D-聚甘酯对原代培养胎大鼠皮层神经元细胞外液NO的影响
作者：宋晓梅 刘栋 管华诗
单位：宋晓梅(青岛市立医院药剂科，青岛 266011)；刘栋 管华诗(青岛海洋大学药物与食 品研究所，青岛 266003)
关键词：D-聚甘酯，皮层神经元，NO，脑缺血
中国海洋药物000305 摘要 体外培养胎大鼠皮层神经元，利用低糖低氧环境造成脑缺血模型，观察了D-聚甘酯对低糖低氧所致NO释放的影响。结果表明D-聚甘酯5，25，50mg.L-1不能抑制低糖低氧所导致的NO释放的增多。提示D-聚甘酯可能以非NO途径发挥其脑缺血保护作用。
EFFECTS OF D-MANNORONICATE ON EXTRACELLULAR NO LEVEL IN PRIMARY CULTURED RAT CORTICAL NEURONS
, 百拇医药
Song Xiaomei
(Department of Pharmacy of Qingdao Municipal Hospital,Qingdao 266011)
Liu Dong
(Department of Pharmacy of Qingdao Municipal Hospital,Qingdao 266011)
Guan Huashi
(Department of Pharmacy of Qingdao Municipal Hospital,Qingdao 266011)
ABSTRACT The effects of D-Mannuronicate on extracellular nitric oxide(NO)levels were investigated in primary cultured rat cortical neuronal cells.NO was measured by using spectrometry. The results showed that D-Mannuronicate 5、25、50mg.L-1could not inhibit the elevation of NO in prmary cultured neurons that were exposed for 8h to hypoxic and hypoglycemic situation,suggesting that D-Mannuronicate dont exert neuroprotective effects by influencing the production of NO after ischemic damage.
, 百拇医药
KEY WORDS D-Mannuronicate primary cortical neurons,NO,brain ischemia
近年来，NO作为非经典的神经递质、细胞功能调节因子或信使，其在神经系统正常功能和疾病中，特别是在脑缺血中的作用日益受到重视[1]。NO参与调节外周及脑血管的舒缩活动，因而在脑血流的调节中起着十分重要的作用。大脑皮质、海马和纹状体注入谷氨酸或NMDA引起的神经元损伤可被一氧化氮合酶(NOS)抑制剂所减轻，表明脑缺血所致的NMDA的神经毒作用是由NO介导[2]。脑缺血后，细胞内Ca2+浓度升高可导致神经毒作用，此作用可被NO前体L-精氨酸(L-Arg)或NOS抑制剂L-NNA所阻断，提示Ca2+是脑缺血损伤中的起始信使，最终是NO导致神经元的死亡[3]。但NO又具有增加脑血流、扩张血管和抗血小板聚集的作用，因此NO又可对脑缺血引起的损伤起一定的保护作用[4]。所以NO在脑缺血的病理机制中具有双重作用。
, http://www.100md.com
D-聚甘酯是从褐藻中得到的一种低分子量、低抗凝硫酸糖胺聚糖类化合物，是经青岛海洋大学海洋药物与食品研究所在藻酸双酯钠(propylene glycol alginate sodium sulfate,PSS)的基础上经过结构改造而成的。D-聚甘酯属酸性多糖，其相对分子质量为4000左右。我所初步药理学实验证实，D-聚甘酯具有抗脑缺血的作用，但其确切的机理尚不清楚。有资料表明D-聚甘酯的类似物肝素可以影响NO的产生，从而影响血管的反应节律和血流量，起到预防和治疗动脉粥样硬化的作用[5，6]。为了进一步阐明D-聚甘酯抗脑缺血的作用机制是否与NO有关，我们利用分光光度法研究了D-聚甘酯对原代培养的胎大鼠皮层神经细胞外液NO水平的影响。
1 材料
1.1仪器 752紫外可见分光光度计，上海分析仪器厂；倒置显微镜，Olympus;24孔培养板，Costar。
1.2 动物 清洁级Wistar孕鼠，孕期13～15d，北京医科大学实验动物中心提供。
, http://www.100md.com
1.3 药品与试剂 D-聚甘酯(D-Mannuronicate)，由青岛海洋大学海洋药物与食品研究所提供。DMEM培养基，DMEM低糖培养基，GIBCO；多聚赖氨酸，Sigma;对氨基苯磺酰胺(sulfanilamide);N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐(N-(1-naphthyl)-ethlenediamine dihydrochloride),北京化学试剂公司。其余试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 胎大鼠皮层神经元原代培养[7] 用10%的水合氯醛麻醉(400mg.kg-1，ip)将孕鼠麻醉，75%乙醇消毒胸腹部，于超净台内取出胎鼠，用虹膜剪剪开头部皮肤和颅骨，取脑皮层置于DMEM培养液中，(含青霉素G100μ.mL-1链霉素100μg.mL-1，10%胎牛血清，10%马血清)，用尖头吸管轻轻吹打分散成细胞悬液，细胞悬液经200目金属细胞筛过滤，调整细胞浓度为1×107cell.mL-1，接种于预先用0.01%多聚赖氨酸覆盖过的24孔培养板，每孔1mL，置5%CO2孵箱中孵育。培养细胞每隔3d换1次新鲜的含血清DMEM培养液，细胞培养至9d，换以含D-聚甘酯的低糖低血清DMEM(含葡萄糖1g.L-1，5%胎牛血清，5%马血清)，同时以封口膜密封培养板中止供氧以造成低糖低氧环境，孵育8h后换以正常的培养液并恢复供氧以模拟动物的缺血再灌注状态，4h后测定细胞外液的NO，文献[14]表明缺糖、缺氧8h再恢复4h后NO的量增加较多。
, http://www.100md.com
2.2 NO的测定 参照文献[8]，按下述方法测定。
2.2.1 Greiss试剂的配制:1%对氨基苯磺酰胺，以5%磷酸配制。0.1%N-(1-萘基)乙二胺，以双蒸水配制。将上述两种试剂等量混匀即得到试剂。
2.2.2 NO2标准曲线的制作 分别取0，1，2，4，8，10，12nmol.L-1的NaNO2标准液1ml，加入Greiss试剂1ml后室温作用10min,于λ＝545nm处测吸收毒A值，制作标准曲线，求得回归方程。
2.2.3 细胞外液NO-2含量的测定 取细胞外液1ml与等量的Greiss试剂室温作用10min，于波长545nm处测A值，通过标准曲线求得NO-2的含量。通过测定NO-2的量来反应的NO含量。
, 百拇医药
3 结果
3.1 NO-2标准曲线 见下表 NaNO2(nmol.L-1)
0
1
2
4
8
10
12
A545nm
0
, 百拇医药
0.01
0.018
0.037
0.076
0.096
0.119
表NO-2含量的标准曲线
回归方程：Y＝0.0098X-0.0012，回归系数：r=0.9994
3.2 D-聚甘酯对原代培养的胎大鼠皮层神经细胞释放NO的影响 结果如图所示。低糖低氧环境孵育8h后再换以正常的培养液4h并恢复供氧以模拟动物的缺血再灌注状态，可导致细胞外液的NO的释放显著性的高于正常对照组。D-聚甘酯5，25，50mg.L-1均不能抑制低糖低氧所导致的NO释放的增多。
, http://www.100md.com
表D-聚甘酯对缺氧缺糖所致的皮层神经元NO释放的影响
* * P<0.01vs对照组(n=8,
±s)
4 讨论
实验结果表明低糖低氧环境可使皮层神经元NO的释放增多。D-聚甘酯5，25，50mg.L-1不能抑制低糖低氧所导致的NO释放的增多。其原因可能为D-聚甘酯不能抑制谷氨酸所致的Ca2+内流，进而不能阻止Ca2+-CaM直接调节的NOS的活化，从而不能抑制低糖低氧所导致的NO释放的增多。此结果和以前所作D-聚甘酯对新生大鼠脑细胞内游离钙离子浓度的影响的实验结果相吻合，即：D-聚甘酯对电压依赖性的Ca2+通道(voltage-dependent calcium channel,VDCC)有作用，而对受体操纵性的Ca2+通道(receptor-operated calcium channel,ROCC)无作用。
, 百拇医药
NO是以L-Arg为前体，在NOS和O2参与下合成的[9]。NOS有三种异构形式(isoforms):nNOS、eNOS和iNOS所引起，在脑缺血前期即脑缺血发生1h内，NO的升高主要是由于nNOS和eNOS所引起，在脑缺血后期即脑缺血发生1h后，NO的产生主要是因为诱导型NOS(iNOS)大量被诱导所引起的[10]。在临床上，于脑缺血后期多次重复应用iNOS的选择性抑制剂如氨基胍已取得了比较显著的治疗效果[11]。我们的实验结果表明D-聚甘酯可能不具有抑制iNOS的作用，但其对nNOS和eNOS是否有作用尚需实验证明。有资料表明[12，13]，NOS-NO-GC-cGMP轴是NO发挥其生理及病理作用的一条重要途径：当NOS激活后，催化L-Arg产生NO，NO作用于可溶性鸟苷酸环化酶(GC-S)的血红素并使其激活，生成cGMP，后者通过作用于cGMP依赖性蛋白激酶及其底物而发挥一系列生理效应。D-聚甘酯虽然不能抑制NO的产生，但其是否影响cGMP的产生，进而最终影响NO的生理效应，尚待深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Burnett AL,Lowenstein CJ,Bredt DS,Chang TS,Snyder SH.Nitric oxide:a physiologic mediator of penile erection,Science，1992，257:401
2，Fujisawa H,Dawson D,Browne SE,et al.Pharmacological modification of glutamate neurotoxicity in vivo.Brain Res,1993,629:73
3，Buisson A,Plotkine M,Boulu RG.The neuroprotective effect of a nitric oxiole inhibitor in a rat model of focal cerebral ischemia,Br J Pharmacol ,1992,106:766
, 百拇医药
4，Morikawa E,Moskowitz M,Huang Z et al.L-Arginine infusion promotes nitric oxide-dependent vasodilation,increase regional cerebral blood flow,and reduces infarction in rat.Stroke，1994，25:429
5，Light JR,J.T.Bellan,J-A,Roberts MP,Force SD,Chen,Li,Kerstein MD, Kadowita PJ,McNamara DB.Heparin treatment enhances the recovery of neoendothelial acetycholine-induced vascular relaxation after balloon catheter injury in the rat aorta.Circulation，1993，88(suppl.11):413
, http://www.100md.com
6，Yokokawa K,Takara H,Kohno M,Mandal AK,Yamagisawa M,Takeda T. Heparin regulates endothelin prodction through endothelial-induced nitric oxide in human endothelial cells.J Clin Invest，1993，92:2080
7，Dawson VL,Dawson TM,London ED,et al.Nitric oxide mediates glutamate neurotoxicity in primary cortical cultures.Proc Natl Acad Sci USA， 1991，88:6368
8，Green LC,Wagner DA,Gologowki J.Analysis of nitrate ,nitrite and [15N]nitrate in biological fluids.Anal Biochem 1982，126:131
, http://www.100md.com
9，Yun H-Y,Dawson VL,Dawson TM.Neurobiology of nitric oxide.Crit Rev Neurobiol, 1996，10:291
10，Iadecola C,Xu X,Zhang FY,et al.Marked induction of calicum-imdependent nitric oxide synthase activity after local cerebral ischemia.J Cereb Blood Flow Metab， 1995，15:52
11，Zhang J,Benveniste H,Klitzman B,et al. Nitric oxide sythase inhibation and extracellular glutamate concentration after cerebral ischemia/reperfusion.Stroke，1995，26:298
, http://www.100md.com
12，Stone JR,Sands RH,Dunham WR,Marletta MA.Electron paramagnetic resonance spectral evidence for the formation of a pentacoordinate nitrosyl-heme complex on soluble guanylate cyclase.Biochem Biophys Res Commun，1995，207:572
13，Schmidt HW,Lohmann SM,Walter U.The nitric oxide and cGMP signal transduction system;regulation and mechanism of action.Biochim Biophys Acta，1993，1178:153, http://www.100md.com
单位：宋晓梅(青岛市立医院药剂科，青岛 266011)；刘栋 管华诗(青岛海洋大学药物与食 品研究所，青岛 266003)
关键词：D-聚甘酯，皮层神经元，NO，脑缺血
中国海洋药物000305 摘要 体外培养胎大鼠皮层神经元，利用低糖低氧环境造成脑缺血模型，观察了D-聚甘酯对低糖低氧所致NO释放的影响。结果表明D-聚甘酯5，25，50mg.L-1不能抑制低糖低氧所导致的NO释放的增多。提示D-聚甘酯可能以非NO途径发挥其脑缺血保护作用。
EFFECTS OF D-MANNORONICATE ON EXTRACELLULAR NO LEVEL IN PRIMARY CULTURED RAT CORTICAL NEURONS
, 百拇医药
Song Xiaomei
(Department of Pharmacy of Qingdao Municipal Hospital,Qingdao 266011)
Liu Dong
(Department of Pharmacy of Qingdao Municipal Hospital,Qingdao 266011)
Guan Huashi
(Department of Pharmacy of Qingdao Municipal Hospital,Qingdao 266011)
ABSTRACT The effects of D-Mannuronicate on extracellular nitric oxide(NO)levels were investigated in primary cultured rat cortical neuronal cells.NO was measured by using spectrometry. The results showed that D-Mannuronicate 5、25、50mg.L-1could not inhibit the elevation of NO in prmary cultured neurons that were exposed for 8h to hypoxic and hypoglycemic situation,suggesting that D-Mannuronicate dont exert neuroprotective effects by influencing the production of NO after ischemic damage.
, 百拇医药
KEY WORDS D-Mannuronicate primary cortical neurons,NO,brain ischemia
近年来，NO作为非经典的神经递质、细胞功能调节因子或信使，其在神经系统正常功能和疾病中，特别是在脑缺血中的作用日益受到重视[1]。NO参与调节外周及脑血管的舒缩活动，因而在脑血流的调节中起着十分重要的作用。大脑皮质、海马和纹状体注入谷氨酸或NMDA引起的神经元损伤可被一氧化氮合酶(NOS)抑制剂所减轻，表明脑缺血所致的NMDA的神经毒作用是由NO介导[2]。脑缺血后，细胞内Ca2+浓度升高可导致神经毒作用，此作用可被NO前体L-精氨酸(L-Arg)或NOS抑制剂L-NNA所阻断，提示Ca2+是脑缺血损伤中的起始信使，最终是NO导致神经元的死亡[3]。但NO又具有增加脑血流、扩张血管和抗血小板聚集的作用，因此NO又可对脑缺血引起的损伤起一定的保护作用[4]。所以NO在脑缺血的病理机制中具有双重作用。
, http://www.100md.com
D-聚甘酯是从褐藻中得到的一种低分子量、低抗凝硫酸糖胺聚糖类化合物，是经青岛海洋大学海洋药物与食品研究所在藻酸双酯钠(propylene glycol alginate sodium sulfate,PSS)的基础上经过结构改造而成的。D-聚甘酯属酸性多糖，其相对分子质量为4000左右。我所初步药理学实验证实，D-聚甘酯具有抗脑缺血的作用，但其确切的机理尚不清楚。有资料表明D-聚甘酯的类似物肝素可以影响NO的产生，从而影响血管的反应节律和血流量，起到预防和治疗动脉粥样硬化的作用[5，6]。为了进一步阐明D-聚甘酯抗脑缺血的作用机制是否与NO有关，我们利用分光光度法研究了D-聚甘酯对原代培养的胎大鼠皮层神经细胞外液NO水平的影响。
1 材料
1.1仪器 752紫外可见分光光度计，上海分析仪器厂；倒置显微镜，Olympus;24孔培养板，Costar。
1.2 动物 清洁级Wistar孕鼠，孕期13～15d，北京医科大学实验动物中心提供。
, http://www.100md.com
1.3 药品与试剂 D-聚甘酯(D-Mannuronicate)，由青岛海洋大学海洋药物与食品研究所提供。DMEM培养基，DMEM低糖培养基，GIBCO；多聚赖氨酸，Sigma;对氨基苯磺酰胺(sulfanilamide);N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐(N-(1-naphthyl)-ethlenediamine dihydrochloride),北京化学试剂公司。其余试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 胎大鼠皮层神经元原代培养[7] 用10%的水合氯醛麻醉(400mg.kg-1，ip)将孕鼠麻醉，75%乙醇消毒胸腹部，于超净台内取出胎鼠，用虹膜剪剪开头部皮肤和颅骨，取脑皮层置于DMEM培养液中，(含青霉素G100μ.mL-1链霉素100μg.mL-1，10%胎牛血清，10%马血清)，用尖头吸管轻轻吹打分散成细胞悬液，细胞悬液经200目金属细胞筛过滤，调整细胞浓度为1×107cell.mL-1，接种于预先用0.01%多聚赖氨酸覆盖过的24孔培养板，每孔1mL，置5%CO2孵箱中孵育。培养细胞每隔3d换1次新鲜的含血清DMEM培养液，细胞培养至9d，换以含D-聚甘酯的低糖低血清DMEM(含葡萄糖1g.L-1，5%胎牛血清，5%马血清)，同时以封口膜密封培养板中止供氧以造成低糖低氧环境，孵育8h后换以正常的培养液并恢复供氧以模拟动物的缺血再灌注状态，4h后测定细胞外液的NO，文献[14]表明缺糖、缺氧8h再恢复4h后NO的量增加较多。
, http://www.100md.com
2.2 NO的测定 参照文献[8]，按下述方法测定。
2.2.1 Greiss试剂的配制:1%对氨基苯磺酰胺，以5%磷酸配制。0.1%N-(1-萘基)乙二胺，以双蒸水配制。将上述两种试剂等量混匀即得到试剂。
2.2.2 NO2标准曲线的制作 分别取0，1，2，4，8，10，12nmol.L-1的NaNO2标准液1ml，加入Greiss试剂1ml后室温作用10min,于λ＝545nm处测吸收毒A值，制作标准曲线，求得回归方程。
2.2.3 细胞外液NO-2含量的测定 取细胞外液1ml与等量的Greiss试剂室温作用10min，于波长545nm处测A值，通过标准曲线求得NO-2的含量。通过测定NO-2的量来反应的NO含量。
, 百拇医药
3 结果
3.1 NO-2标准曲线 见下表 NaNO2(nmol.L-1)
0
1
2
4
8
10
12
A545nm
0
, 百拇医药
0.01
0.018
0.037
0.076
0.096
0.119
表NO-2含量的标准曲线
回归方程：Y＝0.0098X-0.0012，回归系数：r=0.9994
3.2 D-聚甘酯对原代培养的胎大鼠皮层神经细胞释放NO的影响 结果如图所示。低糖低氧环境孵育8h后再换以正常的培养液4h并恢复供氧以模拟动物的缺血再灌注状态，可导致细胞外液的NO的释放显著性的高于正常对照组。D-聚甘酯5，25，50mg.L-1均不能抑制低糖低氧所导致的NO释放的增多。
, http://www.100md.com
表D-聚甘酯对缺氧缺糖所致的皮层神经元NO释放的影响
* * P<0.01vs对照组(n=8,
±s)4 讨论
实验结果表明低糖低氧环境可使皮层神经元NO的释放增多。D-聚甘酯5，25，50mg.L-1不能抑制低糖低氧所导致的NO释放的增多。其原因可能为D-聚甘酯不能抑制谷氨酸所致的Ca2+内流，进而不能阻止Ca2+-CaM直接调节的NOS的活化，从而不能抑制低糖低氧所导致的NO释放的增多。此结果和以前所作D-聚甘酯对新生大鼠脑细胞内游离钙离子浓度的影响的实验结果相吻合，即：D-聚甘酯对电压依赖性的Ca2+通道(voltage-dependent calcium channel,VDCC)有作用，而对受体操纵性的Ca2+通道(receptor-operated calcium channel,ROCC)无作用。
, 百拇医药
NO是以L-Arg为前体，在NOS和O2参与下合成的[9]。NOS有三种异构形式(isoforms):nNOS、eNOS和iNOS所引起，在脑缺血前期即脑缺血发生1h内，NO的升高主要是由于nNOS和eNOS所引起，在脑缺血后期即脑缺血发生1h后，NO的产生主要是因为诱导型NOS(iNOS)大量被诱导所引起的[10]。在临床上，于脑缺血后期多次重复应用iNOS的选择性抑制剂如氨基胍已取得了比较显著的治疗效果[11]。我们的实验结果表明D-聚甘酯可能不具有抑制iNOS的作用，但其对nNOS和eNOS是否有作用尚需实验证明。有资料表明[12，13]，NOS-NO-GC-cGMP轴是NO发挥其生理及病理作用的一条重要途径：当NOS激活后，催化L-Arg产生NO，NO作用于可溶性鸟苷酸环化酶(GC-S)的血红素并使其激活，生成cGMP，后者通过作用于cGMP依赖性蛋白激酶及其底物而发挥一系列生理效应。D-聚甘酯虽然不能抑制NO的产生，但其是否影响cGMP的产生，进而最终影响NO的生理效应，尚待深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1，Burnett AL,Lowenstein CJ,Bredt DS,Chang TS,Snyder SH.Nitric oxide:a physiologic mediator of penile erection,Science，1992，257:401
2，Fujisawa H,Dawson D,Browne SE,et al.Pharmacological modification of glutamate neurotoxicity in vivo.Brain Res,1993,629:73
3，Buisson A,Plotkine M,Boulu RG.The neuroprotective effect of a nitric oxiole inhibitor in a rat model of focal cerebral ischemia,Br J Pharmacol ,1992,106:766
, 百拇医药
4，Morikawa E,Moskowitz M,Huang Z et al.L-Arginine infusion promotes nitric oxide-dependent vasodilation,increase regional cerebral blood flow,and reduces infarction in rat.Stroke，1994，25:429
5，Light JR,J.T.Bellan,J-A,Roberts MP,Force SD,Chen,Li,Kerstein MD, Kadowita PJ,McNamara DB.Heparin treatment enhances the recovery of neoendothelial acetycholine-induced vascular relaxation after balloon catheter injury in the rat aorta.Circulation，1993，88(suppl.11):413
, http://www.100md.com
6，Yokokawa K,Takara H,Kohno M,Mandal AK,Yamagisawa M,Takeda T. Heparin regulates endothelin prodction through endothelial-induced nitric oxide in human endothelial cells.J Clin Invest，1993，92:2080
7，Dawson VL,Dawson TM,London ED,et al.Nitric oxide mediates glutamate neurotoxicity in primary cortical cultures.Proc Natl Acad Sci USA， 1991，88:6368
8，Green LC,Wagner DA,Gologowki J.Analysis of nitrate ,nitrite and [15N]nitrate in biological fluids.Anal Biochem 1982，126:131
, http://www.100md.com
9，Yun H-Y,Dawson VL,Dawson TM.Neurobiology of nitric oxide.Crit Rev Neurobiol, 1996，10:291
10，Iadecola C,Xu X,Zhang FY,et al.Marked induction of calicum-imdependent nitric oxide synthase activity after local cerebral ischemia.J Cereb Blood Flow Metab， 1995，15:52
11，Zhang J,Benveniste H,Klitzman B,et al. Nitric oxide sythase inhibation and extracellular glutamate concentration after cerebral ischemia/reperfusion.Stroke，1995，26:298
, http://www.100md.com
12，Stone JR,Sands RH,Dunham WR,Marletta MA.Electron paramagnetic resonance spectral evidence for the formation of a pentacoordinate nitrosyl-heme complex on soluble guanylate cyclase.Biochem Biophys Res Commun，1995，207:572
13，Schmidt HW,Lohmann SM,Walter U.The nitric oxide and cGMP signal transduction system;regulation and mechanism of action.Biochim Biophys Acta，1993，1178:153, http://www.100md.com