HPLC法测定何首乌及复方虫草胶囊中大黄素、大黄素甲醚的含量
作者：杨东辉 蔡少青 王璇 魏璐雪
单位：杨东辉 蔡少青 王璇(北京医科大学药学院 100083)；魏璐雪(北京中医药大学中药学院)
关键词：何首乌；复方虫草胶囊；大黄素；大黄素甲醚
中草药000309摘 要 采用HPLC法测定了何首乌及含首乌制剂复方虫草胶囊中游离及结合型大黄素、大黄素甲醚的含量。色谱柱：Waters型C18柱(10 μm，250 mm×4.6 mm)；检测波长：254 nm；流动相：甲醇-水-磷酸(850∶150∶1)；流速：1 mL/min。方法简便易行，结果准确，重现性好，可有效地控制生药及其制剂的质量。
Determination of Emodin and Physcion in Capsules of Tuber Fleeceflower (Polygonum multiflorum) and Its Complex Prescription with Cordycep by HPLC
, http://www.100md.com
Yang Donghui,Cai Shaoqing and Wang Xuan
(College of Pharmacy,Beijing University of Medical Sciences Beijing 100083)
Wei Luxue
(College of Chinese Materia Medica,Beijing University of TCM and Chinese Materia Medica)
Abstract Free and combined emodin and physcion in capsules of Polygonum multiflorum Thunb.and its complex prescription with cordycep were determined by HPLC.The chromatographic conditions adopted were:Waters C18 column (250 mm×4.6 mm,10 μm); detection wavelength,254 nm; mobile phase,methanol-water-phosphoric acid (850∶150∶1); flow rate,1 mL/min.The results showed that this method is simple,easy and reliable.
, 百拇医药
Key words Polygonum multiflorum Thunb.Fufangchongcao Capsule emodin physcion▲
复方虫草胶囊由冬虫夏草、何首乌、黄花败酱、灵芝及清半夏五味中药组成，为国家科委新药基金资助项目，是针对慢性疲劳综合征[1]而研制的。主要功效为润肺养肝益肾、理气化湿和络。主治因肺、肝、肾气阴不足，气滞湿阻，脉络不和所致的胸闷气短、疲劳倦怠、腰膝酸软、失眠健忘、性功能减退、易患感冒及咽炎等症。何首乌为方中君药。为控制原药材及该制剂的质量，我们采用HPLC法分别测定了何首乌及复方虫草胶囊中游离大黄素、大黄素甲醚和结合大黄素、大黄素甲醚的含量。
1 仪器与试药
HP1050液相色谱仪(美国惠普公司)；二极管阵列检测器(DAD)；HP1050/WIN-3D化学工作站。自制大黄素、大黄素甲醚对照品；何首乌及复方虫草胶囊由北京中医药大学实验药厂提供，何首乌Polygonum multiflorum Thunb.经北京中医药大学闫玉凝教授鉴定。试剂均为分析纯，水为双蒸水。
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2 方法与结果
2.1 HPLC条件：色谱柱：Waters型C18柱(10 μm，250 mm×4.6 mm)；检测波长：254 nm；流动相：甲醇-水-磷酸(850∶150∶1)；流速：1 mL/min。
2.2 标准曲线的制备：精密称取大黄素及大黄素甲醚对照品，分别用甲醇配成0.12 mg/mL(大黄素)和0.06 mg/mL(大黄素甲醚)的对照品溶液。按HPLC条件，分别吸取大黄素和大黄素甲醚对照品溶液5.0，10.0，15.0，17.5，20.0 μL，注入液相色谱仪，测定各峰面积积分值。以进样量对峰面积作图，得到大黄素和大黄素甲醚的标准曲线，其回归方程为：Y大黄素=-1.48+1 813.57X，r=0.999 6；Y大黄素甲醚=-19.61+2 197.56X，r=0.999 7。大黄素在0.6～2.4 μg范围与大黄素甲醚在0.3～1.2 μg范围内均呈良好的线性关系。
, 百拇医药
2.3 提取条件的选择：称取复方虫草胶囊样品4份，每份0.50 g，分别加入25.0 mL甲醇溶液，超声提取30，45，60，90 min。过滤，弃去初滤液，取续滤液10.0 mL，浓缩至5.0 mL，微孔滤膜过滤，滤液作为供试品液。分别吸取各供试品液20.0 μL，进样分析(见表1)。由表1可见，复方虫草胶囊用甲醇超声提取30 min，大黄素、大黄素甲醚的峰面积值即不再增加。因此，我们选择用甲醇超声30 min的方法提取样品中的蒽醌类成分。
表1 复方虫草胶囊样品不同提取时间
大黄素和大黄素甲醚的峰面积 提取时间(min)
30
45
60
90
, 百拇医药
大黄素
1 381.84
1 328.15
1 325.30
1 380.48
大黄素甲醚
946.73
942.07
921.00
925.21
2.4 供试品液的制备：参考大岛俊幸等的研究方法[1]，直接测定同一样品中结合型和游离型蒽醌的含量。方法：取何首乌及复方虫草胶囊粉各0.50 g，加入25.0 mL甲醇超声提取30 min。过滤，残留物再用甲醇5 mL洗涤2次，合并滤液。将滤液蒸干，加入10 mL水使溶解，分别用10.0 mL氯仿萃取3次，合并氯仿萃取液，蒸干，加入5.0 mL甲醇溶解定容，微孔滤膜过滤，滤液即为游离型蒽醌定量用供试品液；余下水层加浓硫酸0.5 mL和氯仿10.0 mL在70 ℃～80 ℃的水浴中回流水解2 h，冷却后取氯仿层，水层再分别用10.0 mL氯仿萃取3次，合并氯仿萃取液，蒸干，加入5.0 mL甲醇溶解定容，微孔滤膜过滤，即为结合型蒽醌定量用供试品液。
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2.5 精密度试验：吸取大黄素和大黄素甲醚对照品液各5.0 μL，重复5次进行分析，结果大黄素RSD=1.35%，大黄素甲醚RSD=0.54%(n=5)。
2.6 供试样品测定：吸取何首乌及复方虫草胶囊供试品液各20.0 μL，分别进样，测定大黄素和大黄素甲醚峰面积积分值。外标法计算含量。测定结果见图1和表2。
A-何首乌 B-复方虫草胶囊
Ⅰ-大黄素 Ⅱ-大黄素甲醚
图1 样品HPLC图
表2 何首乌及复方虫草胶囊中大黄素、大黄素甲醚的含量(n=3)
游离型(mg/g)
, 百拇医药
结合型(mg/g)
大黄素
大黄素甲醚
大黄素
大黄素甲醚
何首乌
0.60
0.10
0.37
0.04
复方虫草胶囊
2.37
0.54
, http://www.100md.com
0.34
0.06
2.7 加样回收率试验：称取已测含量的复方虫草胶囊样品3份，每份0.5 g，分别加入大黄素(0.35 mg/mL)甲醇溶液0.5，1.0，1.5 mL和大黄素甲醚(0.06 mg/mL)甲醇溶液1.0，1.5，2.0 mL。样品用25.0 mL甲醇超声提取30 min，以下操作同供试品液的制备项下游离蒽醌供试品液的制备方法。每份样品进样20.0 μL，测定大黄素、大黄素甲醚的含量，计算回收率。结果大黄素回收率为102.60%，RSD=1.24%；大黄素甲醚回收率为98.98%，RSD=1.91%(n=3)。
3 讨论
何首乌中的有效成分之一为蒽醌类化合物。药理实验表明，蒽醌苷能促进肠蠕动，抑制甘油三酯和胆固醇在肠道的吸收，从而起到降血脂的作用[2]。游离蒽醌具有抗肿瘤[3，4]、促进钙吸收[5]、抗菌[6]等作用。游离型和结合型蒽醌共存于同一药材中，但其活性不完全相同，为控制原药材及制剂的质量，笔者认为应将它们的含量分别进行测定。本文直接测定了同一样品中游离型和结合型蒽醌的含量(见表2)，可见，在何首乌中，游离型大黄素与大黄素甲醚的含量之比为6.0；结合型大黄素与大黄素甲醚的含量之比为9.3。而在复方虫草胶囊中，游离型大黄素与大黄素甲醚的含量之比为4.4；结合型大黄素与大黄素甲醚的含量之比为5.7。在何首乌与复方虫草胶囊中，两种化合物含量比例发生了变化，变化的规律与复方配伍及药效有何联系，尚待研究。■
, 百拇医药
本课题为国家科委新药基金赞助课题
杨东辉，女，28岁。1995年毕业于黑龙江中医药大学中药系，获硕士学位。同年考入北京中医药大学中药学院攻读博士学位，并于1998年获博士学位。1998年至今，于北京医科大学药学院博士后流动站生药研究室工作，主要从事中药有效成分及中药质量标准的研究。近期研究方向为复方血清药化学的研究。参加的研究工作有“长瓣金莲花化学成分的研究“、”黄花败酱化学成分的研究”、“复方虫草胶囊质量标准的研究及”、“补阳还五汤作用机制的研究”，已发表和待发表论文6篇。
参考文献
1，喻方亭.中西医结合杂志，1995，15(12)：751
2，张 洪，等.时珍国药研究，1994，6(1)：34
3，孙 阳，等.南京药学院学报，1985，16(1)：12
4，刘庆增，译.中草药，1987，18(1)：41
5，崔荣芬，等.中草药，1995，26(4)：199
6，大浦彦吉.国外医学-中医中药分册，1992，14(3)：17
(收稿日期：1999-05-06), 百拇医药
单位：杨东辉 蔡少青 王璇(北京医科大学药学院 100083)；魏璐雪(北京中医药大学中药学院)
关键词：何首乌；复方虫草胶囊；大黄素；大黄素甲醚
中草药000309摘 要 采用HPLC法测定了何首乌及含首乌制剂复方虫草胶囊中游离及结合型大黄素、大黄素甲醚的含量。色谱柱：Waters型C18柱(10 μm，250 mm×4.6 mm)；检测波长：254 nm；流动相：甲醇-水-磷酸(850∶150∶1)；流速：1 mL/min。方法简便易行，结果准确，重现性好，可有效地控制生药及其制剂的质量。
Determination of Emodin and Physcion in Capsules of Tuber Fleeceflower (Polygonum multiflorum) and Its Complex Prescription with Cordycep by HPLC
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Yang Donghui,Cai Shaoqing and Wang Xuan
(College of Pharmacy,Beijing University of Medical Sciences Beijing 100083)
Wei Luxue
(College of Chinese Materia Medica,Beijing University of TCM and Chinese Materia Medica)
Abstract Free and combined emodin and physcion in capsules of Polygonum multiflorum Thunb.and its complex prescription with cordycep were determined by HPLC.The chromatographic conditions adopted were:Waters C18 column (250 mm×4.6 mm,10 μm); detection wavelength,254 nm; mobile phase,methanol-water-phosphoric acid (850∶150∶1); flow rate,1 mL/min.The results showed that this method is simple,easy and reliable.
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Key words Polygonum multiflorum Thunb.Fufangchongcao Capsule emodin physcion▲
复方虫草胶囊由冬虫夏草、何首乌、黄花败酱、灵芝及清半夏五味中药组成，为国家科委新药基金资助项目，是针对慢性疲劳综合征[1]而研制的。主要功效为润肺养肝益肾、理气化湿和络。主治因肺、肝、肾气阴不足，气滞湿阻，脉络不和所致的胸闷气短、疲劳倦怠、腰膝酸软、失眠健忘、性功能减退、易患感冒及咽炎等症。何首乌为方中君药。为控制原药材及该制剂的质量，我们采用HPLC法分别测定了何首乌及复方虫草胶囊中游离大黄素、大黄素甲醚和结合大黄素、大黄素甲醚的含量。
1 仪器与试药
HP1050液相色谱仪(美国惠普公司)；二极管阵列检测器(DAD)；HP1050/WIN-3D化学工作站。自制大黄素、大黄素甲醚对照品；何首乌及复方虫草胶囊由北京中医药大学实验药厂提供，何首乌Polygonum multiflorum Thunb.经北京中医药大学闫玉凝教授鉴定。试剂均为分析纯，水为双蒸水。
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2 方法与结果
2.1 HPLC条件：色谱柱：Waters型C18柱(10 μm，250 mm×4.6 mm)；检测波长：254 nm；流动相：甲醇-水-磷酸(850∶150∶1)；流速：1 mL/min。
2.2 标准曲线的制备：精密称取大黄素及大黄素甲醚对照品，分别用甲醇配成0.12 mg/mL(大黄素)和0.06 mg/mL(大黄素甲醚)的对照品溶液。按HPLC条件，分别吸取大黄素和大黄素甲醚对照品溶液5.0，10.0，15.0，17.5，20.0 μL，注入液相色谱仪，测定各峰面积积分值。以进样量对峰面积作图，得到大黄素和大黄素甲醚的标准曲线，其回归方程为：Y大黄素=-1.48+1 813.57X，r=0.999 6；Y大黄素甲醚=-19.61+2 197.56X，r=0.999 7。大黄素在0.6～2.4 μg范围与大黄素甲醚在0.3～1.2 μg范围内均呈良好的线性关系。
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2.3 提取条件的选择：称取复方虫草胶囊样品4份，每份0.50 g，分别加入25.0 mL甲醇溶液，超声提取30，45，60，90 min。过滤，弃去初滤液，取续滤液10.0 mL，浓缩至5.0 mL，微孔滤膜过滤，滤液作为供试品液。分别吸取各供试品液20.0 μL，进样分析(见表1)。由表1可见，复方虫草胶囊用甲醇超声提取30 min，大黄素、大黄素甲醚的峰面积值即不再增加。因此，我们选择用甲醇超声30 min的方法提取样品中的蒽醌类成分。
表1 复方虫草胶囊样品不同提取时间
大黄素和大黄素甲醚的峰面积 提取时间(min)
30
45
60
90
, 百拇医药
大黄素
1 381.84
1 328.15
1 325.30
1 380.48
大黄素甲醚
946.73
942.07
921.00
925.21
2.4 供试品液的制备：参考大岛俊幸等的研究方法[1]，直接测定同一样品中结合型和游离型蒽醌的含量。方法：取何首乌及复方虫草胶囊粉各0.50 g，加入25.0 mL甲醇超声提取30 min。过滤，残留物再用甲醇5 mL洗涤2次，合并滤液。将滤液蒸干，加入10 mL水使溶解，分别用10.0 mL氯仿萃取3次，合并氯仿萃取液，蒸干，加入5.0 mL甲醇溶解定容，微孔滤膜过滤，滤液即为游离型蒽醌定量用供试品液；余下水层加浓硫酸0.5 mL和氯仿10.0 mL在70 ℃～80 ℃的水浴中回流水解2 h，冷却后取氯仿层，水层再分别用10.0 mL氯仿萃取3次，合并氯仿萃取液，蒸干，加入5.0 mL甲醇溶解定容，微孔滤膜过滤，即为结合型蒽醌定量用供试品液。
, http://www.100md.com
2.5 精密度试验：吸取大黄素和大黄素甲醚对照品液各5.0 μL，重复5次进行分析，结果大黄素RSD=1.35%，大黄素甲醚RSD=0.54%(n=5)。
2.6 供试样品测定：吸取何首乌及复方虫草胶囊供试品液各20.0 μL，分别进样，测定大黄素和大黄素甲醚峰面积积分值。外标法计算含量。测定结果见图1和表2。
A-何首乌 B-复方虫草胶囊
Ⅰ-大黄素 Ⅱ-大黄素甲醚
图1 样品HPLC图
表2 何首乌及复方虫草胶囊中大黄素、大黄素甲醚的含量(n=3)
游离型(mg/g)
, 百拇医药
结合型(mg/g)
大黄素
大黄素甲醚
大黄素
大黄素甲醚
何首乌
0.60
0.10
0.37
0.04
复方虫草胶囊
2.37
0.54
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0.34
0.06
2.7 加样回收率试验：称取已测含量的复方虫草胶囊样品3份，每份0.5 g，分别加入大黄素(0.35 mg/mL)甲醇溶液0.5，1.0，1.5 mL和大黄素甲醚(0.06 mg/mL)甲醇溶液1.0，1.5，2.0 mL。样品用25.0 mL甲醇超声提取30 min，以下操作同供试品液的制备项下游离蒽醌供试品液的制备方法。每份样品进样20.0 μL，测定大黄素、大黄素甲醚的含量，计算回收率。结果大黄素回收率为102.60%，RSD=1.24%；大黄素甲醚回收率为98.98%，RSD=1.91%(n=3)。
3 讨论
何首乌中的有效成分之一为蒽醌类化合物。药理实验表明，蒽醌苷能促进肠蠕动，抑制甘油三酯和胆固醇在肠道的吸收，从而起到降血脂的作用[2]。游离蒽醌具有抗肿瘤[3，4]、促进钙吸收[5]、抗菌[6]等作用。游离型和结合型蒽醌共存于同一药材中，但其活性不完全相同，为控制原药材及制剂的质量，笔者认为应将它们的含量分别进行测定。本文直接测定了同一样品中游离型和结合型蒽醌的含量(见表2)，可见，在何首乌中，游离型大黄素与大黄素甲醚的含量之比为6.0；结合型大黄素与大黄素甲醚的含量之比为9.3。而在复方虫草胶囊中，游离型大黄素与大黄素甲醚的含量之比为4.4；结合型大黄素与大黄素甲醚的含量之比为5.7。在何首乌与复方虫草胶囊中，两种化合物含量比例发生了变化，变化的规律与复方配伍及药效有何联系，尚待研究。■
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本课题为国家科委新药基金赞助课题
杨东辉，女，28岁。1995年毕业于黑龙江中医药大学中药系，获硕士学位。同年考入北京中医药大学中药学院攻读博士学位，并于1998年获博士学位。1998年至今，于北京医科大学药学院博士后流动站生药研究室工作，主要从事中药有效成分及中药质量标准的研究。近期研究方向为复方血清药化学的研究。参加的研究工作有“长瓣金莲花化学成分的研究“、”黄花败酱化学成分的研究”、“复方虫草胶囊质量标准的研究及”、“补阳还五汤作用机制的研究”，已发表和待发表论文6篇。
参考文献
1，喻方亭.中西医结合杂志，1995，15(12)：751
2，张 洪，等.时珍国药研究，1994，6(1)：34
3，孙 阳，等.南京药学院学报，1985，16(1)：12
4，刘庆增，译.中草药，1987，18(1)：41
5，崔荣芬，等.中草药，1995，26(4)：199
6，大浦彦吉.国外医学-中医中药分册，1992，14(3)：17
(收稿日期：1999-05-06), 百拇医药