台盼蓝染色与FDA/PI双染色对检测肝细胞活率的评价
作者：张先杰 李铎 孙海晨 李非 孙家邦
单位：(首都医科大学宣武医院普通外科)
关键词：
首都医科大学学报000332 台盼蓝排除试验是最常用的检测细胞活率的方法，但有文献报道其并不能准确反映肝细胞的存活情况。分离的肝细胞在用于病人治疗前，必须有1个精确迅速的检测肝细胞活率的方法。我们采用FDA/PI(荧光二乙脂/碘丙啶)双染，应用流式细胞仪，可迅速精确地检测肝细胞活率。
1 材料和方法
SD大鼠(首都医科大学动物室)10只，体质量200～250 g，雌雄不限。
FDA、PI、台盼蓝均购自Sigma公司。肝灌注缓冲液Ⅰ：Hepes 10 mmol/L(Sigma公司)，NaCl 137 mmol/L，KCl 2.68 mmol/L，Na2HPO4*12H2O 0.7 mmol/L，EGTA 1 g(Server公司)，葡萄糖10 mmol/L，加入酚红指示剂，调pH值7.45。肝灌注缓冲液Ⅱ：缓冲液Ⅰ配方去掉EGTA 1 g，加CaCl2 5 mmol/L，加酚红指示剂，调pH值7.45，加入0.04%胶原酶。PBS液：Na2HPO4*12H2O 8.1 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L。
实验步骤：①鼠肝细胞的分离：具体分离过程见文献[1]。②台盼蓝(0.4%)染色检测肝细胞活率。③FDA/PI双染流式细胞仪检测细胞活率：将FDA溶于丙酮中成5 g/L的储备液，置-20 ℃备用。FDA工作液为上述储备液用PBS稀释至5 mg/L而成。PI工作液的浓度为32 mmol/L。将106个肝细胞悬浮于0.25 mL FDA工作液中，37 ℃、5 min，加PBS至0.5 mL。用流式细胞仪以488 nm激发波长、200 mV能量检测。台盼蓝染色与FDA/PI双染结果之间用配对t检验做显著性检验。
2 结果和讨论
分离10只大鼠肝细胞悬液，细胞活率：台盼蓝排除试验为(93.70±3.50)%，FDA/PI双染为(90.51±3.47)%，n=9，P<0.05(配对t检验)，2种方法有显著性差异。FDA/PI双染流式细胞仪测定的细胞活率明显低于台盼蓝排除试验，即FDA/PI双染色测定细胞活率比台盼蓝染色更精确。
台盼蓝排除试验是最常用的检测细胞活率的方法，但有文献报道其并不能准确反映肝细胞的存活情况。分离的肝细胞在用于病人治疗前，必须有1个精确快速的检测肝细胞活率的方法。FDA是1种非荧光的化合物。在健康细胞内，FDA通过细胞酯转变为荧光素而显示绿色荧光。PI可穿透死细胞的细胞膜，产生红色荧光。我们的试验结果显示，FDA/PI双染流式细胞仪测定的细胞活率低于台盼蓝排除试验，能迅速精确地检测肝细胞活率。而且在无流式细胞仪时，FDA/PI双染测定肝细胞活率可在一定波长激光激发下，用荧光显微镜观察[2]，方法简便。
参考文献
1，孙海晨,李铎,孙家邦,等.改良原位二部法门脉胶原酶灌注分离单肝细胞.首都医科大学学报,1998,19(1):65～66
2，Nyberg S L, Shatford R A, Payne W D, et al. Stain with fluorescein diacetate correlates with hepatocyte function. Biotech Histochem, 1993,68:56
收稿日期：2000-03-06, 百拇医药
单位：(首都医科大学宣武医院普通外科)
关键词：
首都医科大学学报000332 台盼蓝排除试验是最常用的检测细胞活率的方法，但有文献报道其并不能准确反映肝细胞的存活情况。分离的肝细胞在用于病人治疗前，必须有1个精确迅速的检测肝细胞活率的方法。我们采用FDA/PI(荧光二乙脂/碘丙啶)双染，应用流式细胞仪，可迅速精确地检测肝细胞活率。
1 材料和方法
SD大鼠(首都医科大学动物室)10只，体质量200～250 g，雌雄不限。
FDA、PI、台盼蓝均购自Sigma公司。肝灌注缓冲液Ⅰ：Hepes 10 mmol/L(Sigma公司)，NaCl 137 mmol/L，KCl 2.68 mmol/L，Na2HPO4*12H2O 0.7 mmol/L，EGTA 1 g(Server公司)，葡萄糖10 mmol/L，加入酚红指示剂，调pH值7.45。肝灌注缓冲液Ⅱ：缓冲液Ⅰ配方去掉EGTA 1 g，加CaCl2 5 mmol/L，加酚红指示剂，调pH值7.45，加入0.04%胶原酶。PBS液：Na2HPO4*12H2O 8.1 mmol/L，KH2PO4 1.2 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L。
实验步骤：①鼠肝细胞的分离：具体分离过程见文献[1]。②台盼蓝(0.4%)染色检测肝细胞活率。③FDA/PI双染流式细胞仪检测细胞活率：将FDA溶于丙酮中成5 g/L的储备液，置-20 ℃备用。FDA工作液为上述储备液用PBS稀释至5 mg/L而成。PI工作液的浓度为32 mmol/L。将106个肝细胞悬浮于0.25 mL FDA工作液中，37 ℃、5 min，加PBS至0.5 mL。用流式细胞仪以488 nm激发波长、200 mV能量检测。台盼蓝染色与FDA/PI双染结果之间用配对t检验做显著性检验。
2 结果和讨论
分离10只大鼠肝细胞悬液，细胞活率：台盼蓝排除试验为(93.70±3.50)%，FDA/PI双染为(90.51±3.47)%，n=9，P<0.05(配对t检验)，2种方法有显著性差异。FDA/PI双染流式细胞仪测定的细胞活率明显低于台盼蓝排除试验，即FDA/PI双染色测定细胞活率比台盼蓝染色更精确。
台盼蓝排除试验是最常用的检测细胞活率的方法，但有文献报道其并不能准确反映肝细胞的存活情况。分离的肝细胞在用于病人治疗前，必须有1个精确快速的检测肝细胞活率的方法。FDA是1种非荧光的化合物。在健康细胞内，FDA通过细胞酯转变为荧光素而显示绿色荧光。PI可穿透死细胞的细胞膜，产生红色荧光。我们的试验结果显示，FDA/PI双染流式细胞仪测定的细胞活率低于台盼蓝排除试验，能迅速精确地检测肝细胞活率。而且在无流式细胞仪时，FDA/PI双染测定肝细胞活率可在一定波长激光激发下，用荧光显微镜观察[2]，方法简便。
参考文献
1，孙海晨,李铎,孙家邦,等.改良原位二部法门脉胶原酶灌注分离单肝细胞.首都医科大学学报,1998,19(1):65～66
2，Nyberg S L, Shatford R A, Payne W D, et al. Stain with fluorescein diacetate correlates with hepatocyte function. Biotech Histochem, 1993,68:56
收稿日期：2000-03-06, 百拇医药