新生大鼠肺微血管壁周细胞的培养方法及其生长特性
作者：袁永辉 王林 车东媛 熊密
单位：同济医科大学基础医学院病理学教研室, 武汉 430030
关键词：周细胞；细胞；培养的；血管；肺
同济医科大学学报000302 摘要 用Ⅳ型胶原酶消化和微孔过滤法分离新生大鼠 肺微血管段的内皮细胞和周细胞,再用富含PDGF的选择性条件培养液刺激周细胞的生长和抑 制内皮细胞生长而建立了肺血管壁周细胞的培养方法。S180细胞条件培养液(SCCM)的灭活, 分离、纯化微血管段,静置及筛选周细胞是获得新生大鼠肺血管壁周细胞纯培养的关键。用 该方法培养的第5代周细胞,经相差显微镜和免疫细胞化学法检查,纯度达98%以上；细胞倍增 时间为54.3 h,且在12代以内,细胞形态结构特征保持稳定,适合做周细胞的体外实验研究。
中图法分类号 R322.3, R329.2
, 百拇医药
Culture Method for and Growth Characteri stics of Pulmonary
Microvascular Pericytes in Newborn Rats
Yuan Yonghui Wang Lin Che Dongyuan et al
(Department of Pathology, School of Basic Medical Scien ces, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract Endothelial cells and pericytes in microvascular segme nts were dissociated by type Ⅳ collagenase digestion and filtering through scre ens , then selective conditioned media rich in platelet-derive growth factor(PD GF) was used to stimulate the growth of pericytes and to inhibit the growth of e ndothelial cells. The culture method for pulmonary microvascular pericytes in ne wborn rats was established.The key points for obtaining pure culture of pericyte s were as follows: 1)inactivation of conditioned medium from mouse sarcoma 180 c ells (SCCM); 2) separating and purifying the microvascular segments; 3) keeping the culture dishes of the primary culture still in the first few days; and 4) s creening pericytes etc. Phase-contrast microscopic examination and immunocytoche mical staining tests showed that the purity of cultured pericytes at the 5th pas sage from this method was over 98 %; The doubling time for the cultured pericyte s was 54.3 h, and morphological charateristics of the cells at 5th to 12th passa ges were stable. The cultured pericytes from this method were applicable to expe rimental investigation in vitro.
, http://www.100md.com
Key words pericyte； cultured，cells; vessel; lung
肺微血管段(含无肌细动脉,毛细血管和毛细血管后静脉)的血管壁由内皮细胞和周细胞组成 。周细胞位于内皮细胞下,为一种幼稚的间叶细胞；周细胞与内皮细胞由共同的基底膜包被, 并且它们间有细胞连接存在。动物实验表明: 肺血管壁周细胞在微血管疾病[1]、 肺血管构型重建[2]和肿瘤的侵袭与转移等方面起重要作用。目前,国外有关肺血管 壁周细胞的培养方法报道较少。我室经过多年的摸索,参照Paul Davies[3]培养大 鼠肺血管周细胞的方法并加以改进,在国内首次建立了肺血管壁周细胞的培养方法,这对研究 周细胞的生物学特性,生理、病理状态下的改变以及细胞间的调控等方面提供了便利。兹将 新生大鼠肺微血管壁周细胞的培养方法及其生长特性报道如下。
1 材料与方法
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1.1 周细胞选择性条件培养液的制备
取S180细胞株(由中国科学院上海细胞生物学研究所提供)用含有100 ml/L新生牛血清( 美国生命公司产品)的 M199培养液(M199)进行培养。2～3 d传代1次。取传代后2～3 d的S18 0细胞悬浮液,1000 r/min 离心5 min,收集上清液,经直径为0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌, 56 ℃ 30 min灭活即得S180细胞条件培养液(SCCM)。-20 ℃保存备用。
周细胞选择性条件培养液(PCSCM): 含400 ml/L SCCM,100 ml/L胎牛血清(美国生命公司产品 ), 1.5 g/L谷氨酰胺,100 μg/ml硫酸链霉素钠,100 U/ml硫酸青霉素钠的M199培养液。
1.2 肺微血管段的分离和纯化
将新生1～2 d的SD大鼠(同济医科大学实验动物学部提供)用颈椎脱臼法处死后,在无菌条件 下,打开胸腔,取出心肺,放入无钙镁的D-Hank’s液中漂洗2次。在超净工作台上,分离、去 除心脏、肺膜及较大的支气管、血管及其分支。取末梢肺组织,剪碎,用2.0 g/L Ⅳ型胶原 酶消化液(用含5.0 ml/L新生牛血清的D-Hank’s液配制,pH7.2)37 ℃消化1 h。用80 目(孔径约216 μm)的不锈钢筛网进行初滤,去除较大的组织块;滤液经140目(孔径约110 μm )的不锈钢筛网进行第2次过滤,去除较大的血管及支气管分支;滤液再用220目(孔径约70 μm )的不锈钢筛网过滤,并用D-Hank’s液反复冲洗,以去除分散的细胞成分如成纤维细胞、血 细胞和上皮细胞等;最后,将220目不锈钢筛网倒放在无菌的培养皿中,用D-Hank’s液从反面 反复冲洗,收集溶液,1000 r/min 离心 5 min,弃上清液,即得长度为70～110 μm的微血管段 。
, 百拇医药
1.3 周细胞的培养
将分离出的肺微血管段用含100 ml/L胎牛血清的M199培养液悬浮,调其浓度为(2～5) ×104/ml,按5 ml/瓶分装于100 ml培养瓶内,置37 ℃ CO2培养箱内静置培养3 d,换 PCSCM液培养,每3 d换液1次。待细胞生长汇合后,用含1.0 g/L 胰蛋白酶、0.2 g/L EDTA 的混合液消化,在相差镜下观察,当70%～80%细胞收缩变圆时加入含血清的培养液终止反应。 1000 r/min 离心 5 min,用D-Hank’s液清洗,离心,加入PCSCM液10 ml分装于2个培养瓶内, 继续培养及传代。
1.4 周细胞的纯度检测
相差镜下，取第5代周细胞，随机选取多个视野，根据内皮细胞和周细胞的形态特点，按 白细胞分类计数法计算100个细胞中周细胞的数量。
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1.5 周细胞的倍增时间检测
将第5代周细胞等量接种于14个25 ml培养瓶中，每天取2瓶用酶消化、计数，计算平均 值，连续7 d。绘出周细胞的生长曲线，并根据Patterson[4]法计算细胞倍增时间 。
1.6 周细胞的鉴定
免疫细胞化学(SABC法)检查: 分别用抗α-SM-actin、抗CD34和抗S-100三种单克 隆抗体进行免疫细胞化学染色,检测培养的第5代周细胞相应抗原的表达。
透射电镜检查:将生长在盖玻片上的第5代周细胞制成单层细胞超薄切片[5],透射电 镜观察，照相。
2 结果
2.1 体外培养周细胞的特点
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相差镜下，原代培养的微血管段，第3 d可见两型细胞混同生长，即呈铺路石样、镶嵌排列 的内皮细胞和呈梭形、多突起、细胞体积较大的周细胞；约第6 d长满瓶底，细胞汇合。从 第1代至第4代，内皮细胞数量逐渐减少，周细胞数量明显增多，后者呈多层生长，无接触抑 制现象，常形成似围管状排列(图1)。至第5代以后，细胞趋于均一；相差镜观察和免疫细胞 化学染色法检测，随机分类计数,周细胞的纯度达98%以上；周细胞的倍增时间为54.3 h。 在第5代至12代以内,周细胞的形态结构特征基本保持稳定。
图1 培养的第5代周细胞呈多层生长，无接触抑制现象；细胞伸出伪足，相互连接，形成似 围管状排列 相差镜 ×125
透射电镜下，培养的第5代周细胞类型较一致；细胞表面有大量指状突起,胞浆内富含粗 面型、滑面型内质网，高尔基复合体和微丝(图2)；溶酶体较少，未见肌丝和致密斑，也未 见von Willebrand小体。
, 百拇医药
免疫细胞化学染色显示：培养的第5代周细胞α-SM-actin、CD34和 S-100三种抗 原均为阳性表达(图3～5)，而内皮细胞对抗S-100及抗α-SM-actin 单克隆抗体均呈阴 性反应。
2.2 周细胞培养的技术要点
下述各点是成功的关键：①SCCM 培养液必须经56 ℃ 30 min灭活，以除去培养过程中 因细胞死亡而释放到培养液中的毒性物质。②微血管段的分离与获取是关键一步，在每次过 滤后，必须反复冲洗，以保证微血管段的纯度和数量；在接种时，也必须保证其密度。③微 血管段培养开始时，必须绝对静置3 d，尽量避免培养瓶受到震动或移动，以防刚贴壁的微 血管段重新漂浮而死亡，影响成活率。④选择新生动物，既可避免污染，又有助于周细胞发 育；在动物品种方面，选择与人肺血管相似且肺血管周细胞较多的动物，如大鼠或狗等。
, 百拇医药
图2 培养的第5代周细胞内质网、高尔基 复合体、微丝均较丰富，细胞表面有大量指状突起 EM ×25 200
图3 培养的第5代周细胞α-SM-actin 阳性表达 ×200
图4 培养的第5代周细胞CD34阳性 表达 ×200
图5 培养的第5代周细胞S-100阳性表达 ×200
3 讨论
1987年,Paul Davies等[3]首先建立大鼠肺血管周细胞培养方法，但其后国内外有 关肺血管周细胞体外培养报道很少，主要原因可能在于肺组织细胞成分复杂，很难得到周细 胞的纯培养;其次是肺血管的微血管段周细胞数量较少；此外，肺是一个呼吸性器官，在进 行细胞培养时易污染等。本室经过多年摸索，采用Ⅳ型胶原酶消化及根据肺微血管段的直 径大小设计了三次微孔过滤法，收集处于70～110 μm 之间的微血管段，然后选用PCSCM培 养液刺激周细胞生长而抑制内皮细胞生长，在国内首次建立了肺血管壁周细胞培养方法 [6]。该方法培养的周细胞，经相差显微镜、透射电镜和免疫细胞化学法检测，均与国 外报道一致[3，7]。后经多次摸索、改进，现已达到成熟，稳定，可靠，成功率较 高。可作为肺血管壁周细胞生物学研究的一种模型。
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上述培养的第5～12代肺血管壁周细胞具有形态结构的稳定性，纯度在98%以上，故可大量提 供体外实验研究。为在细胞分子水平上探讨肺微血管疾病，肺血管构型重建，肿瘤的侵袭与 转移以及细胞间相互调控等细胞机制建立了体外培养方法。
国家自然科学基金资助项目(No.39570289)
袁永辉，男，1966年生，主管技师
参 考 文 献
1，Sims D E.Recent advances in pericyte biology implications for health and disease. Can J Cardiol, 1991,7:431
2，吴永平, 车东媛,李文英. 周细胞在大鼠肺动脉高压时肺血管构型改建中的作 用. 同济医科大学学报,1994,23(5):353
, 百拇医药
3，Davies P, Smith B T，Maddalo F B et al. Characteristics of lu ng per icyte in culture in inducing their growth inhibition by endothelial substrate. M icrovasc Res，1987, 33:300
4，Pattterson M K Jr. Measurement of growth and viability of cells in c ulture.In: Jackoby WB ed. Methods in Enzymology.Vol.58.London: Academic Press In c, 1979. 141～152
5，袁永辉,车东媛.猪肺动脉壁细胞培养方法在肺血管构型重建机制研究中的应用 . 同济医科大学学报， 1995,24(6):408
6， 张 燕,熊 密,车东媛等.大鼠肺血管周细胞培养方法的建立及鉴定.中国学术 期刊文摘(科技快报)，1998,4(2):209
7，Smith D E. The pericyte-A review. Tissue cell,1986,18:153
(1999-11-17 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学基础医学院病理学教研室, 武汉 430030
关键词：周细胞；细胞；培养的；血管；肺
同济医科大学学报000302 摘要 用Ⅳ型胶原酶消化和微孔过滤法分离新生大鼠 肺微血管段的内皮细胞和周细胞,再用富含PDGF的选择性条件培养液刺激周细胞的生长和抑 制内皮细胞生长而建立了肺血管壁周细胞的培养方法。S180细胞条件培养液(SCCM)的灭活, 分离、纯化微血管段,静置及筛选周细胞是获得新生大鼠肺血管壁周细胞纯培养的关键。用 该方法培养的第5代周细胞,经相差显微镜和免疫细胞化学法检查,纯度达98%以上；细胞倍增 时间为54.3 h,且在12代以内,细胞形态结构特征保持稳定,适合做周细胞的体外实验研究。
中图法分类号 R322.3, R329.2
, 百拇医药
Culture Method for and Growth Characteri stics of Pulmonary
Microvascular Pericytes in Newborn Rats
Yuan Yonghui Wang Lin Che Dongyuan et al
(Department of Pathology, School of Basic Medical Scien ces, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract Endothelial cells and pericytes in microvascular segme nts were dissociated by type Ⅳ collagenase digestion and filtering through scre ens , then selective conditioned media rich in platelet-derive growth factor(PD GF) was used to stimulate the growth of pericytes and to inhibit the growth of e ndothelial cells. The culture method for pulmonary microvascular pericytes in ne wborn rats was established.The key points for obtaining pure culture of pericyte s were as follows: 1)inactivation of conditioned medium from mouse sarcoma 180 c ells (SCCM); 2) separating and purifying the microvascular segments; 3) keeping the culture dishes of the primary culture still in the first few days; and 4) s creening pericytes etc. Phase-contrast microscopic examination and immunocytoche mical staining tests showed that the purity of cultured pericytes at the 5th pas sage from this method was over 98 %; The doubling time for the cultured pericyte s was 54.3 h, and morphological charateristics of the cells at 5th to 12th passa ges were stable. The cultured pericytes from this method were applicable to expe rimental investigation in vitro.
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Key words pericyte； cultured，cells; vessel; lung
肺微血管段(含无肌细动脉,毛细血管和毛细血管后静脉)的血管壁由内皮细胞和周细胞组成 。周细胞位于内皮细胞下,为一种幼稚的间叶细胞；周细胞与内皮细胞由共同的基底膜包被, 并且它们间有细胞连接存在。动物实验表明: 肺血管壁周细胞在微血管疾病[1]、 肺血管构型重建[2]和肿瘤的侵袭与转移等方面起重要作用。目前,国外有关肺血管 壁周细胞的培养方法报道较少。我室经过多年的摸索,参照Paul Davies[3]培养大 鼠肺血管周细胞的方法并加以改进,在国内首次建立了肺血管壁周细胞的培养方法,这对研究 周细胞的生物学特性,生理、病理状态下的改变以及细胞间的调控等方面提供了便利。兹将 新生大鼠肺微血管壁周细胞的培养方法及其生长特性报道如下。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 周细胞选择性条件培养液的制备
取S180细胞株(由中国科学院上海细胞生物学研究所提供)用含有100 ml/L新生牛血清( 美国生命公司产品)的 M199培养液(M199)进行培养。2～3 d传代1次。取传代后2～3 d的S18 0细胞悬浮液,1000 r/min 离心5 min,收集上清液,经直径为0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌, 56 ℃ 30 min灭活即得S180细胞条件培养液(SCCM)。-20 ℃保存备用。
周细胞选择性条件培养液(PCSCM): 含400 ml/L SCCM,100 ml/L胎牛血清(美国生命公司产品 ), 1.5 g/L谷氨酰胺,100 μg/ml硫酸链霉素钠,100 U/ml硫酸青霉素钠的M199培养液。
1.2 肺微血管段的分离和纯化
将新生1～2 d的SD大鼠(同济医科大学实验动物学部提供)用颈椎脱臼法处死后,在无菌条件 下,打开胸腔,取出心肺,放入无钙镁的D-Hank’s液中漂洗2次。在超净工作台上,分离、去 除心脏、肺膜及较大的支气管、血管及其分支。取末梢肺组织,剪碎,用2.0 g/L Ⅳ型胶原 酶消化液(用含5.0 ml/L新生牛血清的D-Hank’s液配制,pH7.2)37 ℃消化1 h。用80 目(孔径约216 μm)的不锈钢筛网进行初滤,去除较大的组织块;滤液经140目(孔径约110 μm )的不锈钢筛网进行第2次过滤,去除较大的血管及支气管分支;滤液再用220目(孔径约70 μm )的不锈钢筛网过滤,并用D-Hank’s液反复冲洗,以去除分散的细胞成分如成纤维细胞、血 细胞和上皮细胞等;最后,将220目不锈钢筛网倒放在无菌的培养皿中,用D-Hank’s液从反面 反复冲洗,收集溶液,1000 r/min 离心 5 min,弃上清液,即得长度为70～110 μm的微血管段 。
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1.3 周细胞的培养
将分离出的肺微血管段用含100 ml/L胎牛血清的M199培养液悬浮,调其浓度为(2～5) ×104/ml,按5 ml/瓶分装于100 ml培养瓶内,置37 ℃ CO2培养箱内静置培养3 d,换 PCSCM液培养,每3 d换液1次。待细胞生长汇合后,用含1.0 g/L 胰蛋白酶、0.2 g/L EDTA 的混合液消化,在相差镜下观察,当70%～80%细胞收缩变圆时加入含血清的培养液终止反应。 1000 r/min 离心 5 min,用D-Hank’s液清洗,离心,加入PCSCM液10 ml分装于2个培养瓶内, 继续培养及传代。
1.4 周细胞的纯度检测
相差镜下，取第5代周细胞，随机选取多个视野，根据内皮细胞和周细胞的形态特点，按 白细胞分类计数法计算100个细胞中周细胞的数量。
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1.5 周细胞的倍增时间检测
将第5代周细胞等量接种于14个25 ml培养瓶中，每天取2瓶用酶消化、计数，计算平均 值，连续7 d。绘出周细胞的生长曲线，并根据Patterson[4]法计算细胞倍增时间 。
1.6 周细胞的鉴定
免疫细胞化学(SABC法)检查: 分别用抗α-SM-actin、抗CD34和抗S-100三种单克 隆抗体进行免疫细胞化学染色,检测培养的第5代周细胞相应抗原的表达。
透射电镜检查:将生长在盖玻片上的第5代周细胞制成单层细胞超薄切片[5],透射电 镜观察，照相。
2 结果
2.1 体外培养周细胞的特点
, http://www.100md.com
相差镜下，原代培养的微血管段，第3 d可见两型细胞混同生长，即呈铺路石样、镶嵌排列 的内皮细胞和呈梭形、多突起、细胞体积较大的周细胞；约第6 d长满瓶底，细胞汇合。从 第1代至第4代，内皮细胞数量逐渐减少，周细胞数量明显增多，后者呈多层生长，无接触抑 制现象，常形成似围管状排列(图1)。至第5代以后，细胞趋于均一；相差镜观察和免疫细胞 化学染色法检测，随机分类计数,周细胞的纯度达98%以上；周细胞的倍增时间为54.3 h。 在第5代至12代以内,周细胞的形态结构特征基本保持稳定。
图1 培养的第5代周细胞呈多层生长，无接触抑制现象；细胞伸出伪足，相互连接，形成似 围管状排列 相差镜 ×125
透射电镜下，培养的第5代周细胞类型较一致；细胞表面有大量指状突起,胞浆内富含粗 面型、滑面型内质网，高尔基复合体和微丝(图2)；溶酶体较少，未见肌丝和致密斑，也未 见von Willebrand小体。
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免疫细胞化学染色显示：培养的第5代周细胞α-SM-actin、CD34和 S-100三种抗 原均为阳性表达(图3～5)，而内皮细胞对抗S-100及抗α-SM-actin 单克隆抗体均呈阴 性反应。
2.2 周细胞培养的技术要点
下述各点是成功的关键：①SCCM 培养液必须经56 ℃ 30 min灭活，以除去培养过程中 因细胞死亡而释放到培养液中的毒性物质。②微血管段的分离与获取是关键一步，在每次过 滤后，必须反复冲洗，以保证微血管段的纯度和数量；在接种时，也必须保证其密度。③微 血管段培养开始时，必须绝对静置3 d，尽量避免培养瓶受到震动或移动，以防刚贴壁的微 血管段重新漂浮而死亡，影响成活率。④选择新生动物，既可避免污染，又有助于周细胞发 育；在动物品种方面，选择与人肺血管相似且肺血管周细胞较多的动物，如大鼠或狗等。
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图2 培养的第5代周细胞内质网、高尔基 复合体、微丝均较丰富，细胞表面有大量指状突起 EM ×25 200
图3 培养的第5代周细胞α-SM-actin 阳性表达 ×200
图4 培养的第5代周细胞CD34阳性 表达 ×200
图5 培养的第5代周细胞S-100阳性表达 ×200
3 讨论
1987年,Paul Davies等[3]首先建立大鼠肺血管周细胞培养方法，但其后国内外有 关肺血管周细胞体外培养报道很少，主要原因可能在于肺组织细胞成分复杂，很难得到周细 胞的纯培养;其次是肺血管的微血管段周细胞数量较少；此外，肺是一个呼吸性器官，在进 行细胞培养时易污染等。本室经过多年摸索，采用Ⅳ型胶原酶消化及根据肺微血管段的直 径大小设计了三次微孔过滤法，收集处于70～110 μm 之间的微血管段，然后选用PCSCM培 养液刺激周细胞生长而抑制内皮细胞生长，在国内首次建立了肺血管壁周细胞培养方法 [6]。该方法培养的周细胞，经相差显微镜、透射电镜和免疫细胞化学法检测，均与国 外报道一致[3，7]。后经多次摸索、改进，现已达到成熟，稳定，可靠，成功率较 高。可作为肺血管壁周细胞生物学研究的一种模型。
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上述培养的第5～12代肺血管壁周细胞具有形态结构的稳定性，纯度在98%以上，故可大量提 供体外实验研究。为在细胞分子水平上探讨肺微血管疾病，肺血管构型重建，肿瘤的侵袭与 转移以及细胞间相互调控等细胞机制建立了体外培养方法。
国家自然科学基金资助项目(No.39570289)
袁永辉，男，1966年生，主管技师
参 考 文 献
1，Sims D E.Recent advances in pericyte biology implications for health and disease. Can J Cardiol, 1991,7:431
2，吴永平, 车东媛,李文英. 周细胞在大鼠肺动脉高压时肺血管构型改建中的作 用. 同济医科大学学报,1994,23(5):353
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3，Davies P, Smith B T，Maddalo F B et al. Characteristics of lu ng per icyte in culture in inducing their growth inhibition by endothelial substrate. M icrovasc Res，1987, 33:300
4，Pattterson M K Jr. Measurement of growth and viability of cells in c ulture.In: Jackoby WB ed. Methods in Enzymology.Vol.58.London: Academic Press In c, 1979. 141～152
5，袁永辉,车东媛.猪肺动脉壁细胞培养方法在肺血管构型重建机制研究中的应用 . 同济医科大学学报， 1995,24(6):408
6， 张 燕,熊 密,车东媛等.大鼠肺血管周细胞培养方法的建立及鉴定.中国学术 期刊文摘(科技快报)，1998,4(2):209
7，Smith D E. The pericyte-A review. Tissue cell,1986,18:153
(1999-11-17 收稿), 百拇医药