鼠胚脑皮质及海马神经元原代培养方法的改进
作者：孙海梅 季凤清 赵天德 岳旭 郭崇洁
单位：孙海梅 季凤清 郭崇洁(首都医科大学组织胚胎学教研室)；赵天德 岳旭(中日友好医院临床研究所细胞生物室)
关键词：
首都医科大学学报000317 神经细胞原代培养是研究神经细胞的重要手段之一[1，2]。传统方法是将神经细胞与神经胶质细胞混合培养，因此无法满足在单一神经细胞培养基础上进行研究的需要。1998年10月至1999年9月，我们对传统混合培养方法在取材、消化、温度、机械操作等方面进行控制和改进，得到了比较满意的相对单一的神经细胞培养物和单神经细胞网络，为进一步开展神经生物学研究提供了相对稳定的体外模型。
1 材料和方法
实验动物：取妊娠15～18 d Wistar大鼠(中国医学科学院动物繁育场)的胚胎大脑皮质及海马进行原代培养。
, 百拇医药
培养液成分：DMEM培养基(GIBICO)，右旋葡萄糖5 g/L，谷氨酰胺3 mg/L，NaHCO3 3.7 g/L，青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL，Hepes 25 g/L，10%胎牛血清(Hyclon)，10%马血清(Hyclon)。
培养器皿的预处理：采用35 mm孔径的6孔聚乙烯培养板(Sigma)或35 mm的塑料培养皿。在器皿内铺洒左旋多聚赖氨酸(Sigma)作支持物，其质量浓度为0.1 g/L(用无钙镁的Dulbecco缓冲液配制)[3] 。24 h后倾去，换D-PBS缓冲液(为加有右旋葡萄糖的PBS，0.1 mol/L,pH 7.4，无Ca2+、Mg2+)浸洗，倾去，最后用DMEM液浸洗后备用。
培养方法：无菌操作取出大鼠子宫，置于D-PBS中浸洗2～3次，以洗去血液。剪开羊膜取胚胎置D-PBS中。取鼠胚大脑双侧皮质及海马置DMEM中，轻轻剔除脑膜及血管后，用DMEM清洗1次。剪碎脑组织(以上步骤均在冰上进行)。用0.125%胰酶消化，置37 ℃，5%CO2培养箱中15 min，中间振摇1次，15 min后用冷的含有10%胎牛血清的DMEM终止胰酶反应。过150目不锈钢筛网1次，用少量含有10%胎牛血清、10%马血清的DMEM种植液冲洗筛网。胎盘蓝染色进行死活细胞计数，以1×106/孔细胞数种植。细胞培养于37 ℃、5%CO2培养箱内。24 h后全量换液，培养液为加有10%马血清的DMEM液(此培养液中若再加有1%N2，2%B27神经营养因子效果更佳)。以后每3 d半量换液1次，相差显微镜定期观察培养过程中活细胞的分化情况。
, 百拇医药
2 结果和讨论
种植1 h后即有细胞贴壁，1～2 h在少数细胞可观察到突起，细胞分散，单一，很少有聚集成团的现象，细胞呈圆形或椭圆形，胞体发亮，周边可见明显光晕，说明细胞活性很好。24 h后，大部分细胞贴壁，生长旺盛，很多细胞伸出较长突起。培养2～3 d后，细胞突起增多伸长，有双极或多极突起，胞体发亮，周边有光晕，细胞多呈纺锤形。培养6～7 d后，神经细胞生长更加旺盛，胞体增大，呈锥体形，突起增多伸长，且分支很多，粗大，突起交织成网状，形成神经细胞网络(图1)。培养10 d以后，神经细胞的分化更加成熟。20 d后细胞开始退化变性。
传统的培养方法在神经细胞生长同时神经胶质细胞也活跃增生，致使神经细胞难以辨认和分离(图2)。多年来人们一直探讨一种单一神经元生长的神经组织培养方法。有人从选取材料入手，取15～18 d的大鼠胚胎、新生24 h的乳鼠及6～8 d鸡胚的大脑神经细胞[4]。有人在培养时选用鼠尾胶原或多聚赖氨酸作支持物[5,6] 。有人采用抗有丝分裂的药物阿糖胞苷、氟尿嘧啶等来抑制胶质细胞生长[7]。这些方法虽对神经细胞培养效果有不同程度的改善，但仍有神经胶质细胞的干扰，且抑制胶质细胞的药物也同时抑制神经细胞的生长。
, 百拇医药
图1 改良方法培养的神经细胞光镜照片 培养出的神经细胞相对单一，活力好，胶质细胞数目少神经细胞
图2 传统方法培养的神经细胞光镜照片 胶质细胞生长旺盛，胞体大、扁平、暗黑、突起粗大，铺衬于神经细胞下面，使神经细胞很难与其分开，神经细胞生长状态不佳 为神经细胞，为胶质细胞
我们的培养方法具有以下优点：①神经细胞取自妊娠15～18 d大鼠胚胎脑组织，在神经系统早期发育过程中神经元的增生发生于胚胎时期，而动物出生之后神经元很少分裂。其次，胚胎动物神经元形态学分化与化学分化程度较低，体外存活能力强，而动物出生后，神经元分化程度高，神经突起发育成熟，若从成熟神经组织分离神经元会使神经元受到更大更普遍的损伤[8]。②严格控制胰酶的量和消化时间，既要使之消化充分，又不能使脑组织受到损伤。本方法采用冰处理过的含有血清的DMEM液适时终止胰酶反应，同时采用不锈钢筛网进行机械分离，增强了分离效果。③此种方法不需使用抑制胶质细胞的药物，减少药物对神经细胞的损伤，使神经细胞生长更接近于体内自然环境。改进后的培养物以神经细胞为主，胶质细胞相对很少。为了弥补胶质细胞少而对神经细胞支持营养作用的不足，我们在种植细胞24 h后加入了神经营养因子N2、B27。④由于减少原有方法中吹打、离心等步骤[9]，取材中注意要快且动作轻柔，剔除脑膜的器械要尖细，在消化前尽量将组织剪碎，使之消化充分。⑤整个取材过程在冰上进行，更好的保持了细胞活力。种植1～2 h即可观察到神经细胞有突起出现，且胞体明亮，光晕明显，细胞分化快而好。
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用此种方法较成功的获得了相对单一的神经细胞培养物，神经细胞纯度达到90%以上，可见单神经细胞网络。
参考文献
1，洪庆涛，唐一鹏.新生大鼠大脑皮层神经细胞的体外原代培养.神经解剖学杂志，1994，10(3)：259～262
2，华明，吴希如.大鼠胚胎大脑皮层神经细胞原代分离培养方法. 北京医科大学学报，1986，18(4)：288
3，方健秋，赵天德，高福云，等.用微环境小室培养相对单一的海马原代神经细胞.中日友好医院学报，1995，9(3)：131～133
4，江凌晓，封志纯.神经细胞原代培养及某些物质对其的影响.国外医学儿科学分册，1998，25(3)：124～127
, 百拇医药 5，Letourneau P C.Possibie roles for cell-to-substratum adhesion in neuronal morphogenesis.Dev Biol,1975,44:77
6，Yavin E,Yavin Z.Attachment and culture of dissociated cells from rat embryo cerebral hemispheres on polylysine-coated surface.J Cell Biol,1974,62:540
7，丁爱石，王福庄.新生大鼠海马神经元在无血清培养液中的生长特性.细胞生物学杂志，1993，15(2)：88
8，薛庆善，冯武鸣.神经组织的体外培养方法.解剖科学进展.1996，2(4)：349～355
9，杨燕玲,郭勇.适于电生理研究的新生大鼠神经细胞简易培养方法.解剖科学进展，1998，4(3)：272
收稿日期：1999-09-30, 百拇医药
单位：孙海梅 季凤清 郭崇洁(首都医科大学组织胚胎学教研室)；赵天德 岳旭(中日友好医院临床研究所细胞生物室)
关键词：
首都医科大学学报000317 神经细胞原代培养是研究神经细胞的重要手段之一[1，2]。传统方法是将神经细胞与神经胶质细胞混合培养，因此无法满足在单一神经细胞培养基础上进行研究的需要。1998年10月至1999年9月，我们对传统混合培养方法在取材、消化、温度、机械操作等方面进行控制和改进，得到了比较满意的相对单一的神经细胞培养物和单神经细胞网络，为进一步开展神经生物学研究提供了相对稳定的体外模型。
1 材料和方法
实验动物：取妊娠15～18 d Wistar大鼠(中国医学科学院动物繁育场)的胚胎大脑皮质及海马进行原代培养。
, 百拇医药
培养液成分：DMEM培养基(GIBICO)，右旋葡萄糖5 g/L，谷氨酰胺3 mg/L，NaHCO3 3.7 g/L，青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL，Hepes 25 g/L，10%胎牛血清(Hyclon)，10%马血清(Hyclon)。
培养器皿的预处理：采用35 mm孔径的6孔聚乙烯培养板(Sigma)或35 mm的塑料培养皿。在器皿内铺洒左旋多聚赖氨酸(Sigma)作支持物，其质量浓度为0.1 g/L(用无钙镁的Dulbecco缓冲液配制)[3] 。24 h后倾去，换D-PBS缓冲液(为加有右旋葡萄糖的PBS，0.1 mol/L,pH 7.4，无Ca2+、Mg2+)浸洗，倾去，最后用DMEM液浸洗后备用。
培养方法：无菌操作取出大鼠子宫，置于D-PBS中浸洗2～3次，以洗去血液。剪开羊膜取胚胎置D-PBS中。取鼠胚大脑双侧皮质及海马置DMEM中，轻轻剔除脑膜及血管后，用DMEM清洗1次。剪碎脑组织(以上步骤均在冰上进行)。用0.125%胰酶消化，置37 ℃，5%CO2培养箱中15 min，中间振摇1次，15 min后用冷的含有10%胎牛血清的DMEM终止胰酶反应。过150目不锈钢筛网1次，用少量含有10%胎牛血清、10%马血清的DMEM种植液冲洗筛网。胎盘蓝染色进行死活细胞计数，以1×106/孔细胞数种植。细胞培养于37 ℃、5%CO2培养箱内。24 h后全量换液，培养液为加有10%马血清的DMEM液(此培养液中若再加有1%N2，2%B27神经营养因子效果更佳)。以后每3 d半量换液1次，相差显微镜定期观察培养过程中活细胞的分化情况。
, 百拇医药
2 结果和讨论
种植1 h后即有细胞贴壁，1～2 h在少数细胞可观察到突起，细胞分散，单一，很少有聚集成团的现象，细胞呈圆形或椭圆形，胞体发亮，周边可见明显光晕，说明细胞活性很好。24 h后，大部分细胞贴壁，生长旺盛，很多细胞伸出较长突起。培养2～3 d后，细胞突起增多伸长，有双极或多极突起，胞体发亮，周边有光晕，细胞多呈纺锤形。培养6～7 d后，神经细胞生长更加旺盛，胞体增大，呈锥体形，突起增多伸长，且分支很多，粗大，突起交织成网状，形成神经细胞网络(图1)。培养10 d以后，神经细胞的分化更加成熟。20 d后细胞开始退化变性。
传统的培养方法在神经细胞生长同时神经胶质细胞也活跃增生，致使神经细胞难以辨认和分离(图2)。多年来人们一直探讨一种单一神经元生长的神经组织培养方法。有人从选取材料入手，取15～18 d的大鼠胚胎、新生24 h的乳鼠及6～8 d鸡胚的大脑神经细胞[4]。有人在培养时选用鼠尾胶原或多聚赖氨酸作支持物[5,6] 。有人采用抗有丝分裂的药物阿糖胞苷、氟尿嘧啶等来抑制胶质细胞生长[7]。这些方法虽对神经细胞培养效果有不同程度的改善，但仍有神经胶质细胞的干扰，且抑制胶质细胞的药物也同时抑制神经细胞的生长。
, 百拇医药
图1 改良方法培养的神经细胞光镜照片 培养出的神经细胞相对单一，活力好，胶质细胞数目少神经细胞
图2 传统方法培养的神经细胞光镜照片 胶质细胞生长旺盛，胞体大、扁平、暗黑、突起粗大，铺衬于神经细胞下面，使神经细胞很难与其分开，神经细胞生长状态不佳 为神经细胞，为胶质细胞
我们的培养方法具有以下优点：①神经细胞取自妊娠15～18 d大鼠胚胎脑组织，在神经系统早期发育过程中神经元的增生发生于胚胎时期，而动物出生之后神经元很少分裂。其次，胚胎动物神经元形态学分化与化学分化程度较低，体外存活能力强，而动物出生后，神经元分化程度高，神经突起发育成熟，若从成熟神经组织分离神经元会使神经元受到更大更普遍的损伤[8]。②严格控制胰酶的量和消化时间，既要使之消化充分，又不能使脑组织受到损伤。本方法采用冰处理过的含有血清的DMEM液适时终止胰酶反应，同时采用不锈钢筛网进行机械分离，增强了分离效果。③此种方法不需使用抑制胶质细胞的药物，减少药物对神经细胞的损伤，使神经细胞生长更接近于体内自然环境。改进后的培养物以神经细胞为主，胶质细胞相对很少。为了弥补胶质细胞少而对神经细胞支持营养作用的不足，我们在种植细胞24 h后加入了神经营养因子N2、B27。④由于减少原有方法中吹打、离心等步骤[9]，取材中注意要快且动作轻柔，剔除脑膜的器械要尖细，在消化前尽量将组织剪碎，使之消化充分。⑤整个取材过程在冰上进行，更好的保持了细胞活力。种植1～2 h即可观察到神经细胞有突起出现，且胞体明亮，光晕明显，细胞分化快而好。
, 百拇医药
用此种方法较成功的获得了相对单一的神经细胞培养物，神经细胞纯度达到90%以上，可见单神经细胞网络。
参考文献
1，洪庆涛，唐一鹏.新生大鼠大脑皮层神经细胞的体外原代培养.神经解剖学杂志，1994，10(3)：259～262
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8，薛庆善，冯武鸣.神经组织的体外培养方法.解剖科学进展.1996，2(4)：349～355
9，杨燕玲,郭勇.适于电生理研究的新生大鼠神经细胞简易培养方法.解剖科学进展，1998，4(3)：272
收稿日期：1999-09-30, 百拇医药