紫菜多糖与天青I异染作用的研究
作者：崔秀生 宋晓虹 陈怡
单位：崔秀生 宋晓虹 陈怡(首都医科大学仪器分析室，北京 100054)
关键词：多糖，紫菜，异染作用
中国海洋药物000309 摘 要 研究了紫菜多糖与天青I的异染作用，发现紫菜多糖具有酸性粘多糖的典型特点，能与天青I发生异染作用。与肝素比较，紫菜多糖与天青I所生成的异染化合物吸收峰的波长较长，在530nm处，并且稳定性也相对较差。
STUDY ON THE METACHROMASIA OF POLYSACCHARIDE FROM PORPHRA TENERA WITH AIURE I
Cui Xusheng，Song Xiaohong，Chen Yi
, http://www.100md.com ABSTRACT The metachromasia of polysaccharide from Porphyra tenear Kjellm with azure I has been studied in this paper.It is discovered that the polysaccharide can produce metachromasia with azure I,that is the typical property of acidic mucopolysaccharide.Compared with heparin,the wave-lenght of the light absorbed by the metachromatic compound of the polysaccharide and azure I is longer,is 530 nm,and the stability of the metachromatic compound is less.
KEY WORDS Polysaccharide,Porphyra tenera,metachromasia
, 百拇医药
海藻类多糖具有许多生物活性，目前是药物和保健品开发研究的热点之一。紫菜多糖(Polysaccharide from Porphyra tenera以下简称pp)是海藻类多糖中的一种，在结构上与肝素(hep)相似都是多糖的硫酸酯类。周慧萍经研究认为在抗凝血、降血脂、提高免疫力、抗衰老等方面都有一定的生物活性[1～3]。Jaques认为肝素类的硫酸多糖酯类与血浆蛋白和细胞表面成分之间的相互作用和它们与天青I碱性有机染料之间的异染作用(metachromasia)原理上是相似的[4]。樊绘曾等人进一步提出了对多糖类与有机染料异染性质的观察有助于在化学药理水平上比较多糖的结构与活性的差别，可能为多糖药物的筛选提供一种方法[5]。本文通过与hep和硫酸软骨素(chs)的比较研究了pp与天青I的异染作用。
1 材料与方法
1.1材料 pp：从甘紫菜(Porphyra tenera Kjellm )中提取的紫菜多糖。
, 百拇医药
(本室提供)配制成5mg.mL-1的溶液。
巴比妥(生化试剂，购自北京化学试剂公司)：配制成0.075mol.L-1(pH8.6)的缓冲溶液。
天青I(生化试剂，购自北京化学试剂公司)：用蒸馏水配制成1mg.mL-1的贮备液。依次取2.5,5，10mL贮备液于200mL容量瓶中，加入25mL巴比妥缓冲液，用蒸馏水稀至刻度，配制成A，B和C 3种天青I试液。
hep(生化试剂，购自北京化学试剂公司)，配制成5mg.mL-1的溶液。
1.2 仪器
本实验所用的仪器为具有扫描功能的双光束岛津UV-3000型紫外可见分光光度计。
, 百拇医药
2 实验方法
取3.5mL天青I的A试液于1cm的样品池中，以水为空白，在UV-3000分光光度计450～750nm扫描并记录它的可见光区光谱图。用微量进样器准确加入5L的hep溶液于样品池中并混均，按同样的方法记录hep和天青I混合溶液的光谱图；换用天青I的A试液为空白，扫描记录hep的差光谱图。依次取3.5mL的天青I的A，B和C试液，分别加入pp溶液10L，以相应的天青I溶液为空白，扫描记录pp的差光谱图。
3 结果和讨论
图1.给出了天青I的A试液和天青I与hep以及和pp的混合溶液的可见光区光谱图。从图中可以看出pp和hep与天青I的混合溶液的光谱图存在明显区别，hep在500nm处出现了新的异染化合物的吸收峰，而pp除了原有的天青I在630nm处的吸收峰明显变小外，未见有新的吸收峰。文献在研究chs与天青I的异染作用也出现过类似的现象[5]。但这并不能说明pp与天青I没有异染作用。图2和图3分别给出了以天青I试液为空白，hep和pp不同浓度的天青I试液混合液的差光谱图。比较这些光谱图可以看出pp和hep的差光谱基本上是一致的，不同的是hep在比较稀的天青I溶液中就表现出了很强的异染作用，而pp与天青I在稀溶液中的异染作用相对较弱。文献在研究异染化合物的稳定性时曾发现不同的多糖与不同的有机染料所形成的异染化合物的稳定性差别很大[6]，与hep比较chs所形成的异染化合物的稳定性相对较差，在溶液中存在如下的平衡：
, 百拇医药
多糖+有机染料=异染化合物
Fig1. spectra of (a) azure A,(b)heparin with azure A,(c)polysaccharide of Porphyra tenera with azure A
Fig2. spectral difference in light absorption between azure A and azure A with heparin.
Fig3. spectral difference in light absorption between polysaccharide of Porphyra tenera with the differential azure A solutions,concentration of azure A:(a)0.0125mg.mL-1,(b)0.025mg.mL-1,(c)0.05mg.mL-1.
, 百拇医药
本实验的结果说明了pp与天青I的异染化合物的稳定性与hep比较相对较差，依据化学平衡的原理，在pp浓度不变的条件下，只有在较高天青I的浓度下，才能生成较大浓度的异染化合物。
此外，pp与天青I异染作用与hep另一个显著不同点是hep的异染峰在500nm处，而pp的异染峰在530nm处，这和文献中所报道的chs的异染峰的位置大致一致[7]，说明了与hep相比较，pp与天青I的异染作用与chs更相似。Bradley认为异染作用是由于染料与多聚阴离子(多糖硫酸脂是一种多聚阴离子)之间静电相互作用所引起的[8]，含有氨基的噻嗪基团是染料的生色团，这种相互作用部分阻断了染料中噻嗪环上的N-基团参与构成生色团体系，因而减小了电子的离域性，使得染料所吸收的光的能量增加，波长变短。染料所吸收光的波长位移的大小反映了异染作用中化学键的强度[9]。本实验中hep的位移是130nm，而pp是100nm,说明pp与天青I结合的强度较弱，这又从另一方面说明pp与天青I所形成异染化合物的稳定性相对较差。文献[5]在研究刺参酸性粘多糖(糖链由葡萄糖醛酸，氨基半乳糖和岩藻糖组成)的异染现象时发现，与糖链结构与之相近的chs(由葡萄糖醛酸和氨基半乳糖组成)的异染现象比较差别很大，而和糖链结构与之相差较大的hep(由葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖组成的)异染现象比较反而十分相似，它们的异染吸收峰都在500nm处，而且在稀的天青I溶液中都能生成稳定的异染化合物。pp(糖链由葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖和木糖组成[10])的糖链与上述多糖都不相似，且无论是吸收峰的位置还是异染化合物的稳定性，都和chs相似。硫酸肝素(heparin monosulfate)(由葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖组成)的糖链与hep相同，它的异染吸收峰却在525nm处。这些现象说明了糖链结构在多糖的异染作用中不是主要的影响因素，主要因素可能是硫酸根阴离子基团的位置和密度。
, http://www.100md.com
pp的异染作用的第三个不同之处是空气对异染作用的显著影响。在pp与天青I溶液混合时，如果有大量空气混入就会减小530nm处的异染吸收峰，在空气中长期放置(10min)也会显著减小吸收峰，而肝素则不存在这种影响，在本室制备pp时，如果将用乙醇沉淀出的pp直接暴露在空气中干燥，就会被氧化成黑褐色，只有在氮气流的保护下干燥才能得到灰白色的纯品，这说明了pp具有一定的还原性。上述空气对pp异染作用的影响，有可能就是氧对pp的氧化作用所造成的。
以上的实验说明了pp具有酸性粘多糖的典型异染特性，但和hep比较，异染作用要弱。从文献[1]的实验结果可以看出，pp的抗凝血活性比hep要弱得多，这或许是酸性粘多糖的异染特性和抗凝血活性之间存在某种相关性的又一例证。
参考文献
1，周慧萍.紫菜多糖的抗凝血和降血脂作用.中国药科大学学报，1990，21(6)：358
, http://www.100md.com
2，周慧萍.紫菜多糖对核酸蛋白质生物合成和免疫功能的影响.中国药科大学学报，1989，20(2)：86
3，周慧萍.紫菜多糖抗衰老作用的实验研究.中国药科大学学报，1989，20(4)：231
4，L.B.Jaques et al,The metachromatic activity of heparin,Rev Can Biol，1947,6:740
5，樊绘曾.刺参酸性粘多糖与染料天青I的结合性质.海洋药物杂志，1982，1：8
6，Pal MK. Measurement of the stability of metachromatic compounds,J Am Chem Soc，1962,84:4384
7，Jaques LB.A modified method for the colorimetric determination of heparin,Can J Physiol Pharmacol, 1967,45,787
, 百拇医药
8，Bradley DF.Aggregation of dyes bound to polyanions,Prroc Natl Acad Sci,USA，1959,45,944
9，Wollin A.Metachromasia:An expanation of the colour change produced in dyes by heparin and other substances,Thrombosis research,1973,2:377
10，周慧萍.紫菜多糖的提取、分离和鉴定.中国药科大学学报，1989，20(3)：170
收稿日期：1999-09-03, http://www.100md.com
单位：崔秀生 宋晓虹 陈怡(首都医科大学仪器分析室，北京 100054)
关键词：多糖，紫菜，异染作用
中国海洋药物000309 摘 要 研究了紫菜多糖与天青I的异染作用，发现紫菜多糖具有酸性粘多糖的典型特点，能与天青I发生异染作用。与肝素比较，紫菜多糖与天青I所生成的异染化合物吸收峰的波长较长，在530nm处，并且稳定性也相对较差。
STUDY ON THE METACHROMASIA OF POLYSACCHARIDE FROM PORPHRA TENERA WITH AIURE I
Cui Xusheng，Song Xiaohong，Chen Yi
, http://www.100md.com ABSTRACT The metachromasia of polysaccharide from Porphyra tenear Kjellm with azure I has been studied in this paper.It is discovered that the polysaccharide can produce metachromasia with azure I,that is the typical property of acidic mucopolysaccharide.Compared with heparin,the wave-lenght of the light absorbed by the metachromatic compound of the polysaccharide and azure I is longer,is 530 nm,and the stability of the metachromatic compound is less.
KEY WORDS Polysaccharide,Porphyra tenera,metachromasia
, 百拇医药
海藻类多糖具有许多生物活性，目前是药物和保健品开发研究的热点之一。紫菜多糖(Polysaccharide from Porphyra tenera以下简称pp)是海藻类多糖中的一种，在结构上与肝素(hep)相似都是多糖的硫酸酯类。周慧萍经研究认为在抗凝血、降血脂、提高免疫力、抗衰老等方面都有一定的生物活性[1～3]。Jaques认为肝素类的硫酸多糖酯类与血浆蛋白和细胞表面成分之间的相互作用和它们与天青I碱性有机染料之间的异染作用(metachromasia)原理上是相似的[4]。樊绘曾等人进一步提出了对多糖类与有机染料异染性质的观察有助于在化学药理水平上比较多糖的结构与活性的差别，可能为多糖药物的筛选提供一种方法[5]。本文通过与hep和硫酸软骨素(chs)的比较研究了pp与天青I的异染作用。
1 材料与方法
1.1材料 pp：从甘紫菜(Porphyra tenera Kjellm )中提取的紫菜多糖。
, 百拇医药
(本室提供)配制成5mg.mL-1的溶液。
巴比妥(生化试剂，购自北京化学试剂公司)：配制成0.075mol.L-1(pH8.6)的缓冲溶液。
天青I(生化试剂，购自北京化学试剂公司)：用蒸馏水配制成1mg.mL-1的贮备液。依次取2.5,5，10mL贮备液于200mL容量瓶中，加入25mL巴比妥缓冲液，用蒸馏水稀至刻度，配制成A，B和C 3种天青I试液。
hep(生化试剂，购自北京化学试剂公司)，配制成5mg.mL-1的溶液。
1.2 仪器
本实验所用的仪器为具有扫描功能的双光束岛津UV-3000型紫外可见分光光度计。
, 百拇医药
2 实验方法
取3.5mL天青I的A试液于1cm的样品池中，以水为空白，在UV-3000分光光度计450～750nm扫描并记录它的可见光区光谱图。用微量进样器准确加入5L的hep溶液于样品池中并混均，按同样的方法记录hep和天青I混合溶液的光谱图；换用天青I的A试液为空白，扫描记录hep的差光谱图。依次取3.5mL的天青I的A，B和C试液，分别加入pp溶液10L，以相应的天青I溶液为空白，扫描记录pp的差光谱图。
3 结果和讨论
图1.给出了天青I的A试液和天青I与hep以及和pp的混合溶液的可见光区光谱图。从图中可以看出pp和hep与天青I的混合溶液的光谱图存在明显区别，hep在500nm处出现了新的异染化合物的吸收峰，而pp除了原有的天青I在630nm处的吸收峰明显变小外，未见有新的吸收峰。文献在研究chs与天青I的异染作用也出现过类似的现象[5]。但这并不能说明pp与天青I没有异染作用。图2和图3分别给出了以天青I试液为空白，hep和pp不同浓度的天青I试液混合液的差光谱图。比较这些光谱图可以看出pp和hep的差光谱基本上是一致的，不同的是hep在比较稀的天青I溶液中就表现出了很强的异染作用，而pp与天青I在稀溶液中的异染作用相对较弱。文献在研究异染化合物的稳定性时曾发现不同的多糖与不同的有机染料所形成的异染化合物的稳定性差别很大[6]，与hep比较chs所形成的异染化合物的稳定性相对较差，在溶液中存在如下的平衡：
, 百拇医药
多糖+有机染料=异染化合物
Fig1. spectra of (a) azure A,(b)heparin with azure A,(c)polysaccharide of Porphyra tenera with azure A
Fig2. spectral difference in light absorption between azure A and azure A with heparin.
Fig3. spectral difference in light absorption between polysaccharide of Porphyra tenera with the differential azure A solutions,concentration of azure A:(a)0.0125mg.mL-1,(b)0.025mg.mL-1,(c)0.05mg.mL-1.
, 百拇医药
本实验的结果说明了pp与天青I的异染化合物的稳定性与hep比较相对较差，依据化学平衡的原理，在pp浓度不变的条件下，只有在较高天青I的浓度下，才能生成较大浓度的异染化合物。
此外，pp与天青I异染作用与hep另一个显著不同点是hep的异染峰在500nm处，而pp的异染峰在530nm处，这和文献中所报道的chs的异染峰的位置大致一致[7]，说明了与hep相比较，pp与天青I的异染作用与chs更相似。Bradley认为异染作用是由于染料与多聚阴离子(多糖硫酸脂是一种多聚阴离子)之间静电相互作用所引起的[8]，含有氨基的噻嗪基团是染料的生色团，这种相互作用部分阻断了染料中噻嗪环上的N-基团参与构成生色团体系，因而减小了电子的离域性，使得染料所吸收的光的能量增加，波长变短。染料所吸收光的波长位移的大小反映了异染作用中化学键的强度[9]。本实验中hep的位移是130nm，而pp是100nm,说明pp与天青I结合的强度较弱，这又从另一方面说明pp与天青I所形成异染化合物的稳定性相对较差。文献[5]在研究刺参酸性粘多糖(糖链由葡萄糖醛酸，氨基半乳糖和岩藻糖组成)的异染现象时发现，与糖链结构与之相近的chs(由葡萄糖醛酸和氨基半乳糖组成)的异染现象比较差别很大，而和糖链结构与之相差较大的hep(由葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖组成的)异染现象比较反而十分相似，它们的异染吸收峰都在500nm处，而且在稀的天青I溶液中都能生成稳定的异染化合物。pp(糖链由葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖和木糖组成[10])的糖链与上述多糖都不相似，且无论是吸收峰的位置还是异染化合物的稳定性，都和chs相似。硫酸肝素(heparin monosulfate)(由葡萄糖醛酸和氨基葡萄糖组成)的糖链与hep相同，它的异染吸收峰却在525nm处。这些现象说明了糖链结构在多糖的异染作用中不是主要的影响因素，主要因素可能是硫酸根阴离子基团的位置和密度。
, http://www.100md.com
pp的异染作用的第三个不同之处是空气对异染作用的显著影响。在pp与天青I溶液混合时，如果有大量空气混入就会减小530nm处的异染吸收峰，在空气中长期放置(10min)也会显著减小吸收峰，而肝素则不存在这种影响，在本室制备pp时，如果将用乙醇沉淀出的pp直接暴露在空气中干燥，就会被氧化成黑褐色，只有在氮气流的保护下干燥才能得到灰白色的纯品，这说明了pp具有一定的还原性。上述空气对pp异染作用的影响，有可能就是氧对pp的氧化作用所造成的。
以上的实验说明了pp具有酸性粘多糖的典型异染特性，但和hep比较，异染作用要弱。从文献[1]的实验结果可以看出，pp的抗凝血活性比hep要弱得多，这或许是酸性粘多糖的异染特性和抗凝血活性之间存在某种相关性的又一例证。
参考文献
1，周慧萍.紫菜多糖的抗凝血和降血脂作用.中国药科大学学报，1990，21(6)：358
, http://www.100md.com
2，周慧萍.紫菜多糖对核酸蛋白质生物合成和免疫功能的影响.中国药科大学学报，1989，20(2)：86
3，周慧萍.紫菜多糖抗衰老作用的实验研究.中国药科大学学报，1989，20(4)：231
4，L.B.Jaques et al,The metachromatic activity of heparin,Rev Can Biol，1947,6:740
5，樊绘曾.刺参酸性粘多糖与染料天青I的结合性质.海洋药物杂志，1982，1：8
6，Pal MK. Measurement of the stability of metachromatic compounds,J Am Chem Soc，1962,84:4384
7，Jaques LB.A modified method for the colorimetric determination of heparin,Can J Physiol Pharmacol, 1967,45,787
, 百拇医药
8，Bradley DF.Aggregation of dyes bound to polyanions,Prroc Natl Acad Sci,USA，1959,45,944
9，Wollin A.Metachromasia:An expanation of the colour change produced in dyes by heparin and other substances,Thrombosis research,1973,2:377
10，周慧萍.紫菜多糖的提取、分离和鉴定.中国药科大学学报，1989，20(3)：170
收稿日期：1999-09-03, http://www.100md.com