人抗猪胰岛细胞天然抗体同种型的分析
作者：熊沛 姜汉英 张伟杰 夏穗生
单位：熊沛(广东省中山市博爱医院外科，中山 528403)；姜汉英 张伟杰 夏穗生(同济医科大学器官移植研究所，武汉 430030)
关键词：猪；胰岛；天然抗体
同济医科大学学报000315 摘要 为检测人抗猪胰岛细胞天然抗体的同种型，采 取18份胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)患者血清及20份正常人血清分别与杂种猪胰腺组织的冰 冻切片孵化后，再用免疫荧光标记的羊抗人IgG、IgM单克隆抗体染色。8份IDDM血清和8份正 常人血清中含有直接针对猪胰岛细胞的IgG型抗体；4份IDDM血清和6份正常人血清中含有IgM 型抗猪胰岛细胞抗体。结果表明：人抗猪胰岛细胞天然抗体的同种型是IgG和IgM型抗体。
中图法分类号 R322.5， R392.11
, 百拇医药
Isotype Characterization of Human Xeno reactive Natural Antibodies
against Porcine Pancrease Islet Cells
Xiong Pei
(General Surgery of Bo Ai Hospital of Zhongshan Ci ty, Zhongshan 528403)
Jiang Hanying
(Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical Univers ity, Wuhan 430030)
, 百拇医药
Zhang Weijie
(Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical Univers ity, Wuhan 430030)
Abstract To characterize the isotype of human xenoreactive nat ural antibodies against porcine pancrease islet cells, cyostat sections of the p ancrease were incubated with the sera from 18 cases of IDDM or 20 human controls respectively, further with FITC-conjugated goat antihuman IgG or IgM secondary antibodies. IgG was found to bind to pancrease islet cells in sera from 8 cases of IDDM and 8 human controls, while IgM in 4 IDDM and 6 human controls. It was suggested that isotypes of human xenoreative natural antibodies against porcine pancrease islet cells were IgG and IgM.
, 百拇医药
Key words swine; islands of langerhans; xenoreactive natural antibody
排斥反应是临床异种胰岛移植获得成功的主要障碍。人抗异种胰岛细胞天然抗体的存在可能 是导致异种胰岛移植物排斥的重要原因之一[1]。分析这类抗体的同种型，有助于 临床上特异地对其进行清除或抑制。本实验应用免疫荧光染色法检测了胰岛素依赖型糖尿病 (IDDM)患者血清及正常人血清中抗猪胰岛细胞天然抗体的同种型。
1 材料和方法
1.1 实验取材
1.1.1 血清取自同济医院内科18例胰岛素依赖型糖尿病患者(IDDM)，男性11例，女性7例，年龄6～42岁。正常人血清取自健康献血员，共20例，男性12例，女性8例，年龄16～40岁。
, 百拇医药
1.1.2 猪胰腺组织：胰腺标本取自本地杂种猪，雌雄不限，年龄约8个月，重80～100 kg 。将取出的胰腺组织剪成小块，放入液氮(-196℃)中快速冷冻，用以制备冰冻切片。
1.2 免疫荧光染色(间接法)
用恒冷切片机将猪胰腺作冰冻切片，厚约6 μm，冷丙酮中固定15 min,风干。将正常人及患 者血清用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)按1∶4稀释后分别加到切片上，在37 ℃温箱内温育30 min，阴性对照片用PBS代替血清，接着用0.1 mol/L PBS冲洗切片2次， 再滴加免疫荧光(FITC)抗人IgG、IgM单克隆抗体(北京军事科学研究院提供)，置37℃下 孵育30 min，后用0.1 mol/L PBS及双蒸水各冲洗两次，完后缓冲甘油封片。置Leitz荧光 显微镜下观察。
1.3 荧光定性及统计分析
, http://www.100md.com
镜下的细胞分为：胰岛细胞和血管内皮细胞。 天然抗体与细胞的荧光反应为： 阳性(+)：出现荧光反应者， 阴性(-)：没有荧光反应者。 统计学处理：采用χ2检验法，P<0.05为差异有显著意义。
2 结果
荧光染色显示：8例(44.2%)IDDM血清和8例(40%)正常人血清中含有直接针对胰岛细胞 的 IgG抗体；4例(22.2%)IDDM血清和6例(30%)正常人血清中含有IgM型抗猪胰岛细胞抗体 ， 荧光呈颗粒状散在分布于胰岛细胞团内。比较两组血清中IgG与IgM的阳性反应率，差异均无 显著意义。
除2例正常人血清分别仅含IgG和IgM抗血管内皮细胞抗体外，其它所有正常人血清及IDDM血 清均同时含有这两种抗体。荧光呈线性沉积于内皮细胞表面。阴性对照片中未见明显荧光。
3 讨论
, 百拇医药
天然抗体在异种胰岛移植的排斥反应中起了重要作用[1]。分析这类抗体的性质， 有助于临床上特异地对其进行清除或抑制，但天然抗体为何种免疫球蛋白尚有争议[2 ]。由于异种器官中的血管内皮细胞被认为是天然抗体的主要目标，故以往的报道多以它 们作为靶抗原进行研究，所检测的实际上是抗血管内皮细胞天然抗体的同种型[2] 。考虑到天然抗体在不同组织间的分布具有一定的特异性[3]，且胰岛移植物中绝 大部分的血管内皮细胞在移植前已被清除，检测抗胰岛细胞天然抗体的同种型与异种胰岛移 植更具相关性。
猪由于在生理学、生物化学及伦理学上具有种种优点，已成为临床异种移植 最主要的供体来源之一[4]，因而也是我们的研究对象。我们发现无论是在IDDM血 清还是在正常人血清中，IgG和IgM型抗体均能与猪胰岛细胞发生反应，比较两种抗体的阳性 反应率，差异无显著性(P>0.05)。由此我们提出人抗猪胰岛细胞的天然抗体实际包 括 IgG和IgM型抗体，二者均可能参与对异种胰岛的排斥过程。临床上寻求有效途径清除和抑制 受体血清中的天然抗体时应同时兼顾这两类免疫球蛋白。
, 百拇医药
IDDM的发病机制与自身免疫功能紊乱有关，许多患者体内存在着抗胰岛细胞的自身抗体 [5]，这些自身抗体与异种天然抗体是否存在交叉反应呢？实验结果显示，答案是否定 的。与正常对照血清相比，IDDM血清中两类抗胰岛细胞抗体的分布比例并无显著改变。表明 IDDM的病理免疫过程并未激活异种反应性B细胞克隆。
通过观察天然抗体在血管内皮细胞表面的沉积，我们认为人抗猪血管内皮细胞的天然抗体也 是IgG和IgM型抗体。天然抗体与内皮细胞的阳性反应率大大高于其与胰岛细胞的阳性反应率 ，提示天然抗体在不同组织细胞间的分布存在一定特异性。
总之，我们检测出人抗猪胰岛细胞天然抗体的同种型是IgG和IgM型抗体，为临床上寻求有效 途径特异地清除或抑制它们提供了免疫学基础。
国家自然科学基金资助项目(No.3970702)
, 百拇医药
熊沛，男，1969年生，主治医师，医学硕士
参 考 文 献
1，Hamelmann W, Ozasa T, Cairns T et al. Xeno-transplantation of islet across a strong species barrier (rabbit to cynomolgus monkey). Tr ansplant Proc, 1994,26:1097
2，Platt J L, Fischel R J, Matas A J et al. Immunopathology of h ype racute xenograft rejection in a swine-to-primate model. Transplantation, 19 91,52:214
3，Eckstein V, Müler -Ruchholtz W, Ulrichs K. Reaction patterns o f natural xenophiles antibodies in human sera with pancreatic islet cells and p orcine lymphocyte. Transplant Proc, 1994,26:997
4，Cooper D K C. Is xenotransplantation a realistic clinical option ? Transplant proc, 1992,24:2393
5，胡远峰. 胰岛素依赖型糖尿病的早期防治. 中华内分泌代谢杂志，1997，13(1 )：67
(1998-11-18 收稿), http://www.100md.com
单位：熊沛(广东省中山市博爱医院外科，中山 528403)；姜汉英 张伟杰 夏穗生(同济医科大学器官移植研究所，武汉 430030)
关键词：猪；胰岛；天然抗体
同济医科大学学报000315 摘要 为检测人抗猪胰岛细胞天然抗体的同种型，采 取18份胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)患者血清及20份正常人血清分别与杂种猪胰腺组织的冰 冻切片孵化后，再用免疫荧光标记的羊抗人IgG、IgM单克隆抗体染色。8份IDDM血清和8份正 常人血清中含有直接针对猪胰岛细胞的IgG型抗体；4份IDDM血清和6份正常人血清中含有IgM 型抗猪胰岛细胞抗体。结果表明：人抗猪胰岛细胞天然抗体的同种型是IgG和IgM型抗体。
中图法分类号 R322.5， R392.11
, 百拇医药
Isotype Characterization of Human Xeno reactive Natural Antibodies
against Porcine Pancrease Islet Cells
Xiong Pei
(General Surgery of Bo Ai Hospital of Zhongshan Ci ty, Zhongshan 528403)
Jiang Hanying
(Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical Univers ity, Wuhan 430030)
, 百拇医药
Zhang Weijie
(Institute of Organ Transplantation, Tongji Hospital, Tongji Medical Univers ity, Wuhan 430030)
Abstract To characterize the isotype of human xenoreactive nat ural antibodies against porcine pancrease islet cells, cyostat sections of the p ancrease were incubated with the sera from 18 cases of IDDM or 20 human controls respectively, further with FITC-conjugated goat antihuman IgG or IgM secondary antibodies. IgG was found to bind to pancrease islet cells in sera from 8 cases of IDDM and 8 human controls, while IgM in 4 IDDM and 6 human controls. It was suggested that isotypes of human xenoreative natural antibodies against porcine pancrease islet cells were IgG and IgM.
, 百拇医药
Key words swine; islands of langerhans; xenoreactive natural antibody
排斥反应是临床异种胰岛移植获得成功的主要障碍。人抗异种胰岛细胞天然抗体的存在可能 是导致异种胰岛移植物排斥的重要原因之一[1]。分析这类抗体的同种型，有助于 临床上特异地对其进行清除或抑制。本实验应用免疫荧光染色法检测了胰岛素依赖型糖尿病 (IDDM)患者血清及正常人血清中抗猪胰岛细胞天然抗体的同种型。
1 材料和方法
1.1 实验取材
1.1.1 血清取自同济医院内科18例胰岛素依赖型糖尿病患者(IDDM)，男性11例，女性7例，年龄6～42岁。正常人血清取自健康献血员，共20例，男性12例，女性8例，年龄16～40岁。
, 百拇医药
1.1.2 猪胰腺组织：胰腺标本取自本地杂种猪，雌雄不限，年龄约8个月，重80～100 kg 。将取出的胰腺组织剪成小块，放入液氮(-196℃)中快速冷冻，用以制备冰冻切片。
1.2 免疫荧光染色(间接法)
用恒冷切片机将猪胰腺作冰冻切片，厚约6 μm，冷丙酮中固定15 min,风干。将正常人及患 者血清用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)按1∶4稀释后分别加到切片上，在37 ℃温箱内温育30 min，阴性对照片用PBS代替血清，接着用0.1 mol/L PBS冲洗切片2次， 再滴加免疫荧光(FITC)抗人IgG、IgM单克隆抗体(北京军事科学研究院提供)，置37℃下 孵育30 min，后用0.1 mol/L PBS及双蒸水各冲洗两次，完后缓冲甘油封片。置Leitz荧光 显微镜下观察。
1.3 荧光定性及统计分析
, http://www.100md.com
镜下的细胞分为：胰岛细胞和血管内皮细胞。 天然抗体与细胞的荧光反应为： 阳性(+)：出现荧光反应者， 阴性(-)：没有荧光反应者。 统计学处理：采用χ2检验法，P<0.05为差异有显著意义。
2 结果
荧光染色显示：8例(44.2%)IDDM血清和8例(40%)正常人血清中含有直接针对胰岛细胞 的 IgG抗体；4例(22.2%)IDDM血清和6例(30%)正常人血清中含有IgM型抗猪胰岛细胞抗体 ， 荧光呈颗粒状散在分布于胰岛细胞团内。比较两组血清中IgG与IgM的阳性反应率，差异均无 显著意义。
除2例正常人血清分别仅含IgG和IgM抗血管内皮细胞抗体外，其它所有正常人血清及IDDM血 清均同时含有这两种抗体。荧光呈线性沉积于内皮细胞表面。阴性对照片中未见明显荧光。
3 讨论
, 百拇医药
天然抗体在异种胰岛移植的排斥反应中起了重要作用[1]。分析这类抗体的性质， 有助于临床上特异地对其进行清除或抑制，但天然抗体为何种免疫球蛋白尚有争议[2 ]。由于异种器官中的血管内皮细胞被认为是天然抗体的主要目标，故以往的报道多以它 们作为靶抗原进行研究，所检测的实际上是抗血管内皮细胞天然抗体的同种型[2] 。考虑到天然抗体在不同组织间的分布具有一定的特异性[3]，且胰岛移植物中绝 大部分的血管内皮细胞在移植前已被清除，检测抗胰岛细胞天然抗体的同种型与异种胰岛移 植更具相关性。
猪由于在生理学、生物化学及伦理学上具有种种优点，已成为临床异种移植 最主要的供体来源之一[4]，因而也是我们的研究对象。我们发现无论是在IDDM血 清还是在正常人血清中，IgG和IgM型抗体均能与猪胰岛细胞发生反应，比较两种抗体的阳性 反应率，差异无显著性(P>0.05)。由此我们提出人抗猪胰岛细胞的天然抗体实际包 括 IgG和IgM型抗体，二者均可能参与对异种胰岛的排斥过程。临床上寻求有效途径清除和抑制 受体血清中的天然抗体时应同时兼顾这两类免疫球蛋白。
, 百拇医药
IDDM的发病机制与自身免疫功能紊乱有关，许多患者体内存在着抗胰岛细胞的自身抗体 [5]，这些自身抗体与异种天然抗体是否存在交叉反应呢？实验结果显示，答案是否定 的。与正常对照血清相比，IDDM血清中两类抗胰岛细胞抗体的分布比例并无显著改变。表明 IDDM的病理免疫过程并未激活异种反应性B细胞克隆。
通过观察天然抗体在血管内皮细胞表面的沉积，我们认为人抗猪血管内皮细胞的天然抗体也 是IgG和IgM型抗体。天然抗体与内皮细胞的阳性反应率大大高于其与胰岛细胞的阳性反应率 ，提示天然抗体在不同组织细胞间的分布存在一定特异性。
总之，我们检测出人抗猪胰岛细胞天然抗体的同种型是IgG和IgM型抗体，为临床上寻求有效 途径特异地清除或抑制它们提供了免疫学基础。
国家自然科学基金资助项目(No.3970702)
, 百拇医药
熊沛，男，1969年生，主治医师，医学硕士
参 考 文 献
1，Hamelmann W, Ozasa T, Cairns T et al. Xeno-transplantation of islet across a strong species barrier (rabbit to cynomolgus monkey). Tr ansplant Proc, 1994,26:1097
2，Platt J L, Fischel R J, Matas A J et al. Immunopathology of h ype racute xenograft rejection in a swine-to-primate model. Transplantation, 19 91,52:214
3，Eckstein V, Müler -Ruchholtz W, Ulrichs K. Reaction patterns o f natural xenophiles antibodies in human sera with pancreatic islet cells and p orcine lymphocyte. Transplant Proc, 1994,26:997
4，Cooper D K C. Is xenotransplantation a realistic clinical option ? Transplant proc, 1992,24:2393
5，胡远峰. 胰岛素依赖型糖尿病的早期防治. 中华内分泌代谢杂志，1997，13(1 )：67
(1998-11-18 收稿), http://www.100md.com