孕妇外周血胎儿细胞的分离及其在产前诊断中的应用
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国外医学妇产科学分册 2000年第27卷第1期
湖南医科大学人类生殖工程研究室(410078) 姜宏综述 李麓芸审校
摘 要 孕妇外周血中存在一定数量的胎儿细胞已为许多学者证实，为非侵入性产前诊断提供了一个有广泛应用前景的途径。本文对孕妇外周血胎儿细胞的种类以及胎儿有核红细胞的特点、分离纯化的方法及其在产前诊断中的应用作了简要介绍，并对其中存在的问题进行了探讨。
关键词：胎儿有核红细胞 分离 产前诊断
长期以来遗传学工作者一直试图建立一个安全、可靠对胎儿无任何损害的产前诊断方法。1969年Walknowska在研究孕妇外周血淋巴细胞核型时，发现有46，XY细胞，认为这些男胎细胞是经胎盘进入母体血循环的，提示可以利用孕妇外周血的胎儿细胞进行性别和疾病的产前诊断，随后也有类似报道。然而由于胎儿细胞在母血中的数量极少，其分离纯化问题一直未得到解决，使其很难应用于遗传性疾病的产前诊断。90年代以来，随着单克隆抗体技术，细胞分离技术和PCR等现代科研技术的发展和成熟，使得从孕妇外周血中分离、纯化胎儿细胞，建立一种孕妇易于接受的非侵入性产前诊断方法成为可能。下面就近几年这方面的研究进展作一简要介绍。
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孕妇外周血胎儿细胞的种类
目前研究发现在母体血循环中主要存在两种来源的胎儿细胞，一种是胎盘细胞如合体滋养细胞和细胞滋养细胞；另一种是胎儿血细胞，包括胎儿有核红细胞(NRBC)、淋巴细胞和粒细胞等。
一、滋养细胞
滋养细胞与母体子宫血管关系密切，是最早出现在母体中的胎儿细胞，从4～5孕周至分娩，合体滋养细胞从胎盘绒毛持续释放入母体血循环中，每天约10万个，是理论上最容易分离的细胞。但滋养细胞进入母体后多被肺组织所捕获，外周血中的数目并不多，而且不恒定，同时合体滋养细胞的多核特征以及嵌合型核型也干扰遗传学结果分析。目前最常用于滋养细胞分离的单克隆抗体有H315、GB17、GB21、GB25及HLA-G等，但其特异性均不高。有学者通过遗传学和超微结构的观察发现，分离到的所谓滋养细胞许多只不过是吸附了滋养细胞抗原的母体白细胞。Durrant等[1]的研究结果表明采用滋养细胞预测男性胎儿性别的准确率仅43%，故此类细胞用于产前诊断尚存在许多问题。
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二、胎儿淋巴细胞
于14孕周出现于母体血循环中，数量约为NRBC的1‰，产后可持续存在于母体1～5年，Bianchi等[2]报道1例27年前分娩1男胎的妇女外周血淋巴细胞中仍可检出Y染色体特异性序列。较长的滞留时间可妨碍下次妊娠的产前诊断，而且胎儿与母体淋巴细胞表面无本质差别，通常的分离方法并不能区别胎儿与母体细胞，因而淋巴细胞在产前诊断中的应用受到了限制。
三、胎儿粒细胞
1992年Weissman等用亲合素标记的Y染色体特异性探针PY431进行非放射性同位素原位杂交，发现早在孕7周母胎之间就存在着粒细胞转移，认为可以通过母血中的胎儿粒细胞进行性别诊断。Orsetti等[3]采用引物原位标记技术(PRINS)对经密度梯度离心富集的孕妇外周血单核细胞及粒细胞进行胎儿性别检测，其准确性为86.6%(13/15)。但目前有关胎儿粒细胞在产前诊断中应用的研究较少。
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四、胎儿有核红细胞(NRBC)
胎儿NRBC数量较多，约占11周胎儿全部RBC的10%，19周时的0.5%，此类细胞含有胎儿基因的全部遗传信息，从6孕周至分娩持续存在于母体外周血中，而正常未孕妇外周血中几乎无NRBC。同时RBC的生命周期较短，约90天，一般不会持续到下次妊娠，因此是最理想的分离细胞，现在国内外学者对母血中胎儿细胞的分离及产前诊断的应用多集中于NRBC，目前分离NRBC所用的抗原标记可分为两类。
1.阳性选择 即利用胎儿NRBC表面或胞内特异性抗原的单抗如CD71、CD36、GPA、γ-珠蛋白等对细胞进行标记和筛选。
CD71即转铁蛋白受体(TfR)，它存在于早期RBC以及单核细胞和激活的淋巴细胞，但不存在成熟的RBC；CD36即血栓敏感素(Thrombospondin)受体，为红细胞系早期分化的标志；GPA即糖蛋白A(GlycophorinA)，是一种红细胞系特异性唾液糖蛋白，不存在于白细胞，作为阳性筛选可以识别中、晚幼RBC 。Bianchi曾用上述三种单抗经流式细胞仪分离出NRBC进行胎儿性别预测，CD71的准确率为57%，CD36为88%，CD71或CD36与GPA联合预测的准确率为100%，而单独使用GPA仍为100%，表明在分选NRBC上GPA明显优于前两者。但由于GPA单抗可导致RBC凝集，而影响FACS的分离效果，现国外已较少使用，而倾向于使用CD71和γ-珠蛋白单抗[4]。
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γ-珠蛋白主要存在于胎儿血红蛋白(HbF)中(成人血红蛋白中少于1%)，于6孕周出现，虽然妊娠可刺激母体合成少量的HbF，但胎儿NRBC中γ-珠蛋白含量要高得多，有研究表明83%～100%的γ-珠蛋白阳性细胞为胎儿源性，用γ-珠蛋白单抗标记胎儿NRBC，其细胞分离纯度可达45%[5]。DeMaria等[6]也证实采用HbF单抗标记可显著提高胎儿NRBC的分离纯度。但由于γ-珠蛋白为细胞内抗原，作为一种标记用于细胞分离较使用细胞表面抗原有一定的难度，因此尚未广泛应用于细胞分离，只是作为胎儿细胞特异性标记被广泛应用于胎儿NRBC的表型鉴定。
2.阴性选择 即利用母体白细胞特异性抗原的单抗如CD45对母体细胞进行标记，剔除母体细胞后再进行阳性选择，可使分离效率进一步提高。
孕妇外周血胎儿细胞的分离纯化方法
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由于母血中胎儿细胞数目非常少，要进行产前遗传学诊断则必须对其进行分离纯化，目前分离胎儿细胞的一般程序是：收集母体外周血细胞密度梯度离心，选取所需要的细胞层，然后用单克隆抗体标记胎儿细胞，经过不同的手段(流式细胞术、磁分离术等)对其进行分离、纯化。
一、荧光激活细胞分选术(FACS)
FACS又称流式细胞术，是近年广泛应用的细胞自动分析分选技术，它可以快速测量悬浮于液体中的分散细胞的一系列生物物理和生物化学特征性参量，并根据预定的参选范围把指定的细胞亚群分选出来。FACS自1990年由Bianchi首次成功地应用于胎儿NRBC的分选，现已成为最有效的分离工具而被广泛应用于胎儿细胞的分离。此法可将胎儿细胞富集1000倍，缺点在于仪器昂贵，技术复杂，需专业技术人员操作。
二、磁激活细胞分离法(MACS)
此方法1992年Ganshirt-Ahlert建立，其原理为：用结合磁性微粒的单克隆抗体标记细胞，在外加磁场的作用下磁激活细胞分离器可将样品中带磁的与不带磁的细胞分开，以达到细胞分离纯化的目的。随后Bush[7]又报道了双MACS法，即先用携带磁性微粒的CD45和CD12单抗标记细胞，再用携带磁性微粒的CD71单抗作阳性选择，富集胎儿NRBC，可大大提高分离效率，从20ml母血中可分离约800个NRBC。此法简便、省时，而且可在短时间内分离大量及多个样品，但分离效率不及FACS。
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三、显微操作分离法
1995年日本学者Takabayashi[8]将经密度梯度离心初步富集的孕妇外周血细胞置于显微镜下观察，从形态学上识别NRBC，并用微操纵器将其逐个地挑选出来，然后进行聚合酶链反应(PCR)检测，产前预测胎儿性别准确率达99%。此法优点在于可获得单个胎儿细胞，分离纯度高。
四、细胞培养
Valerio[9]用亲合素标记的人红细胞生成素作MACS细胞分选，然后进行细胞培养，对7例21三体、2例18三体、1例13三体胎儿细胞进行回顾性研究，结果表明胎儿细胞体外培养有可靠的增殖能力，通过细胞的克隆化生长，可获得足够的胎儿细胞用于产前诊断。Jansen等[10]的结果也证实，NRBC在体外培养后再进行MACS分离，较直接MACS分离能获得更高的产量。但Chen等[11]的研究结果表明，体外培养获得的大量NRBC克隆为母源性，胎儿源性细胞克隆非常少，采用目前的分离手段富集到的NRBC进行细胞培养，尚不能应用于产前诊断。
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五、电泳分离
由于细胞表面均带有多少不等的电荷，因此在电场中就会向一定的方向泳动，泳动的速度与电荷多少有关，因此可根据细胞电泳速度的不同将不同的细胞分离开来。此法分离的细胞完整无缺，保持原有的特征，可收集起来作进一步研究。1996年Wachtel首先采用电泳仪对孕妇外周血NRBC进行分离取得较好的结果，可从15ml母血中富集到成千甚至上万个NRBC，细胞纯度达30%，该法是目前分率效率最高的方法[12]。
孕妇外周血胎儿NRBC在产前诊断中的应用
目前应用最多是用Y染色体DNA特异性序列的引物或探针检测胎儿的性别，以证实从母血中分离到的是胎儿细胞，其次是在染色体水平用荧光原位杂交(FISH)技术诊断21三体，18三体综合征等，在基因水平用PCR技术研究胎儿Rh血型、HLA多态性以及β-地中海贫血等。
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一、FISH
1991年Price首次应用18号染色体特异性探针对母血中的胎儿细胞进行检测，诊断出1例18三体胎儿。随后Steele也用FISH技术从母血NRBC中成功地诊断出21三体和13三体胎儿。Sohda等[13]采用Y染色体特异性探针对28例经FACS分离的孕妇外周血NRBC进行胎儿性别检测，其特异性达100%，敏感性为88%，阴性预测值为86%。Orsetti等[3]将PRINS技术应用于孕妇外周血单核细胞及粒细胞的胎儿性别检测，其准确性为86.6%(13/15)，认为PRINS操作简单，特异性强，可在5小时内完成，在产前诊断中有很大的应用前景。Zhen等[14]采用多轮回FISH(Poly-FISH)对母血中分离到的胎儿细胞间期核进行多个轮回的FISH，每个轮回使用三个以上的探针，理论上可对同一细胞24条不同染色体进行分析，大大提高了FISH的效率，克服了由于分离到的胎儿细胞少，不能对所获细胞多条染色体进行分析的缺点，成功地对21三体综合征和其它染色体异常作出了产前诊断。由于FISH技术可直接对间期核进行染色体异常的诊断，而不需要分裂细胞的存在，在染色体病的产前诊断中起着愈来愈大的作用。目前通过FISH技术对母外周血胎儿细胞的分析，已可对大多数染色体数目异常的胎儿作出产前诊断。
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二、PCR
1990年Camashella 首次应用PCR方法从孕妇外周血细胞中扩增出父源性血红蛋白Lepore-Boston基因特异性DNA，正确诊断2例胎儿血红蛋白病。1993年Lo用巢式PCR法检测母外周血DYS14序列，可检出30万个母体细胞中的1个胎儿细胞，在早、中、晚孕预测胎儿性别的准确率分别为86%、67%、87%，并证明扩增多拷贝的DYZ1位点比扩增单拷贝DYS14位点更敏感。Geifman-Holtzman等[15]采用FACS法从Rh阴性孕妇外周血定富集到的NRBC进行Rh位点的PCR扩增，预测胎儿的Rh血型，其特异性可达100%，敏感性为84%。Enggelin等[16]采用随机引物预扩增(PEP)法对分离到的单个NRBC的基因组进行扩增，然后取部分产物进行多态重复序列D1S53、D21S1、ACTBP2位点的PCR，经DNA多态性分析判断细胞来源，如细胞为胎源性，则可利用其余的PEP产物进行后续基因(如异常基因或突变基因)的检测，使得胎儿细胞的遗传学分析摆脱了性别限制。Cheung等[17]将经密度梯度离心和CD71标记的孕妇外周血细胞进行MACS分离后置于显微镜下，采用显微切割的方法将胎儿NRBC分离出来，用PCR的方法进行点突变检测，成功地对2例镰状细胞贫血和地中海贫血的胎儿做出了产前诊断，使得利用孕妇外周血细胞不仅可对胎儿染色体异常而且可对胎儿的单基因病做出产前诊断。
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问题与展望
衡量一种分离方法的效率主要依靠两个指标——产量和纯度。产量是指分离后实际获得胎儿细胞与母体细胞的百分比。目前常规进行的胎儿细胞分离过程中，密度梯度离心虽可将NRBC富集1000倍，但此过程也导致了80%以上NRBC的丢失，因此产量很低，一般从20ml母血中分离到的NRBC<200个。
由于妊娠可诱导母体外周血出现一定数量的NRBC，目前的方法从孕妇外周血中分离到的NRBC绝大多数为母源性，胎源性NRBC纯度很低，Reading等[18]报道在每毫升母血中胎儿源性的NRBC不到1个；Bianchi等[19]采用定量PCR法对经FACS分离到的NRBC7号和Y染色体特异性序列进行定量检测，探讨胎源性NRBC的纯度，结果显示胎源性NRBC的纯度仅为0.001%～4.8%。Sekizawa等[20]采用1.083和1.090g/ml两种不同密度梯度的Percoll分离液对母体外周血单个核细胞进行分离，经FISH和γ珠蛋白单抗标记后进行FACS证实，高密度梯度的分离液可显著提高胎儿细胞的产量。Cheng等[5]选用γ-珠蛋白单抗对胎儿细胞进行标记，经FACS分选，胎儿细胞纯度可达45%，有了显著提高，但其中仍有相当数量的母源性细胞。较低的产量和纯度使得利用孕妇外周血胎儿细胞进行常规和广泛的遗传病尤其是单基因遗传病的产前诊断受到极大的限制。因此进一步完善细胞富集方法，寻找和有效利用胎儿细胞特异性单抗，是目前亟特解决的问题。
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总之，孕妇外周血胎儿细胞的发现为无创伤性产前诊断的建立提供了一个新的前景可观的途径。相信随着以上问题的解决以及单细胞多重荧光定量PCR技术的成熟和临床应用，将可从孕妇外周血中获得高产量和高纯度的胎儿细胞，满足临床遗传学检测的需要，真正实现无创伤性产前诊断在临床的应用。
参考文献
1 Durrant L et al.Br J Obstet Gynaecol,1996;103:219-222
2 Bianchi DW et al.Proc Natl Acad Sci USA ,1996;93:705-708
3 Orsetti B et al.Prenat Diagn,1998;18:1014-1022
4 Zheng YL et al.Am J Obstet Gynecol,1999;180:1234-1239
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5 Zheng YL et al.Prenat Diagn,1995;15:897-905
6 DeMaria MA et al.Cytometry,1996;25:37-45
7 Bush J et al.Prenat Diagn,1994;1129-1140
8 Takabayashi H et al.Prenat Diagn,1995;15:74-77
9 Valerio D et al.Prenat Diagn ,1996;16:1073-1082
10 Jansen MW et al.Prenat Diagn,1999;19:323-329
11 Chen H et al.Prenat Diagn,1998;18:883-892
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12 Wachtel SS et al.Prenat Diagn,1998;18:455-463
13 Sohda S et al.Prenat Diagn,1997;17:743-752
14 Zhen DK et al.Prenat Diagn ,1998;18:1181-1185
15 Geifman-Holtzman O et al.Nat Genet,1996;14:264-268
16 von Eggeling F et al.Hum Genet,1997;99:266-270
17 Cheung MC et al.Nat Genet,1996;14:264-268
, 百拇医药 18 Reading JP et al.Molecular Hum Reprod,1995;10:2510-2515
19 Bianchi DW et al.Am J Obstet Gynecol,1994;171:922-926
20 Sekizawa A et al.Fetal Diagn Ther,1999;14:229-233
收稿日期：1999-02-03 修回日期：1999-11-06
录入：李惠莉
校对时间：2000/3/15 9：38 任媛媛, 百拇医药
摘 要 孕妇外周血中存在一定数量的胎儿细胞已为许多学者证实，为非侵入性产前诊断提供了一个有广泛应用前景的途径。本文对孕妇外周血胎儿细胞的种类以及胎儿有核红细胞的特点、分离纯化的方法及其在产前诊断中的应用作了简要介绍，并对其中存在的问题进行了探讨。
关键词：胎儿有核红细胞 分离 产前诊断
长期以来遗传学工作者一直试图建立一个安全、可靠对胎儿无任何损害的产前诊断方法。1969年Walknowska在研究孕妇外周血淋巴细胞核型时，发现有46，XY细胞，认为这些男胎细胞是经胎盘进入母体血循环的，提示可以利用孕妇外周血的胎儿细胞进行性别和疾病的产前诊断，随后也有类似报道。然而由于胎儿细胞在母血中的数量极少，其分离纯化问题一直未得到解决，使其很难应用于遗传性疾病的产前诊断。90年代以来，随着单克隆抗体技术，细胞分离技术和PCR等现代科研技术的发展和成熟，使得从孕妇外周血中分离、纯化胎儿细胞，建立一种孕妇易于接受的非侵入性产前诊断方法成为可能。下面就近几年这方面的研究进展作一简要介绍。
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孕妇外周血胎儿细胞的种类
目前研究发现在母体血循环中主要存在两种来源的胎儿细胞，一种是胎盘细胞如合体滋养细胞和细胞滋养细胞；另一种是胎儿血细胞，包括胎儿有核红细胞(NRBC)、淋巴细胞和粒细胞等。
一、滋养细胞
滋养细胞与母体子宫血管关系密切，是最早出现在母体中的胎儿细胞，从4～5孕周至分娩，合体滋养细胞从胎盘绒毛持续释放入母体血循环中，每天约10万个，是理论上最容易分离的细胞。但滋养细胞进入母体后多被肺组织所捕获，外周血中的数目并不多，而且不恒定，同时合体滋养细胞的多核特征以及嵌合型核型也干扰遗传学结果分析。目前最常用于滋养细胞分离的单克隆抗体有H315、GB17、GB21、GB25及HLA-G等，但其特异性均不高。有学者通过遗传学和超微结构的观察发现，分离到的所谓滋养细胞许多只不过是吸附了滋养细胞抗原的母体白细胞。Durrant等[1]的研究结果表明采用滋养细胞预测男性胎儿性别的准确率仅43%，故此类细胞用于产前诊断尚存在许多问题。
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二、胎儿淋巴细胞
于14孕周出现于母体血循环中，数量约为NRBC的1‰，产后可持续存在于母体1～5年，Bianchi等[2]报道1例27年前分娩1男胎的妇女外周血淋巴细胞中仍可检出Y染色体特异性序列。较长的滞留时间可妨碍下次妊娠的产前诊断，而且胎儿与母体淋巴细胞表面无本质差别，通常的分离方法并不能区别胎儿与母体细胞，因而淋巴细胞在产前诊断中的应用受到了限制。
三、胎儿粒细胞
1992年Weissman等用亲合素标记的Y染色体特异性探针PY431进行非放射性同位素原位杂交，发现早在孕7周母胎之间就存在着粒细胞转移，认为可以通过母血中的胎儿粒细胞进行性别诊断。Orsetti等[3]采用引物原位标记技术(PRINS)对经密度梯度离心富集的孕妇外周血单核细胞及粒细胞进行胎儿性别检测，其准确性为86.6%(13/15)。但目前有关胎儿粒细胞在产前诊断中应用的研究较少。
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四、胎儿有核红细胞(NRBC)
胎儿NRBC数量较多，约占11周胎儿全部RBC的10%，19周时的0.5%，此类细胞含有胎儿基因的全部遗传信息，从6孕周至分娩持续存在于母体外周血中，而正常未孕妇外周血中几乎无NRBC。同时RBC的生命周期较短，约90天，一般不会持续到下次妊娠，因此是最理想的分离细胞，现在国内外学者对母血中胎儿细胞的分离及产前诊断的应用多集中于NRBC，目前分离NRBC所用的抗原标记可分为两类。
1.阳性选择 即利用胎儿NRBC表面或胞内特异性抗原的单抗如CD71、CD36、GPA、γ-珠蛋白等对细胞进行标记和筛选。
CD71即转铁蛋白受体(TfR)，它存在于早期RBC以及单核细胞和激活的淋巴细胞，但不存在成熟的RBC；CD36即血栓敏感素(Thrombospondin)受体，为红细胞系早期分化的标志；GPA即糖蛋白A(GlycophorinA)，是一种红细胞系特异性唾液糖蛋白，不存在于白细胞，作为阳性筛选可以识别中、晚幼RBC 。Bianchi曾用上述三种单抗经流式细胞仪分离出NRBC进行胎儿性别预测，CD71的准确率为57%，CD36为88%，CD71或CD36与GPA联合预测的准确率为100%，而单独使用GPA仍为100%，表明在分选NRBC上GPA明显优于前两者。但由于GPA单抗可导致RBC凝集，而影响FACS的分离效果，现国外已较少使用，而倾向于使用CD71和γ-珠蛋白单抗[4]。
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γ-珠蛋白主要存在于胎儿血红蛋白(HbF)中(成人血红蛋白中少于1%)，于6孕周出现，虽然妊娠可刺激母体合成少量的HbF，但胎儿NRBC中γ-珠蛋白含量要高得多，有研究表明83%～100%的γ-珠蛋白阳性细胞为胎儿源性，用γ-珠蛋白单抗标记胎儿NRBC，其细胞分离纯度可达45%[5]。DeMaria等[6]也证实采用HbF单抗标记可显著提高胎儿NRBC的分离纯度。但由于γ-珠蛋白为细胞内抗原，作为一种标记用于细胞分离较使用细胞表面抗原有一定的难度，因此尚未广泛应用于细胞分离，只是作为胎儿细胞特异性标记被广泛应用于胎儿NRBC的表型鉴定。
2.阴性选择 即利用母体白细胞特异性抗原的单抗如CD45对母体细胞进行标记，剔除母体细胞后再进行阳性选择，可使分离效率进一步提高。
孕妇外周血胎儿细胞的分离纯化方法
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由于母血中胎儿细胞数目非常少，要进行产前遗传学诊断则必须对其进行分离纯化，目前分离胎儿细胞的一般程序是：收集母体外周血细胞密度梯度离心，选取所需要的细胞层，然后用单克隆抗体标记胎儿细胞，经过不同的手段(流式细胞术、磁分离术等)对其进行分离、纯化。
一、荧光激活细胞分选术(FACS)
FACS又称流式细胞术，是近年广泛应用的细胞自动分析分选技术，它可以快速测量悬浮于液体中的分散细胞的一系列生物物理和生物化学特征性参量，并根据预定的参选范围把指定的细胞亚群分选出来。FACS自1990年由Bianchi首次成功地应用于胎儿NRBC的分选，现已成为最有效的分离工具而被广泛应用于胎儿细胞的分离。此法可将胎儿细胞富集1000倍，缺点在于仪器昂贵，技术复杂，需专业技术人员操作。
二、磁激活细胞分离法(MACS)
此方法1992年Ganshirt-Ahlert建立，其原理为：用结合磁性微粒的单克隆抗体标记细胞，在外加磁场的作用下磁激活细胞分离器可将样品中带磁的与不带磁的细胞分开，以达到细胞分离纯化的目的。随后Bush[7]又报道了双MACS法，即先用携带磁性微粒的CD45和CD12单抗标记细胞，再用携带磁性微粒的CD71单抗作阳性选择，富集胎儿NRBC，可大大提高分离效率，从20ml母血中可分离约800个NRBC。此法简便、省时，而且可在短时间内分离大量及多个样品，但分离效率不及FACS。
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三、显微操作分离法
1995年日本学者Takabayashi[8]将经密度梯度离心初步富集的孕妇外周血细胞置于显微镜下观察，从形态学上识别NRBC，并用微操纵器将其逐个地挑选出来，然后进行聚合酶链反应(PCR)检测，产前预测胎儿性别准确率达99%。此法优点在于可获得单个胎儿细胞，分离纯度高。
四、细胞培养
Valerio[9]用亲合素标记的人红细胞生成素作MACS细胞分选，然后进行细胞培养，对7例21三体、2例18三体、1例13三体胎儿细胞进行回顾性研究，结果表明胎儿细胞体外培养有可靠的增殖能力，通过细胞的克隆化生长，可获得足够的胎儿细胞用于产前诊断。Jansen等[10]的结果也证实，NRBC在体外培养后再进行MACS分离，较直接MACS分离能获得更高的产量。但Chen等[11]的研究结果表明，体外培养获得的大量NRBC克隆为母源性，胎儿源性细胞克隆非常少，采用目前的分离手段富集到的NRBC进行细胞培养，尚不能应用于产前诊断。
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五、电泳分离
由于细胞表面均带有多少不等的电荷，因此在电场中就会向一定的方向泳动，泳动的速度与电荷多少有关，因此可根据细胞电泳速度的不同将不同的细胞分离开来。此法分离的细胞完整无缺，保持原有的特征，可收集起来作进一步研究。1996年Wachtel首先采用电泳仪对孕妇外周血NRBC进行分离取得较好的结果，可从15ml母血中富集到成千甚至上万个NRBC，细胞纯度达30%，该法是目前分率效率最高的方法[12]。
孕妇外周血胎儿NRBC在产前诊断中的应用
目前应用最多是用Y染色体DNA特异性序列的引物或探针检测胎儿的性别，以证实从母血中分离到的是胎儿细胞，其次是在染色体水平用荧光原位杂交(FISH)技术诊断21三体，18三体综合征等，在基因水平用PCR技术研究胎儿Rh血型、HLA多态性以及β-地中海贫血等。
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一、FISH
1991年Price首次应用18号染色体特异性探针对母血中的胎儿细胞进行检测，诊断出1例18三体胎儿。随后Steele也用FISH技术从母血NRBC中成功地诊断出21三体和13三体胎儿。Sohda等[13]采用Y染色体特异性探针对28例经FACS分离的孕妇外周血NRBC进行胎儿性别检测，其特异性达100%，敏感性为88%，阴性预测值为86%。Orsetti等[3]将PRINS技术应用于孕妇外周血单核细胞及粒细胞的胎儿性别检测，其准确性为86.6%(13/15)，认为PRINS操作简单，特异性强，可在5小时内完成，在产前诊断中有很大的应用前景。Zhen等[14]采用多轮回FISH(Poly-FISH)对母血中分离到的胎儿细胞间期核进行多个轮回的FISH，每个轮回使用三个以上的探针，理论上可对同一细胞24条不同染色体进行分析，大大提高了FISH的效率，克服了由于分离到的胎儿细胞少，不能对所获细胞多条染色体进行分析的缺点，成功地对21三体综合征和其它染色体异常作出了产前诊断。由于FISH技术可直接对间期核进行染色体异常的诊断，而不需要分裂细胞的存在，在染色体病的产前诊断中起着愈来愈大的作用。目前通过FISH技术对母外周血胎儿细胞的分析，已可对大多数染色体数目异常的胎儿作出产前诊断。
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二、PCR
1990年Camashella 首次应用PCR方法从孕妇外周血细胞中扩增出父源性血红蛋白Lepore-Boston基因特异性DNA，正确诊断2例胎儿血红蛋白病。1993年Lo用巢式PCR法检测母外周血DYS14序列，可检出30万个母体细胞中的1个胎儿细胞，在早、中、晚孕预测胎儿性别的准确率分别为86%、67%、87%，并证明扩增多拷贝的DYZ1位点比扩增单拷贝DYS14位点更敏感。Geifman-Holtzman等[15]采用FACS法从Rh阴性孕妇外周血定富集到的NRBC进行Rh位点的PCR扩增，预测胎儿的Rh血型，其特异性可达100%，敏感性为84%。Enggelin等[16]采用随机引物预扩增(PEP)法对分离到的单个NRBC的基因组进行扩增，然后取部分产物进行多态重复序列D1S53、D21S1、ACTBP2位点的PCR，经DNA多态性分析判断细胞来源，如细胞为胎源性，则可利用其余的PEP产物进行后续基因(如异常基因或突变基因)的检测，使得胎儿细胞的遗传学分析摆脱了性别限制。Cheung等[17]将经密度梯度离心和CD71标记的孕妇外周血细胞进行MACS分离后置于显微镜下，采用显微切割的方法将胎儿NRBC分离出来，用PCR的方法进行点突变检测，成功地对2例镰状细胞贫血和地中海贫血的胎儿做出了产前诊断，使得利用孕妇外周血细胞不仅可对胎儿染色体异常而且可对胎儿的单基因病做出产前诊断。
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问题与展望
衡量一种分离方法的效率主要依靠两个指标——产量和纯度。产量是指分离后实际获得胎儿细胞与母体细胞的百分比。目前常规进行的胎儿细胞分离过程中，密度梯度离心虽可将NRBC富集1000倍，但此过程也导致了80%以上NRBC的丢失，因此产量很低，一般从20ml母血中分离到的NRBC<200个。
由于妊娠可诱导母体外周血出现一定数量的NRBC，目前的方法从孕妇外周血中分离到的NRBC绝大多数为母源性，胎源性NRBC纯度很低，Reading等[18]报道在每毫升母血中胎儿源性的NRBC不到1个；Bianchi等[19]采用定量PCR法对经FACS分离到的NRBC7号和Y染色体特异性序列进行定量检测，探讨胎源性NRBC的纯度，结果显示胎源性NRBC的纯度仅为0.001%～4.8%。Sekizawa等[20]采用1.083和1.090g/ml两种不同密度梯度的Percoll分离液对母体外周血单个核细胞进行分离，经FISH和γ珠蛋白单抗标记后进行FACS证实，高密度梯度的分离液可显著提高胎儿细胞的产量。Cheng等[5]选用γ-珠蛋白单抗对胎儿细胞进行标记，经FACS分选，胎儿细胞纯度可达45%，有了显著提高，但其中仍有相当数量的母源性细胞。较低的产量和纯度使得利用孕妇外周血胎儿细胞进行常规和广泛的遗传病尤其是单基因遗传病的产前诊断受到极大的限制。因此进一步完善细胞富集方法，寻找和有效利用胎儿细胞特异性单抗，是目前亟特解决的问题。
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总之，孕妇外周血胎儿细胞的发现为无创伤性产前诊断的建立提供了一个新的前景可观的途径。相信随着以上问题的解决以及单细胞多重荧光定量PCR技术的成熟和临床应用，将可从孕妇外周血中获得高产量和高纯度的胎儿细胞，满足临床遗传学检测的需要，真正实现无创伤性产前诊断在临床的应用。
参考文献
1 Durrant L et al.Br J Obstet Gynaecol,1996;103:219-222
2 Bianchi DW et al.Proc Natl Acad Sci USA ,1996;93:705-708
3 Orsetti B et al.Prenat Diagn,1998;18:1014-1022
4 Zheng YL et al.Am J Obstet Gynecol,1999;180:1234-1239
, 百拇医药
5 Zheng YL et al.Prenat Diagn,1995;15:897-905
6 DeMaria MA et al.Cytometry,1996;25:37-45
7 Bush J et al.Prenat Diagn,1994;1129-1140
8 Takabayashi H et al.Prenat Diagn,1995;15:74-77
9 Valerio D et al.Prenat Diagn ,1996;16:1073-1082
10 Jansen MW et al.Prenat Diagn,1999;19:323-329
11 Chen H et al.Prenat Diagn,1998;18:883-892
, 百拇医药
12 Wachtel SS et al.Prenat Diagn,1998;18:455-463
13 Sohda S et al.Prenat Diagn,1997;17:743-752
14 Zhen DK et al.Prenat Diagn ,1998;18:1181-1185
15 Geifman-Holtzman O et al.Nat Genet,1996;14:264-268
16 von Eggeling F et al.Hum Genet,1997;99:266-270
17 Cheung MC et al.Nat Genet,1996;14:264-268
, 百拇医药 18 Reading JP et al.Molecular Hum Reprod,1995;10:2510-2515
19 Bianchi DW et al.Am J Obstet Gynecol,1994;171:922-926
20 Sekizawa A et al.Fetal Diagn Ther,1999;14:229-233
收稿日期：1999-02-03 修回日期：1999-11-06
录入：李惠莉
校对时间：2000/3/15 9：38 任媛媛, 百拇医药