结合胆汁酸的含量.药物分析杂志，1993，13(3)∶194.
7，刘卓妍，董元伟，梁意红，等.高效液相法测定蛇胆及蛇 胆川贝液中牛磺胆酸含量.中成药，1994，16(2)∶13.
收稿日期：1999-05-04, 百拇医药
参见：首页 > 中医药 > 中药专业 > 中草药汇编 > 中药大典 > 动物类 > 蛇胆