幽门螺杆菌毒力菌株感染与胃十二指肠疾病的关系
作者：朱玉群 王燕斌 李欣欣 张磊 杨昭徐
单位：(首都医科大学附属北京天坛医院消化内科)
关键词：幽门螺杆菌；细胞毒素相关基因A；胃十二指肠疾病
首都医科大学学报000309 提要：应用间接ELISA法，测定1 674例经胃镜检查患者的血清幽门螺杆菌(HP)细胞毒素相关基因A(CagA)抗体,探讨HP菌型差异与其致胃十二指肠疾病的关系。结果：疾病组血清CagA抗体检出率为49.70%,高于健康组的38%(P<0.05);活动期十二指肠溃疡(DU)的抗体检出率显著高于活动期胃溃疡(GU)、胃癌(GC)和慢性胃炎(CG)(P<0.01);活动性炎症的抗体检出率显著高于非活动性炎症(P<0.01)。随CG炎症程度加重,抗体阳性率呈递增性增加(P<0.05，P<0.01);GC及各癌前病变抗CagA检出率与健康组比较无差异。提示：HP产毒菌感染与胃十二指肠粘膜炎症活动及损伤程度有关。
, 百拇医药
中图分类号：R573.1； R378.2
Relationship between Specific HP
Strain Infection with CagA Seropositive
and Gastroduodenal Diseases
Zhu Yuqun，Wang Yanbin，Li Xinxin，Zhang Lei，Yang Zhaoxu
(Division of Gastroenterology, Beijing Tiantan Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract: In order to assess the relationship between different HP bacteria types and their pathogenicity,investigated 1 674 patients who underwent gastroscopy and 100 blood donors. HP infection was diagnosed by at least 2 positive results from PCR, histology (Giemsa staining), or rapid urease test. Serum CagA IgG antibodies were measured by ELISA. It was found that total prevalence of CagA seropositive was 49.70% in patients and 38% in controls (P<0.05). The frequency of CagA antibodies were significantly higher in DU cases than that of in GU，GC and CG ones(P<0.01). In active and severe degree of CG, anti-CagA presence was more common(P<0.01). However, no difference was found in anti-CagA positive rate among GC, CAG, IM, AH and normal groups. These data indicated that specific HP strain with CagA seropositive was associated with the degree of damages and active inflammation on gastroduodenal mucosa.
, 百拇医药
Key words: Helicobacter pylori; cytotoxin-associated gene A; gastroduodenal diseases
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)感染与多种胃十二指肠疾病相关。我国人群中HP感染率较高,但仅部分人发生胃十二指肠病变。目前认为,这种现象可能与HP的菌株类型有关。本研究应用间接ELISA法测定患者血清HP细胞毒素相关基因A(cytotoxin-associated gene A, CagA )IgG抗体,探讨HP产毒菌感染与胃十二指肠疾病的关系。
1 对象和方法
1.1 对象
1997年4月至1998年7月在我院接受胃镜检查的患者1 674例,其中男904例(54%),女770例(46%)。男∶女=1.17∶1。年龄15～84岁,平均年龄(42.69±15.42)岁。其中活动期十二指肠溃疡(DU,A1或A2期)210例,活动期胃溃疡(GU,A1或A2期)70例、胃癌(GC)64例、慢性胃炎(CG)1 330例。所有患者均未经系统抗溃疡及抗HP治疗。另选同期献血员100例作为健康对照组。
, 百拇医药
1.2 方法
标本采集:每例患者于胃镜检查时取距幽门5 cm区域内胃窦粘膜组织，分别做快速尿素酶试验(CLO)、组织学检查(Giemsa染色)和PCR反应。同期抽取静脉血2 mL,自然凝固后分离血清,置-20 ℃冰箱保存备用。
CagA抗体测定:试剂由上海晶莹技术有限公司提供,抗原表达区选自多株国内流行株HP-CagA 2766～3466基因片断。经测序与国际标准株同源性达70.4%,临床预试验敏感性为90%,特异性为95.5%。实验按要求加入待检血清、阳性和阴性对照血清各0.1 mL,设空白对照。于37 ℃作用60 min,洗板完全后,加二抗体,置于37 ℃反应40 min,再洗板。各孔加入底物液A和B各0.1 mL,避光显色15 min,加终止液终止反应。用伯乐550酶标仪测定各孔OD值，阳性与阴性血清OD之差>0.5为试验有效。以阴性血清双孔平均OD值±0.3作为判断值,小于此值为阴性,反之为阳性。
, 百拇医药
PCR:选择互补于HP16SrRNA基因片段的种特异性引物进行PCR扩增,引物序列为5'GAC-CTC-TCT-GAT-TCG-GGA-GG3'和5'TAA-TGA-CTG-CGA-CTA-ACA-CG3'。整块胃粘摸标本直接以蛋白酶K法粗提,于94 ℃ 40 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s,循环35次,最后1个循环延长5 min。产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离,紫外灯下观察结果,于约109 bp处出现明显条带,边缘整齐,亮度较强者为阳性。
Giemsa染色：胃粘膜标本用10%甲醛固定,连续切片,改良Giemsa染色辨认HP,HE染色做病理学诊断。
CLO(三强生物公司试剂)检测:新鲜胃粘膜标本埋于试剂中3 min,试剂变红为阳性。
统计学方法：χ2检验。
2 结果
, 百拇医药
HP检出率:经PCR、Giemsa染色和CLO检测,以2项或2项以上阳性定为HP感染,疾病组HP的总检出率为64.87%,详见表1。
血清CagA抗体检出率:HP感染组为70.17%(762/1 086),显著高于非感染组的11.90%( 70/588，P<0.01)。疾病组总检出率为49.70%,明显高于健康组的38%(P<0.05)。其中DU为81.90%,显著高于GU、GC和CG组(P<0.01),后3组各组间及其与健康组间比较均无差异(表1)。
表1 各种疾病HP及CagA抗体检出率 组别
n
HP
CagA抗体
阳性例数(所占百分数/%)
, 百拇医药
健康组
100
-
38(38.00)
DU
210
195(92.86)
172(81.90)*
GU
70
46(65.71)
33(47.14)
, 百拇医药
GC
64
37(57.81)
26(40.63)
CG
1 330
808(60.75)
601(45.19)
* 与健康组和GU、GC、CG比较P<0.01
CagA抗体与炎症类型及程度的关系: 依据CG的病理学诊断标准[1],显示血清CagA抗体检出率随炎症由轻至重呈递增性增加; 粘膜活动性炎症明显高于非活动性炎症(表2、3)。
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表2 抗-CagA与慢性胃炎炎症程度的关系 炎症程度
n
HP
CagA抗体
阳性例数(所占百分数/%)
轻度
616
266(43.18)
180(29.22)
中度
544
390(71.69)
, 百拇医药
301(55.33)*
重度
170
152(89.41)
120(70.59)**
合计
1 330
808(60.75)
601(45.19)
与轻度组比较* P<0.05；**P<0.01
CagA抗体与胃癌及癌前病变的关系：GC、慢性萎缩性胃炎(CAG)、肠上皮化生(IM)及非典型性增生(AH)的血清抗-CagA阳性率与健康组比较无显著性差异(表4)。
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表3 CagA抗体检出率与炎症活动与否的关系 分类
n
HP
CagA抗体
阳性例数(所占百分数/%)
活动组
538
487(90.52)
432(80.29)*
非活动组
792
321(40.53)
, 百拇医药
169(21.34)
合计
1 330
808(60.75)
601(45.19)
* 与非活动组比较P<0.01表4 CagA抗体检出率与胃癌及癌前病变的关系 组别
n
HP
CagA抗体
阳性例数(所占百分数/%)
健康组
100
, http://www.100md.com
38(38.00)
GC
64
37(57.81)
26(40.63)
CAG
48
26(54.17)
20(41.67)
IM
172
98(56.98)
, 百拇医药 70(40.70)
AH
36
18(50.00)
13(36.11)
3 讨论
HP可分为2种类型[2],Ⅰ型表达CagA蛋白,有毒素活性，致病力强, 感染后多引起胃粘膜较严重的损伤;Ⅱ型不表达CagA蛋白,无毒素活性,感染后无症状或引起慢性浅表性胃炎。判断HP菌株类型,有助于对胃十二指肠疾病的诊断及治疗方案的确定。
CagA存在于60%～80%的HP菌中[3],被认为是HP的毒力因子及HP毒力菌株的标志之一。本研究显示，大于80%DU患者血清抗-CagA阳性。同时发现,CagA抗体阳性率随粘膜炎症病变程度的加重而增加,提示CagA阳性菌株参与粘膜急、慢性损伤和活动性炎症过程。其原因可能与具有CagA阳性的HP菌株诱导炎性因子、介导白介素8(IL-8),促进中性粒细胞活化和趋化有关[4]。
, 百拇医药
研究证实[5，6]，具有CagA基因的HP感染者发展成萎缩性胃炎及胃癌的危险性是CagA阴性菌株的2倍;胃癌高发区人群CagA抗体检出率显著高于低发区人群;年龄低于50岁的胃癌患者血清CagA识别率明显高于对照组。但在本研究中,血清抗-CagA检出率在GC和各类癌前病变均无显著增加,可能与区域间CagA抗原的多样性有关。本研究血清CagA抗体检出率HP感染组(70.17%)显著高于非感染组(11.90%),提示该方法可在一定程度上反应体内产毒素HP菌株感染的情况。本研究还发现健康人CagA阳性HP菌株感染率也较高,提示胃癌是一个多因素的疾病,高毒株HP感染不是胃癌发生的唯一因素。总之,HP毒力菌株感染与十二指肠溃疡及胃粘膜中、重度慢性活动性炎症相关,与胃癌和癌前病变关系不密切。用血清学方法检测HP CagA抗体简便、无创、价廉,临床上可作为诊断HP产毒菌株感染和判断损伤程度的指标,但不独立用作区分HP致癌菌株的标志。
参考文献
, 百拇医药 1，董郡. 病理学.第2版.北京：人民卫生出版社,1996.12
2，Xiang Z, Censini S, Bayeli P F, et al. Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter pylori reveals that clinical isolates can be divided into two major types and that CagA is not necessary for expression of the vacuolating cytotoxin. Infect Immun, 1995, 63: 94
3，Tummuru M K R, Cover T L, Blaser M J, et al. Cloning and expression of a high-molecular-massmalor antigen Helicobacter pylori: Evidence of linkage to cytotoxin production. Infect Immun,1993, 61: 1799
, 百拇医药
4，Crabtree J E, Farmery S M, Lindley I J D,et al. CagA/cytotoxic strains of Helicobacter pylori and interleukin-8 in gastric epithelial cell lines.J Clin Pathol,1994,47:945
5，Romaozinho J M, Souto P, Rodriguces V L, et al.Sera prevalence of antibodies to CagA and VacA proleins versus gastric cancer risk. Gut, 1996,39(S2):A81
6，Klamas K, Held M, Wadstrom T,et al. IgG immune response to Helicobacter pylori antigens in patients with gastric cancer as defined by ELISA and immunoblotting. Int J Cancer,1996, 67:1
收稿日期：1999-08-17, http://www.100md.com
单位：(首都医科大学附属北京天坛医院消化内科)
关键词：幽门螺杆菌；细胞毒素相关基因A；胃十二指肠疾病
首都医科大学学报000309 提要：应用间接ELISA法，测定1 674例经胃镜检查患者的血清幽门螺杆菌(HP)细胞毒素相关基因A(CagA)抗体,探讨HP菌型差异与其致胃十二指肠疾病的关系。结果：疾病组血清CagA抗体检出率为49.70%,高于健康组的38%(P<0.05);活动期十二指肠溃疡(DU)的抗体检出率显著高于活动期胃溃疡(GU)、胃癌(GC)和慢性胃炎(CG)(P<0.01);活动性炎症的抗体检出率显著高于非活动性炎症(P<0.01)。随CG炎症程度加重,抗体阳性率呈递增性增加(P<0.05，P<0.01);GC及各癌前病变抗CagA检出率与健康组比较无差异。提示：HP产毒菌感染与胃十二指肠粘膜炎症活动及损伤程度有关。
, 百拇医药
中图分类号：R573.1； R378.2
Relationship between Specific HP
Strain Infection with CagA Seropositive
and Gastroduodenal Diseases
Zhu Yuqun，Wang Yanbin，Li Xinxin，Zhang Lei，Yang Zhaoxu
(Division of Gastroenterology, Beijing Tiantan Hospital,Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract: In order to assess the relationship between different HP bacteria types and their pathogenicity,investigated 1 674 patients who underwent gastroscopy and 100 blood donors. HP infection was diagnosed by at least 2 positive results from PCR, histology (Giemsa staining), or rapid urease test. Serum CagA IgG antibodies were measured by ELISA. It was found that total prevalence of CagA seropositive was 49.70% in patients and 38% in controls (P<0.05). The frequency of CagA antibodies were significantly higher in DU cases than that of in GU，GC and CG ones(P<0.01). In active and severe degree of CG, anti-CagA presence was more common(P<0.01). However, no difference was found in anti-CagA positive rate among GC, CAG, IM, AH and normal groups. These data indicated that specific HP strain with CagA seropositive was associated with the degree of damages and active inflammation on gastroduodenal mucosa.
, 百拇医药
Key words: Helicobacter pylori; cytotoxin-associated gene A; gastroduodenal diseases
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)感染与多种胃十二指肠疾病相关。我国人群中HP感染率较高,但仅部分人发生胃十二指肠病变。目前认为,这种现象可能与HP的菌株类型有关。本研究应用间接ELISA法测定患者血清HP细胞毒素相关基因A(cytotoxin-associated gene A, CagA )IgG抗体,探讨HP产毒菌感染与胃十二指肠疾病的关系。
1 对象和方法
1.1 对象
1997年4月至1998年7月在我院接受胃镜检查的患者1 674例,其中男904例(54%),女770例(46%)。男∶女=1.17∶1。年龄15～84岁,平均年龄(42.69±15.42)岁。其中活动期十二指肠溃疡(DU,A1或A2期)210例,活动期胃溃疡(GU,A1或A2期)70例、胃癌(GC)64例、慢性胃炎(CG)1 330例。所有患者均未经系统抗溃疡及抗HP治疗。另选同期献血员100例作为健康对照组。
, 百拇医药
1.2 方法
标本采集:每例患者于胃镜检查时取距幽门5 cm区域内胃窦粘膜组织，分别做快速尿素酶试验(CLO)、组织学检查(Giemsa染色)和PCR反应。同期抽取静脉血2 mL,自然凝固后分离血清,置-20 ℃冰箱保存备用。
CagA抗体测定:试剂由上海晶莹技术有限公司提供,抗原表达区选自多株国内流行株HP-CagA 2766～3466基因片断。经测序与国际标准株同源性达70.4%,临床预试验敏感性为90%,特异性为95.5%。实验按要求加入待检血清、阳性和阴性对照血清各0.1 mL,设空白对照。于37 ℃作用60 min,洗板完全后,加二抗体,置于37 ℃反应40 min,再洗板。各孔加入底物液A和B各0.1 mL,避光显色15 min,加终止液终止反应。用伯乐550酶标仪测定各孔OD值，阳性与阴性血清OD之差>0.5为试验有效。以阴性血清双孔平均OD值±0.3作为判断值,小于此值为阴性,反之为阳性。
, 百拇医药
PCR:选择互补于HP16SrRNA基因片段的种特异性引物进行PCR扩增,引物序列为5'GAC-CTC-TCT-GAT-TCG-GGA-GG3'和5'TAA-TGA-CTG-CGA-CTA-ACA-CG3'。整块胃粘摸标本直接以蛋白酶K法粗提,于94 ℃ 40 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 50 s,循环35次,最后1个循环延长5 min。产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离,紫外灯下观察结果,于约109 bp处出现明显条带,边缘整齐,亮度较强者为阳性。
Giemsa染色：胃粘膜标本用10%甲醛固定,连续切片,改良Giemsa染色辨认HP,HE染色做病理学诊断。
CLO(三强生物公司试剂)检测:新鲜胃粘膜标本埋于试剂中3 min,试剂变红为阳性。
统计学方法：χ2检验。
2 结果
, 百拇医药
HP检出率:经PCR、Giemsa染色和CLO检测,以2项或2项以上阳性定为HP感染,疾病组HP的总检出率为64.87%,详见表1。
血清CagA抗体检出率:HP感染组为70.17%(762/1 086),显著高于非感染组的11.90%( 70/588，P<0.01)。疾病组总检出率为49.70%,明显高于健康组的38%(P<0.05)。其中DU为81.90%,显著高于GU、GC和CG组(P<0.01),后3组各组间及其与健康组间比较均无差异(表1)。
表1 各种疾病HP及CagA抗体检出率 组别
n
HP
CagA抗体
阳性例数(所占百分数/%)
, 百拇医药
健康组
100
-
38(38.00)
DU
210
195(92.86)
172(81.90)*
GU
70
46(65.71)
33(47.14)
, 百拇医药
GC
64
37(57.81)
26(40.63)
CG
1 330
808(60.75)
601(45.19)
* 与健康组和GU、GC、CG比较P<0.01
CagA抗体与炎症类型及程度的关系: 依据CG的病理学诊断标准[1],显示血清CagA抗体检出率随炎症由轻至重呈递增性增加; 粘膜活动性炎症明显高于非活动性炎症(表2、3)。
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表2 抗-CagA与慢性胃炎炎症程度的关系 炎症程度
n
HP
CagA抗体
阳性例数(所占百分数/%)
轻度
616
266(43.18)
180(29.22)
中度
544
390(71.69)
, 百拇医药
301(55.33)*
重度
170
152(89.41)
120(70.59)**
合计
1 330
808(60.75)
601(45.19)
与轻度组比较* P<0.05；**P<0.01
CagA抗体与胃癌及癌前病变的关系：GC、慢性萎缩性胃炎(CAG)、肠上皮化生(IM)及非典型性增生(AH)的血清抗-CagA阳性率与健康组比较无显著性差异(表4)。
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表3 CagA抗体检出率与炎症活动与否的关系 分类
n
HP
CagA抗体
阳性例数(所占百分数/%)
活动组
538
487(90.52)
432(80.29)*
非活动组
792
321(40.53)
, 百拇医药
169(21.34)
合计
1 330
808(60.75)
601(45.19)
* 与非活动组比较P<0.01表4 CagA抗体检出率与胃癌及癌前病变的关系 组别
n
HP
CagA抗体
阳性例数(所占百分数/%)
健康组
100
, http://www.100md.com
38(38.00)
GC
64
37(57.81)
26(40.63)
CAG
48
26(54.17)
20(41.67)
IM
172
98(56.98)
, 百拇医药 70(40.70)
AH
36
18(50.00)
13(36.11)
3 讨论
HP可分为2种类型[2],Ⅰ型表达CagA蛋白,有毒素活性，致病力强, 感染后多引起胃粘膜较严重的损伤;Ⅱ型不表达CagA蛋白,无毒素活性,感染后无症状或引起慢性浅表性胃炎。判断HP菌株类型,有助于对胃十二指肠疾病的诊断及治疗方案的确定。
CagA存在于60%～80%的HP菌中[3],被认为是HP的毒力因子及HP毒力菌株的标志之一。本研究显示，大于80%DU患者血清抗-CagA阳性。同时发现,CagA抗体阳性率随粘膜炎症病变程度的加重而增加,提示CagA阳性菌株参与粘膜急、慢性损伤和活动性炎症过程。其原因可能与具有CagA阳性的HP菌株诱导炎性因子、介导白介素8(IL-8),促进中性粒细胞活化和趋化有关[4]。
, 百拇医药
研究证实[5，6]，具有CagA基因的HP感染者发展成萎缩性胃炎及胃癌的危险性是CagA阴性菌株的2倍;胃癌高发区人群CagA抗体检出率显著高于低发区人群;年龄低于50岁的胃癌患者血清CagA识别率明显高于对照组。但在本研究中,血清抗-CagA检出率在GC和各类癌前病变均无显著增加,可能与区域间CagA抗原的多样性有关。本研究血清CagA抗体检出率HP感染组(70.17%)显著高于非感染组(11.90%),提示该方法可在一定程度上反应体内产毒素HP菌株感染的情况。本研究还发现健康人CagA阳性HP菌株感染率也较高,提示胃癌是一个多因素的疾病,高毒株HP感染不是胃癌发生的唯一因素。总之,HP毒力菌株感染与十二指肠溃疡及胃粘膜中、重度慢性活动性炎症相关,与胃癌和癌前病变关系不密切。用血清学方法检测HP CagA抗体简便、无创、价廉,临床上可作为诊断HP产毒菌株感染和判断损伤程度的指标,但不独立用作区分HP致癌菌株的标志。
参考文献
, 百拇医药 1，董郡. 病理学.第2版.北京：人民卫生出版社,1996.12
2，Xiang Z, Censini S, Bayeli P F, et al. Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter pylori reveals that clinical isolates can be divided into two major types and that CagA is not necessary for expression of the vacuolating cytotoxin. Infect Immun, 1995, 63: 94
3，Tummuru M K R, Cover T L, Blaser M J, et al. Cloning and expression of a high-molecular-massmalor antigen Helicobacter pylori: Evidence of linkage to cytotoxin production. Infect Immun,1993, 61: 1799
, 百拇医药
4，Crabtree J E, Farmery S M, Lindley I J D,et al. CagA/cytotoxic strains of Helicobacter pylori and interleukin-8 in gastric epithelial cell lines.J Clin Pathol,1994,47:945
5，Romaozinho J M, Souto P, Rodriguces V L, et al.Sera prevalence of antibodies to CagA and VacA proleins versus gastric cancer risk. Gut, 1996,39(S2):A81
6，Klamas K, Held M, Wadstrom T,et al. IgG immune response to Helicobacter pylori antigens in patients with gastric cancer as defined by ELISA and immunoblotting. Int J Cancer,1996, 67:1
收稿日期：1999-08-17, http://www.100md.com