化学发光法检测金丝桃对DNA损伤的保护作用
作者：项光亚 周宜开
单位：同济医科大学环境医学研究所，武汉 430030
关键词：金丝桃；DNA损伤；化学发光；羟基自由基
同济医科大学学报000307 摘要 以CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA体系导致的DNA损伤发光为基础，检测了金丝桃不同 部位提取物对.OH自由基引起的DNA损伤的保护作用。结果表明：金丝桃提取物能明显抑制 和延迟DNA损伤的化学发光，而且这种抑制作用呈现剂量-效应关系，同时观察到其抑制作 用与提取物极性有关。
中图法分类号 R394.3
Measurement of the Protective Effect of Hypericum Chinense
, 百拇医药
on DNA Damage by Chemiluminescence Assay
Xiang Guangya Zhou Yikai
(Institute of Environmental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract Based on the chemiluminescence followed by CuSO4 -Phen-Vc-H2O2-induced DNA damage, the protective effect of different extracts of Hypericum Chinense on DNA damage induced by .OH was studied. It was found that the extracts of Hypericum Chinense obviously inhibited and delayed the chemiluminescence of DNA damage in a dose-dependent manner, a nd the inhibitory effect was related to the polar of the extracts.
, http://www.100md.com
Key words Hypericum chinense; DNA damage; chemiluminescence; hydroxyl radical
DNA是生物细胞遗传、增殖、分裂的主要物质基础，它决定着机体生命活动的盛衰。DNA的损 伤则可导致多种疾病的产生。DNA在一定受损程度内可以通过生物体内的修复酶系统修复。 但是，随着年龄的增长，这种修复能力明显衰退。因此，生物体内补充能够保护DNA免受损 伤的天然物质对延缓衰老，增强机体抵抗疾病的能力有重要意义。研究表明[1]， 许多天然抗氧化剂在DNA损伤中的保护作用十分明显，这已引起人们的广泛关注。
金丝桃(Hypericum Chinense)是藤黄科金丝桃属中的一种半常绿性灌木，该属植物中 黄酮类、鞣质类成分含量较高。因此，我们推测金丝桃应具有良好的抗氧化活性。本研究采 用CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA化学发光体系产生.OH，.OH损伤DNA产生化学发光, 从而检测了金丝桃对DNA损伤的保护作用。
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1 材料与方法
1.1 药品与试剂
金丝桃提取物，编号分别为F003、F004、F005(由本课题组提取)；硫酸铜(CuSO4.5H 2O ，分析纯，河南焦作化工三厂)；邻啡罗啉(1，10-phenanthroline，Phen，分析 纯，天津市化学试剂研究所)；维生素C(Vc，分析纯，东北制药总厂一分厂)；过氧化氢 (H2O2，30%，分析纯，老河口市石油化工总厂)；DNA(分析纯，Sigma公司)。
1.2 仪器
LKB 1251型化学发光仪(Pharmacia公司，瑞典)
1.3 方法
, 百拇医药
用0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 5.2)配制CuSO4.Phen溶液,取100 μl放入发光仪样 品池中,混入适量DNA和金丝桃提取物(对照用缓冲液补齐)，放置2 min后加入100 μl Vc和4 00 μl 浓度为30 ml/L的H2O2，迅速测量化学发光动力学曲线，反应总体积为1 ml。样 品终浓度为CuSO4：5×10-5 mol/L，Phen：3.5×10-4 mol/L，Vc：3×1 0-4 mol/L，H2O2:12.5 ml/L，DNA:1 μg/ml。
2 结果
Phen-Cu(Ⅱ)-H2O2是Sigman等人[2，3]广泛研究过的具有人工核酸酶活性 体系，它能够裂解DNA，而且在这一体系中加入维生素C(Vc)后，伴随DNA的氧化降解产生很 强的化学发光，且发光强度与DNA浓度之间表现出某种依赖关系[4]。基于此，近年 来有人[5]将此体系应用于检测DNA损伤，以考察抗氧化剂对DNA损伤的保护作用。
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2.1 DNA损伤产物发光测定体系的建立
实验发现，随DNA浓度的增大，该体系化学发光强度显著增加，同时动力学曲线峰型也会发 生较大的变化。在较低浓度时，动力学曲线呈两重峰，前峰为Phen发光峰，后峰为DNA损伤 发光峰，而且后峰发光值较前峰小。随着DNA浓度的增加，后峰发光值会显著增加，而且增 加到一定程度后，前后两峰会相互重叠。为了更好地检测金丝桃提取物对两发光峰特别是对 DNA损伤发光峰的影响，本文采用较低的DNA浓度，DNA浓度为1 μg/ml 。此外，该体系化学 发光还受H2O2浓度和反应温度的影响，本实验中H2O2终浓度为12.5 ml/L，反应温 度恒定在25 ℃。该体系的化学发光反应动力学曲线如图1所示。
图1 CuSO4-Phen-Vc-H2O2体系发光动力学曲线
, 百拇医药
① 不含DNA；② 含1 μg/ml DNA
2.2 金丝桃对DNA损伤的保护作用
抗氧化剂的加入能够明显影响DNA损伤发光产物的形成。文献报道[6]抗氧化剂对发 光的影响有三种不同类型：第一类只影响DNA发光的强度，而对发光峰位置无明显影响，属 于预防型抗氧化剂。第二类能使DNA损伤发光明显延迟，而对发光强度影响不大，属于断链 型抗氧化剂。第三类不仅影响DNA损伤发光强度，而且使发光峰明显延迟。该类抗氧化剂属 于预防型和断链型抗氧化剂。
本文分别考察了金丝桃提取物的三个不同部位对DNA损伤的抑制作用。如图2所示，F003的 加入，不仅使得Phen自身发光峰明显下降，而且使DNA损伤发光峰也明显下降且后移，说明F 003属于兼具预防型和断链型抗氧化剂。当F003浓度分别为7.4、18.6、 37.1 μg/ml时 ，对DNA损伤发光峰抑制率分别为为45.0 %、67.8 %、70.4 %,发光峰延迟时间分别为45 s、185 s、390 s。由此可以看出，随着F003浓度的加大，F003对DNA损伤发光的抑制作用和 延迟作用越强。这说明F003能有力地清除.OH，从而保护DNA免受损伤。
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图2 F003对CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA体系化学发光的影响
1～5的F003浓度分别为0、7.4、18.6、37.1、74.2 μg/ml
图3、4则分别反映了F004、F005对DNA损伤的保护作用。从图可以看出，当F004浓度分别为2 8.3、56.6、70.8、84.9 μg/ml时，它对DNA损伤发光峰抑制率分别为1.2 %、50.3 % 、52.8 %、68.5 %，发光峰延迟时间分别为5、60、70、110 s。当F005浓度分别为30.6 、45.9、61.2、 76.5 μg/ml时，上述两值分别为0.9 %、45.5 %、 55.8 %、58 %和 30、100、135、145 s。
为了比较F003、F004、F005对DNA损伤保护作用的大小,我们分别比较了其抑制发光50% 的浓度(IC50)以及相应的延迟时间。IC50越小，延迟时间越长，说明其抗氧化 能力越强。F003、F004、F005 的IC50值分别为9、56、50 μg/ml。从延迟时间看 ，相同剂量的F003、F004、F005的延迟时间大小顺序为F003>F005>F004。从这两个指标可以 看出抗氧化能力大小顺序为F003>F005>F004。这种顺序恰好与其极性大小顺序一致。这可能 与这三个不同部分提出物中黄酮、鞣质等抗氧化剂成分的种类与含量有关。关于这方面的 工作还有待进一步研究。
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图3 F004对CuSO4-Phen-Vc-H2O 2-DNA体系化学发光的影响
1～5的F004浓度分别为0、28.3、56.6、70.8、84.9 μg/ml
图4 F005对CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA体系化学发光的影响
1～5的F005浓度分别为0、30.6、45.9、61.2、76.5 μg/ml
3 讨论
Phen在金属离子的催化下能与H2O2作用产生最大发射在445～450 nm范围内的化学发光 。在DNA存在下，体系产生.OH等自由基引起DNA损伤断裂，产生一延迟于Phen本身发光的化 学发光，最大发光在380～420 nm，此发光为鸟嘌呤的特征反应。金丝桃提取物的加入，能 有效清除.OH，减少DNA损伤的量，并且能大大延缓DNA损伤的时间，起到保护DNA的作用。 用这种方法检测抗氧化剂对DNA损伤的保护作用，快速简便、灵敏度高，是一种很好的筛选 抗氧化剂的方法。
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国家自然科学基金资助项目(No.39990570)
项光亚，男，1968年生，讲师，博士研究生
参 考 文 献
1，张 健，曹恩华，秦静芬等.抗氧化剂对DNA损伤的保护作用机制的研究. 生 物物理学报，1997,13(1):123
2，Sigman D S, Chemical nucleases. Biochemistry, 1990,29:9097
3，Sigman D S, Chen C B. Chemical nucleases:new reagents in molecula r biology. Ann Rev Biochem， 1990,59:207
4，张 健, 秦静芬, 曹恩华等. DNA损伤的化学发光测定和茶多酚对它的保护作 用. 生物物理学报, 1996,12(4):691
5，帖建科,李令媛,茹炳根. 金属硫蛋白清除自由基及其对自由基引起的核酸损 伤保护作用的研究. 生物物理学报, 1995,11(2):276
6，张 健, 曹恩华,马文建等. 药物抗氧化作用对DNA发光动力学行为的影响. 感光科学与光化学,1997,15(2):114
(1999-07-12 收稿), http://www.100md.com
单位：同济医科大学环境医学研究所，武汉 430030
关键词：金丝桃；DNA损伤；化学发光；羟基自由基
同济医科大学学报000307 摘要 以CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA体系导致的DNA损伤发光为基础，检测了金丝桃不同 部位提取物对.OH自由基引起的DNA损伤的保护作用。结果表明：金丝桃提取物能明显抑制 和延迟DNA损伤的化学发光，而且这种抑制作用呈现剂量-效应关系，同时观察到其抑制作 用与提取物极性有关。
中图法分类号 R394.3
Measurement of the Protective Effect of Hypericum Chinense
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on DNA Damage by Chemiluminescence Assay
Xiang Guangya Zhou Yikai
(Institute of Environmental Medicine, Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract Based on the chemiluminescence followed by CuSO4 -Phen-Vc-H2O2-induced DNA damage, the protective effect of different extracts of Hypericum Chinense on DNA damage induced by .OH was studied. It was found that the extracts of Hypericum Chinense obviously inhibited and delayed the chemiluminescence of DNA damage in a dose-dependent manner, a nd the inhibitory effect was related to the polar of the extracts.
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Key words Hypericum chinense; DNA damage; chemiluminescence; hydroxyl radical
DNA是生物细胞遗传、增殖、分裂的主要物质基础，它决定着机体生命活动的盛衰。DNA的损 伤则可导致多种疾病的产生。DNA在一定受损程度内可以通过生物体内的修复酶系统修复。 但是，随着年龄的增长，这种修复能力明显衰退。因此，生物体内补充能够保护DNA免受损 伤的天然物质对延缓衰老，增强机体抵抗疾病的能力有重要意义。研究表明[1]， 许多天然抗氧化剂在DNA损伤中的保护作用十分明显，这已引起人们的广泛关注。
金丝桃(Hypericum Chinense)是藤黄科金丝桃属中的一种半常绿性灌木，该属植物中 黄酮类、鞣质类成分含量较高。因此，我们推测金丝桃应具有良好的抗氧化活性。本研究采 用CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA化学发光体系产生.OH，.OH损伤DNA产生化学发光, 从而检测了金丝桃对DNA损伤的保护作用。
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1 材料与方法
1.1 药品与试剂
金丝桃提取物，编号分别为F003、F004、F005(由本课题组提取)；硫酸铜(CuSO4.5H 2O ，分析纯，河南焦作化工三厂)；邻啡罗啉(1，10-phenanthroline，Phen，分析 纯，天津市化学试剂研究所)；维生素C(Vc，分析纯，东北制药总厂一分厂)；过氧化氢 (H2O2，30%，分析纯，老河口市石油化工总厂)；DNA(分析纯，Sigma公司)。
1.2 仪器
LKB 1251型化学发光仪(Pharmacia公司，瑞典)
1.3 方法
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用0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 5.2)配制CuSO4.Phen溶液,取100 μl放入发光仪样 品池中,混入适量DNA和金丝桃提取物(对照用缓冲液补齐)，放置2 min后加入100 μl Vc和4 00 μl 浓度为30 ml/L的H2O2，迅速测量化学发光动力学曲线，反应总体积为1 ml。样 品终浓度为CuSO4：5×10-5 mol/L，Phen：3.5×10-4 mol/L，Vc：3×1 0-4 mol/L，H2O2:12.5 ml/L，DNA:1 μg/ml。
2 结果
Phen-Cu(Ⅱ)-H2O2是Sigman等人[2，3]广泛研究过的具有人工核酸酶活性 体系，它能够裂解DNA，而且在这一体系中加入维生素C(Vc)后，伴随DNA的氧化降解产生很 强的化学发光，且发光强度与DNA浓度之间表现出某种依赖关系[4]。基于此，近年 来有人[5]将此体系应用于检测DNA损伤，以考察抗氧化剂对DNA损伤的保护作用。
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2.1 DNA损伤产物发光测定体系的建立
实验发现，随DNA浓度的增大，该体系化学发光强度显著增加，同时动力学曲线峰型也会发 生较大的变化。在较低浓度时，动力学曲线呈两重峰，前峰为Phen发光峰，后峰为DNA损伤 发光峰，而且后峰发光值较前峰小。随着DNA浓度的增加，后峰发光值会显著增加，而且增 加到一定程度后，前后两峰会相互重叠。为了更好地检测金丝桃提取物对两发光峰特别是对 DNA损伤发光峰的影响，本文采用较低的DNA浓度，DNA浓度为1 μg/ml 。此外，该体系化学 发光还受H2O2浓度和反应温度的影响，本实验中H2O2终浓度为12.5 ml/L，反应温 度恒定在25 ℃。该体系的化学发光反应动力学曲线如图1所示。
图1 CuSO4-Phen-Vc-H2O2体系发光动力学曲线
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① 不含DNA；② 含1 μg/ml DNA
2.2 金丝桃对DNA损伤的保护作用
抗氧化剂的加入能够明显影响DNA损伤发光产物的形成。文献报道[6]抗氧化剂对发 光的影响有三种不同类型：第一类只影响DNA发光的强度，而对发光峰位置无明显影响，属 于预防型抗氧化剂。第二类能使DNA损伤发光明显延迟，而对发光强度影响不大，属于断链 型抗氧化剂。第三类不仅影响DNA损伤发光强度，而且使发光峰明显延迟。该类抗氧化剂属 于预防型和断链型抗氧化剂。
本文分别考察了金丝桃提取物的三个不同部位对DNA损伤的抑制作用。如图2所示，F003的 加入，不仅使得Phen自身发光峰明显下降，而且使DNA损伤发光峰也明显下降且后移，说明F 003属于兼具预防型和断链型抗氧化剂。当F003浓度分别为7.4、18.6、 37.1 μg/ml时 ，对DNA损伤发光峰抑制率分别为为45.0 %、67.8 %、70.4 %,发光峰延迟时间分别为45 s、185 s、390 s。由此可以看出，随着F003浓度的加大，F003对DNA损伤发光的抑制作用和 延迟作用越强。这说明F003能有力地清除.OH，从而保护DNA免受损伤。
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图2 F003对CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA体系化学发光的影响
1～5的F003浓度分别为0、7.4、18.6、37.1、74.2 μg/ml
图3、4则分别反映了F004、F005对DNA损伤的保护作用。从图可以看出，当F004浓度分别为2 8.3、56.6、70.8、84.9 μg/ml时，它对DNA损伤发光峰抑制率分别为1.2 %、50.3 % 、52.8 %、68.5 %，发光峰延迟时间分别为5、60、70、110 s。当F005浓度分别为30.6 、45.9、61.2、 76.5 μg/ml时，上述两值分别为0.9 %、45.5 %、 55.8 %、58 %和 30、100、135、145 s。
为了比较F003、F004、F005对DNA损伤保护作用的大小,我们分别比较了其抑制发光50% 的浓度(IC50)以及相应的延迟时间。IC50越小，延迟时间越长，说明其抗氧化 能力越强。F003、F004、F005 的IC50值分别为9、56、50 μg/ml。从延迟时间看 ，相同剂量的F003、F004、F005的延迟时间大小顺序为F003>F005>F004。从这两个指标可以 看出抗氧化能力大小顺序为F003>F005>F004。这种顺序恰好与其极性大小顺序一致。这可能 与这三个不同部分提出物中黄酮、鞣质等抗氧化剂成分的种类与含量有关。关于这方面的 工作还有待进一步研究。
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图3 F004对CuSO4-Phen-Vc-H2O 2-DNA体系化学发光的影响
1～5的F004浓度分别为0、28.3、56.6、70.8、84.9 μg/ml
图4 F005对CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA体系化学发光的影响
1～5的F005浓度分别为0、30.6、45.9、61.2、76.5 μg/ml
3 讨论
Phen在金属离子的催化下能与H2O2作用产生最大发射在445～450 nm范围内的化学发光 。在DNA存在下，体系产生.OH等自由基引起DNA损伤断裂，产生一延迟于Phen本身发光的化 学发光，最大发光在380～420 nm，此发光为鸟嘌呤的特征反应。金丝桃提取物的加入，能 有效清除.OH，减少DNA损伤的量，并且能大大延缓DNA损伤的时间，起到保护DNA的作用。 用这种方法检测抗氧化剂对DNA损伤的保护作用，快速简便、灵敏度高，是一种很好的筛选 抗氧化剂的方法。
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国家自然科学基金资助项目(No.39990570)
项光亚，男，1968年生，讲师，博士研究生
参 考 文 献
1，张 健，曹恩华，秦静芬等.抗氧化剂对DNA损伤的保护作用机制的研究. 生 物物理学报，1997,13(1):123
2，Sigman D S, Chemical nucleases. Biochemistry, 1990,29:9097
3，Sigman D S, Chen C B. Chemical nucleases:new reagents in molecula r biology. Ann Rev Biochem， 1990,59:207
4，张 健, 秦静芬, 曹恩华等. DNA损伤的化学发光测定和茶多酚对它的保护作 用. 生物物理学报, 1996,12(4):691
5，帖建科,李令媛,茹炳根. 金属硫蛋白清除自由基及其对自由基引起的核酸损 伤保护作用的研究. 生物物理学报, 1995,11(2):276
6，张 健, 曹恩华,马文建等. 药物抗氧化作用对DNA发光动力学行为的影响. 感光科学与光化学,1997,15(2):114
(1999-07-12 收稿), http://www.100md.com