影响人类胚胎冷冻保存结果的因素
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国外医学计划生育分册 1999年5月第18卷第2期
上海市计划生育科学研究所(200032)
李忠妹综述 汪玉宝 冯缵冲审校
摘要 自第一次人类胚胎冷冻成功并获妊娠至今已有十多年的历史，探求人类胚胎冷冻保存的影响因素一直是该领域的重要课题之一。影响人类胚胎冷冻保存结果的因素众多，主要有胚胎的质量和分裂阶段、母体年龄及移植时机以及冷冻保护剂和冷冻融解程序等几方面，其中，尤以胚胎质量及母体年龄起重要作用。在多种冷冻方法中，现较多采用慢速冷冻、快速融解方法，但其它方法也有其优势；蔗糖等非渗透性保护剂和渗透性保护剂联合使用常取得较好效果。胚胎质量、分裂阶段、移植数目等也影响最终结果，随着其它技术如胞浆内单精子注射(ICSI)、辅助孵化的不断成熟，进一步提高了冷冻融解胚胎妊娠率和植入率。母体年龄及选择最佳的胚胎移植时机是决定冻胚胎能否发生妊娠的最后关键因素。
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关键词：胚胎冷冻 生殖辅助技术 丙二醇 二甲亚砜
人类胚胎贮存于-196℃及无损伤融解，是生殖辅助技术(assisted reproductive technology,ART)领域的重大突破之一。胚胎冷冻技术提高了促排卵治疗效益，降低了多胎妊娠及其并发症发生率，也可满足胚胎赠送的需要。从冷冻技术第一次成功应用于胚胎并获妊娠[1]至今已有十多年，有关的技术、方法不断成熟。如何提高冷冻胚胎存活率、植入率、妊娠率等是该领域的重要课题之一，涉及胚胎、冷冻方法和母体等诸多方面。
一、冷冻融解方法
胚胎冷冻融解方法主要是指冷冻保护剂和冷冻融解程序两个方面。
(一)冷冻保护剂 1983年，Trounson和Mohr采用慢速冷冻方法，以二甲亚砜(dimethylsulphoxide，DMSO)为冷冻保护剂首次成功移植冷冻4～8细胞人类胚胎并获妊娠[1]。Freeman等[2]以DMSO为冷冻保护剂冷冻第2～3d的胚胎；Cohen等[3]采用甘油(glycerol)为冷冻保护剂对第5～6d的胚胎进行冷冻；Lassalle等[4]采用丙二醇(1，2-propanediol，PROH)对仅是第1～2d的胚胎进行冷冻。自此，对囊胚期胚胎采用甘油、1～4细胞胚胎冷冻采用PROH、4～8细胞胚胎采用DMSO作为冷冻保护剂。在原核期胚胎，采用PROH作为冷冻保护剂，能获得70%～80%的胚胎存活率。但是，在多细胞胚胎采用PROH，胚胎存活率显著下降，其原因可能是与细胞渗透性和表面/体积比的改变有关。以上有关研究很多为非随机的，van der Elst等[5]采用随机前瞻性研究方法对DMSO、PROH和DMSO+PROH三种方法作了比较，结果发现DMSO组胚胎存活率(52.6%,122/232)显著高于PROH组(32.0%,80/250,P<0.0001),临床妊娠率(25%,11/44)也明显高于PROH组(6.5%,3/46).该研究结果提示采用慢速冷冻融解方法,以1.5MDMSO为冷冻保护剂是2～8细胞胚胎冷冻的最佳方案。
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上述PROH、DMSO和甘油等均为渗透性冷冻保护剂(permeating cryoprotectant)。除此之外，非渗透性冷冻保护剂(non-permeating cryoprotectant)常与渗透性冷冻保护剂联合使用。与渗透性冷冻保护剂不同，非渗透性保护剂如蔗糖并不进入细胞，主要是通过改变细胞外渗透性引起细胞脱水，发挥非特异性保护作用，在起初平衡阶段及在融解时降低渗透压休克的发生。Mandelbaum等[6]应用PROH+蔗糖能显著提高胚胎存活率和妊娠率。
近年来，随着抗冷冻蛋白(anti-freeze protein)研究在动物实验中的不断进步，也有报道使用抗冷冻蛋白对人类卵母细胞的冷冻[7]，但至今仍无对胚胎冷冻的报道。
(二)冷冻融解程序 人类胚胎冷冻融解程序主要采用四种方法：慢速冷冻、慢速融解；慢速冷冻、快速融解；玻璃化技术；超快速冷冻法。Trouson等[8]报道采用超快速冷冻方法获得较高的存活率和继续卵裂率(分别为82%和78%)，且透明带损伤也较慢速冷冻、慢速融解方法者为轻，但采用此法后的胚胎不发生植入和妊娠。Mohr等[9]发现，慢速冷冻较快速冷冻法能取得更高的胚胎存活率。现在，大多数的实验室较多采用慢速冷冻、快速融解方法。所谓的玻璃化技术，是指将冷冻保护剂浓度提高至呈玻璃样状态(重量/体积=40%)[10]。避免了冰晶形成。该法在动物特别是小鼠胚胎冷冻取得较好的效果，在人类胚胎冷冻的效果则较差。
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二、胚胎因素
胚胎的质量、分裂阶段及结合一些新ART技术，如：胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)、辅助孵化(assisted hatching)等构成胚胎自身影响冷冻结果的因素。
(一)胚胎质量 胚胎质量是影响冷冻胚胎结果的重要因素，常由其形态学特征确定。Veeck将胚胎按形态分为五级：Ⅰ°，胚胎基本无明确裂球，有大或完全碎片；Ⅱ°，有不规则或不均一的裂球，碎片大到中度；Ⅲ°，胚胎有不均一裂球，有小的细胞浆内碎片；Ⅳ°，胚胎有规则、均一裂球，有小的细胞浆内碎片；Ⅴ°，胚胎有规则、均一裂球，无细胞浆内碎片。Mandelbaum等[11]发现，正常形态组胚胎存活率最高，为67%，而有细胞内碎片或卵裂球大小不均组的胚胎存活率明显下降，分别为49%和54%。一般情况下，经冷冻融解后保持50%以上裂球完整的胚胎为存活胚胎，包括完全受损和50%～80%裂球完整的胚胎。Kondo等[12]发现，在86个质量好的胚胎中，有31个发生植入，而质量差的胚胎则无胚胎发生植入。除冷冻前胚胎质量外，Veeck等[10]报道冷冻融解后胚胎形态与妊娠率密切相关，Ⅰ°～Ⅴ°级胚胎的妊娠率分别为9%、15%、19%、32%和43%。Queenan等[13]认为冷冻融解后胚胎质量作为预测冷冻成功的指标更佳，尤其当冷冻胚胎处于原核期以及形态较为均一时。
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基于高质量冷冻胚胎能获得高妊娠率以及质量差的胚胎更易受冷冻损伤，Lightman等[14]研究了“扶助胚胎”(sponsoring embryo)对质量差胚胎植入率与妊娠率的影响。所谓扶助胚胎，是指Ⅲ°及以上、第2d胚胎有2～6个细胞而在第3d有个以上的高质量胚胎。结果发现，扶助胚胎与质量较差胚胎一起移植后，使妊娠率从9.8%增加到18.2%，植入率也从3.1%提高到7.0%。
(二)胚胎分裂阶段 胚胎冷冻结果与胚胎发育阶段常使用胚胎存活率、胚胎不受影响比例和胚胎细胞存活情况三个指标。
如前所述，由于胚胎所处分裂阶段的不同，所使用的冷冻保护剂也有所不同。但至今对几种冷冻保护剂特别是DMSO和PROH适合哪一胚胎分裂阶段的冷冻仍有争议。
胚胎发育阶段对胚胎冷冻融解后存活率的影响一直是该领域关注的焦点。有些学者主张对原核期胚胎进行冷冻，能取得与未冷冻胚胎近似的妊娠率，或其存活率较早卵裂期的胚胎存活率高[15]。但也有报道冷冻融解后合子和早卵裂期胚胎的存活率并无明显差异[16]。
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在胚胎的原核期，合子年龄是决定冷冻胚胎植入的重要因素[17]。所谓合子年龄是指从受精到冷冻之间的一段时间。一般认为在体外受精(IVF)合子完成原核移动在受精后20～24h。对于采用ICSI方法的合子冷冻时间相应提前。随着合子年龄的增长，植入率与之呈反比关系。
随着体外培养时间的延长，胚胎存活率下降。Fehilly等[18]认为将胚胎在体外培养到囊胚期可以优选质量好的胚胎，然后再进行冷冻。结果发现，只25%的胚胎能发育到囊胚期，一个周期移植1～2个冷冻囊胚期胚胎的妊娠率高达35%。这一结果很令人鼓舞。但是，以后的研究并未提示冷冻囊胚期胚胎的妊娠率高于早卵裂期胚胎[19]。
Lasalle等[4]发现胚胎细胞数目呈指数性(2-，4-，8-)时的存活率(67%，20/30)高于中间分裂阶段(3-，5-，6-，7-)时的存活率(22%，2/9)。以后又有类似的报道[20]。其原因可能是处于分裂中间阶段的胚胎有几个卵裂球核不在分裂间期，以致与膜或有丝分裂纺锤体的不稳定性有关。
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(三)与其它新ART技术的结合 近年来，ART领域内ICSI和辅助孵化等新技术、新方法不断涌现，并与人类胚胎冷冻保存方法日益紧密结合。
在ICSI技术引入男性不育症治疗后，原采用IVF预后极差的不孕夫妇能成功地得到治疗。正是该法能取得较高的受精率和植入率，大量多余胚胎为冷冻提供了可能。Kowalik等[16]发现，采用ICSI和常规IVF和早期胚胎冷冻后的植入率和存活率(分别为11.6%和8.6%，73.2%和70.5%)相当。该研究结果表明ICSI不会对冷冻胚胎植入率产生负面效应，ICSI胚胎冷冻保存是可取的，Macas等[17]对ICSI和IVF后冷冻合子的存活率、发育率、胚胎形态及植入率和胚胎细胞丢失发生率等作了比较，其中，两者的存活率相当(ICSI合子为87.7%，IVF合子为89.1%)，ICSI合子的植入率和继续发育能力受到冷冻保存方法的影响。
Cohen等[21]提出体外受精-胚胎移植(IVF-ET)植入率下降可能与胚胎难以从透明带中孵化出来有关。孵化功能受损可能是由于在人工环境中培养时间延长或干扰了内源性囊胚孵化机制[22]。这种孵化功能受损可能因冷冻融解过程而加重[23]。Jerome等[23]在一项回顾性研究中发现，在79个配对的孵化组和未孵化组，妊娠率分别为30.4%(24个)、15.2%(12个)，植入率为13.7%和5.3%。多胎妊娠率送别无显著性。该研究结果表明，辅助孵化对冷冻胚胎无害，反而有利于提高妊娠率，克服可能由冷冻因素引发的透明带硬化。
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(四)其它 除上述因素外，胚胎冷冻保存的时间、移植胚胎数目及胚胎融解后能否继续分裂等因素也影响胚胎冷冻结果。
Testart等[24]研究发现，随着胚胎冷冻保存时间的延长，胚胎存活率呈现下降趋势，冷冻保存一个月和三个月的胚胎存活率分别为71%和53%。但近年来的研究结果表明，胚胎冷冻保存结果与贮存时间无关[26]。
Queenan等[25]发现移植胚胎数目是决定妊娠率和植入率的重要因素之一。随着移植胚胎数目的增加，妊娠率也随之上升。
Van der Elst等[26]选择冷冻融解后继续卵裂的多细胞胚胎进行移植，与混合两种胚胎移植者比较，结果发现能显著提高胚胎植入率和分娩率，在无继续卵裂的胚胎组无一发生分娩。
三、母体因素
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经过冷冻融解后，胚胎在何时移植入母体及母体在此时应作好哪些准备就成为胚胎冷冻成功最后的决定因素。
(一)年龄 以往研究结果表明，40岁以上年龄组患者的生育能力明显下降，在进行冷冻胚胎移植时的情况也一样。Queenan等[13]发现，虽然在激素替代周期也有这种随年龄增高而出现妊娠率和植入率下降趋势，但在自然周期，这种临床妊娠率和植入率的下降更为显著，其原因可能是激素替代治疗克服了年龄对植入率和妊娠率的副作用。Schalkoff等[27]发现，40岁以上年龄组的妊娠率急剧下降，在22例患者中无一发生妊娠，而在35～39岁年龄组的妊娠率为31%；Al-Shawaf等[28]的研究也发现，在40岁以上年龄组之前并示当生妊娠率的显著下降。上述研究结果提示自然周期妊娠率下降发生在35～40岁之间，也提示激素替代治疗拮抗了这种作用。
(二)移植时机 一般情况下，融解胚胎移植时都要求子宫内膜的发育与胚胎年龄同步化。通常，采用自然周期对冷冻胚胎进行移植，但也采用激素刺激周期(在无排卵时)和人工周期。在自然周期，一般在排卵当天或第2d进行移植。在无排卵或月经周期不规则的患者，常使用激素替代治疗，给胚胎移植时机带来困难。Barouxs等[29]对卵巢功能衰竭患者移植冷冻胚胎的妊娠率达31%，而且，子宫内膜和胚胎年龄并没有严格同步化，这一研究结果表明，子宫内膜窗开放的时间较前认为的长。Kondo等[12]将胚胎移植延后一天或一天以上，也发现子宫内膜发育和胚胎发育阶段两者不同步并不降低妊娠率。
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有研究表明，激素替代周期的妊娠率高于自然周期者[25]。同时，采用自然周期获得妊娠依赖于子宫内膜和胚胎年龄的严格同步化，冷冻融解胚胎的移植时机必须使子宫内膜与胚胎年龄相匹配。为了获得同步化。对卵泡发育及激素水平的监测工作相当繁重。为了避免卵巢功能的影响，Jaroudi等[30]提出一个固定激素替代方案，使胚胎移植周期因卵巢功能不全等所造成的取消率下降，也因避免激素和B超监测而方便了患者和实验室工作人员，同时，还预先知道哪一天移植。Queenan等[13]对在Jones研究所7年的冷冻移植周期做了一项回顾性评价，自然周期和激素替代周期的总妊娠率相似(28%和30%)，植入率几乎相等(12%和10%)，但是，多胎妊娠率在自然周期高于激素替代周期(P=0.062)。
以往在外源性甾体激素人工周期之前，常使用促性腺激素释放激素(GnRH)下调垂体。为了分析人工周期不使用GnRH的可能性，Simon等[31]采用随机、前瞻性研究方法，比较了使用与不使用GnRH人工周期(17-βoestradiol和progesterone)对冷冻胚胎移植结果的影响，两组的妊娠率相似(分别为26.4%和21.1%)。在人工周期之前不使用GnRH下调垂体进一步简化了移植周期和降低了费用。
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(三)子宫内膜厚度 一些研究表明，子宫内膜厚度和移植结果之间的关系密切。获得成功植入的最低子宫内膜厚度为5～8mm[32]。为了使子宫内膜厚度达到该标准，Simon等[31]在使用和不使用GnRH组分别采用17β-雌二醇4mg/d和6mg/d。
综上所述，人类胚胎冷冻结果常以冷冻融解后的胚胎存活率、植入率和妊娠率等一些参数进行评价。多方面因素如胚胎冷冻融解方法、胚胎自身及母体均会影响最终的结果，其中尤以胚胎质量与母体年龄起最为重要的作用。
参考文献
1 Trounson A,Mohr L.Nature,1983;305:707-709
2 Freeman L,Trounson A,Kirby C.J Vitro Fertil Embryo Tranfer,1986;3:53
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3 Cohen J,Simons FR,Edwards RG et al.J Vitro Fertil Embryo Tranfer,1985;2:59
4 Lasalle B,Testart J,Renard JP.Fertil Steril,1985;44:645
5 van der Elst J,Maes R,Camus M et al.Fertil Steril,1995;63:92
6 Mandelbaum J,Junca AM,Plachot M et al.Hum Reprod,1987;2:709
7 Arav A,Rubinsky B,Fletcher G et al.Mol Reprod Dev,1993;36:488
8 Trouson A.Fertil Steril,1988;50:373
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9 Mohr LR,Trouson A,Freeman L,J Vitro Fertil Embryo Tranfer,1985;2:1
10 Veeck LL.Fertil Reprod Med Clin North Am,1993;4:709
11 Mandelbaum J,Junca AM,Plachot M et al.Hum Reprod,1988;3:117
12 Kodon I,Suganuma N,Ando T et al.J Assit Reprod Genet,1996;13:201
13 Queenan JT,Veeck LL,Mausher SJ.Endocrinolog,1995;13:64
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16 Kowalik A,Palermo GD,Barmat L et al.Hum Reprod,1998;13:2848
17 Macas E,Imthurn B,Borsos M et al.Fertil Steril,1998;69:630
18 Fehilly CB,Cohen J,Simons RF et al.Fertil Steril,1985;44:638
19 Hartshorne GM,Elder K,Crow J et al.Fertil Steril,1991;6:136
20 Camus M,van den Abbeel E,Van Waseberghe L et al.Fertil Steril,1989;51:460
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21 Cohen J,Elsner C,Kort H et al.Hum Reprod,1990;5:7
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23 Jerome H,O’shaughnessy A,Hoover L et al.Fertil Steril,1996;65:254
24 Testart J,Lassalle B,Gazengel A et al.Fertil Steril,1987;48:107
25 Queenan JT,Veeck L,Seltman H et al.Fertil Steril,1994;62:545
26 van der Elst J,van den Abbeel E,Vitrier S et al.Hum Reprod,1997;12:1513
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27 Schalkoff ME,Oskowitz SP,Douglas PR.Fertil Steril,1993;59:1070
28 Al-Shawaf T,Craft I.Br Med J,1992;305:51
29 Barouxs J,Cornet D,Alvarez S et al.Fertil Steril,1988;49:817
30 Jaroudi KA,Hamilton CJCM,Willemsen WNP et al. -Fertil Steril,1991;55:835
31 Simon A,Hurwitz A,Zentner BS et al.Hum Reprod,1998;13:2712-2717
32 Abdalla HI,Brook AA,Johnson MR et al.Hum Reprod,1994;9:363
(收稿日期：1999-01-04)
录入：李夏阁
校对时间：2000/3/9 17：36 任媛媛, 百拇医药
李忠妹综述 汪玉宝 冯缵冲审校
摘要 自第一次人类胚胎冷冻成功并获妊娠至今已有十多年的历史，探求人类胚胎冷冻保存的影响因素一直是该领域的重要课题之一。影响人类胚胎冷冻保存结果的因素众多，主要有胚胎的质量和分裂阶段、母体年龄及移植时机以及冷冻保护剂和冷冻融解程序等几方面，其中，尤以胚胎质量及母体年龄起重要作用。在多种冷冻方法中，现较多采用慢速冷冻、快速融解方法，但其它方法也有其优势；蔗糖等非渗透性保护剂和渗透性保护剂联合使用常取得较好效果。胚胎质量、分裂阶段、移植数目等也影响最终结果，随着其它技术如胞浆内单精子注射(ICSI)、辅助孵化的不断成熟，进一步提高了冷冻融解胚胎妊娠率和植入率。母体年龄及选择最佳的胚胎移植时机是决定冻胚胎能否发生妊娠的最后关键因素。
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关键词：胚胎冷冻 生殖辅助技术 丙二醇 二甲亚砜
人类胚胎贮存于-196℃及无损伤融解，是生殖辅助技术(assisted reproductive technology,ART)领域的重大突破之一。胚胎冷冻技术提高了促排卵治疗效益，降低了多胎妊娠及其并发症发生率，也可满足胚胎赠送的需要。从冷冻技术第一次成功应用于胚胎并获妊娠[1]至今已有十多年，有关的技术、方法不断成熟。如何提高冷冻胚胎存活率、植入率、妊娠率等是该领域的重要课题之一，涉及胚胎、冷冻方法和母体等诸多方面。
一、冷冻融解方法
胚胎冷冻融解方法主要是指冷冻保护剂和冷冻融解程序两个方面。
(一)冷冻保护剂 1983年，Trounson和Mohr采用慢速冷冻方法，以二甲亚砜(dimethylsulphoxide，DMSO)为冷冻保护剂首次成功移植冷冻4～8细胞人类胚胎并获妊娠[1]。Freeman等[2]以DMSO为冷冻保护剂冷冻第2～3d的胚胎；Cohen等[3]采用甘油(glycerol)为冷冻保护剂对第5～6d的胚胎进行冷冻；Lassalle等[4]采用丙二醇(1，2-propanediol，PROH)对仅是第1～2d的胚胎进行冷冻。自此，对囊胚期胚胎采用甘油、1～4细胞胚胎冷冻采用PROH、4～8细胞胚胎采用DMSO作为冷冻保护剂。在原核期胚胎，采用PROH作为冷冻保护剂，能获得70%～80%的胚胎存活率。但是，在多细胞胚胎采用PROH，胚胎存活率显著下降，其原因可能是与细胞渗透性和表面/体积比的改变有关。以上有关研究很多为非随机的，van der Elst等[5]采用随机前瞻性研究方法对DMSO、PROH和DMSO+PROH三种方法作了比较，结果发现DMSO组胚胎存活率(52.6%,122/232)显著高于PROH组(32.0%,80/250,P<0.0001),临床妊娠率(25%,11/44)也明显高于PROH组(6.5%,3/46).该研究结果提示采用慢速冷冻融解方法,以1.5MDMSO为冷冻保护剂是2～8细胞胚胎冷冻的最佳方案。
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上述PROH、DMSO和甘油等均为渗透性冷冻保护剂(permeating cryoprotectant)。除此之外，非渗透性冷冻保护剂(non-permeating cryoprotectant)常与渗透性冷冻保护剂联合使用。与渗透性冷冻保护剂不同，非渗透性保护剂如蔗糖并不进入细胞，主要是通过改变细胞外渗透性引起细胞脱水，发挥非特异性保护作用，在起初平衡阶段及在融解时降低渗透压休克的发生。Mandelbaum等[6]应用PROH+蔗糖能显著提高胚胎存活率和妊娠率。
近年来，随着抗冷冻蛋白(anti-freeze protein)研究在动物实验中的不断进步，也有报道使用抗冷冻蛋白对人类卵母细胞的冷冻[7]，但至今仍无对胚胎冷冻的报道。
(二)冷冻融解程序 人类胚胎冷冻融解程序主要采用四种方法：慢速冷冻、慢速融解；慢速冷冻、快速融解；玻璃化技术；超快速冷冻法。Trouson等[8]报道采用超快速冷冻方法获得较高的存活率和继续卵裂率(分别为82%和78%)，且透明带损伤也较慢速冷冻、慢速融解方法者为轻，但采用此法后的胚胎不发生植入和妊娠。Mohr等[9]发现，慢速冷冻较快速冷冻法能取得更高的胚胎存活率。现在，大多数的实验室较多采用慢速冷冻、快速融解方法。所谓的玻璃化技术，是指将冷冻保护剂浓度提高至呈玻璃样状态(重量/体积=40%)[10]。避免了冰晶形成。该法在动物特别是小鼠胚胎冷冻取得较好的效果，在人类胚胎冷冻的效果则较差。
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二、胚胎因素
胚胎的质量、分裂阶段及结合一些新ART技术，如：胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)、辅助孵化(assisted hatching)等构成胚胎自身影响冷冻结果的因素。
(一)胚胎质量 胚胎质量是影响冷冻胚胎结果的重要因素，常由其形态学特征确定。Veeck将胚胎按形态分为五级：Ⅰ°，胚胎基本无明确裂球，有大或完全碎片；Ⅱ°，有不规则或不均一的裂球，碎片大到中度；Ⅲ°，胚胎有不均一裂球，有小的细胞浆内碎片；Ⅳ°，胚胎有规则、均一裂球，有小的细胞浆内碎片；Ⅴ°，胚胎有规则、均一裂球，无细胞浆内碎片。Mandelbaum等[11]发现，正常形态组胚胎存活率最高，为67%，而有细胞内碎片或卵裂球大小不均组的胚胎存活率明显下降，分别为49%和54%。一般情况下，经冷冻融解后保持50%以上裂球完整的胚胎为存活胚胎，包括完全受损和50%～80%裂球完整的胚胎。Kondo等[12]发现，在86个质量好的胚胎中，有31个发生植入，而质量差的胚胎则无胚胎发生植入。除冷冻前胚胎质量外，Veeck等[10]报道冷冻融解后胚胎形态与妊娠率密切相关，Ⅰ°～Ⅴ°级胚胎的妊娠率分别为9%、15%、19%、32%和43%。Queenan等[13]认为冷冻融解后胚胎质量作为预测冷冻成功的指标更佳，尤其当冷冻胚胎处于原核期以及形态较为均一时。
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基于高质量冷冻胚胎能获得高妊娠率以及质量差的胚胎更易受冷冻损伤，Lightman等[14]研究了“扶助胚胎”(sponsoring embryo)对质量差胚胎植入率与妊娠率的影响。所谓扶助胚胎，是指Ⅲ°及以上、第2d胚胎有2～6个细胞而在第3d有个以上的高质量胚胎。结果发现，扶助胚胎与质量较差胚胎一起移植后，使妊娠率从9.8%增加到18.2%，植入率也从3.1%提高到7.0%。
(二)胚胎分裂阶段 胚胎冷冻结果与胚胎发育阶段常使用胚胎存活率、胚胎不受影响比例和胚胎细胞存活情况三个指标。
如前所述，由于胚胎所处分裂阶段的不同，所使用的冷冻保护剂也有所不同。但至今对几种冷冻保护剂特别是DMSO和PROH适合哪一胚胎分裂阶段的冷冻仍有争议。
胚胎发育阶段对胚胎冷冻融解后存活率的影响一直是该领域关注的焦点。有些学者主张对原核期胚胎进行冷冻，能取得与未冷冻胚胎近似的妊娠率，或其存活率较早卵裂期的胚胎存活率高[15]。但也有报道冷冻融解后合子和早卵裂期胚胎的存活率并无明显差异[16]。
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在胚胎的原核期，合子年龄是决定冷冻胚胎植入的重要因素[17]。所谓合子年龄是指从受精到冷冻之间的一段时间。一般认为在体外受精(IVF)合子完成原核移动在受精后20～24h。对于采用ICSI方法的合子冷冻时间相应提前。随着合子年龄的增长，植入率与之呈反比关系。
随着体外培养时间的延长，胚胎存活率下降。Fehilly等[18]认为将胚胎在体外培养到囊胚期可以优选质量好的胚胎，然后再进行冷冻。结果发现，只25%的胚胎能发育到囊胚期，一个周期移植1～2个冷冻囊胚期胚胎的妊娠率高达35%。这一结果很令人鼓舞。但是，以后的研究并未提示冷冻囊胚期胚胎的妊娠率高于早卵裂期胚胎[19]。
Lasalle等[4]发现胚胎细胞数目呈指数性(2-，4-，8-)时的存活率(67%，20/30)高于中间分裂阶段(3-，5-，6-，7-)时的存活率(22%，2/9)。以后又有类似的报道[20]。其原因可能是处于分裂中间阶段的胚胎有几个卵裂球核不在分裂间期，以致与膜或有丝分裂纺锤体的不稳定性有关。
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(三)与其它新ART技术的结合 近年来，ART领域内ICSI和辅助孵化等新技术、新方法不断涌现，并与人类胚胎冷冻保存方法日益紧密结合。
在ICSI技术引入男性不育症治疗后，原采用IVF预后极差的不孕夫妇能成功地得到治疗。正是该法能取得较高的受精率和植入率，大量多余胚胎为冷冻提供了可能。Kowalik等[16]发现，采用ICSI和常规IVF和早期胚胎冷冻后的植入率和存活率(分别为11.6%和8.6%，73.2%和70.5%)相当。该研究结果表明ICSI不会对冷冻胚胎植入率产生负面效应，ICSI胚胎冷冻保存是可取的，Macas等[17]对ICSI和IVF后冷冻合子的存活率、发育率、胚胎形态及植入率和胚胎细胞丢失发生率等作了比较，其中，两者的存活率相当(ICSI合子为87.7%，IVF合子为89.1%)，ICSI合子的植入率和继续发育能力受到冷冻保存方法的影响。
Cohen等[21]提出体外受精-胚胎移植(IVF-ET)植入率下降可能与胚胎难以从透明带中孵化出来有关。孵化功能受损可能是由于在人工环境中培养时间延长或干扰了内源性囊胚孵化机制[22]。这种孵化功能受损可能因冷冻融解过程而加重[23]。Jerome等[23]在一项回顾性研究中发现，在79个配对的孵化组和未孵化组，妊娠率分别为30.4%(24个)、15.2%(12个)，植入率为13.7%和5.3%。多胎妊娠率送别无显著性。该研究结果表明，辅助孵化对冷冻胚胎无害，反而有利于提高妊娠率，克服可能由冷冻因素引发的透明带硬化。
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(四)其它 除上述因素外，胚胎冷冻保存的时间、移植胚胎数目及胚胎融解后能否继续分裂等因素也影响胚胎冷冻结果。
Testart等[24]研究发现，随着胚胎冷冻保存时间的延长，胚胎存活率呈现下降趋势，冷冻保存一个月和三个月的胚胎存活率分别为71%和53%。但近年来的研究结果表明，胚胎冷冻保存结果与贮存时间无关[26]。
Queenan等[25]发现移植胚胎数目是决定妊娠率和植入率的重要因素之一。随着移植胚胎数目的增加，妊娠率也随之上升。
Van der Elst等[26]选择冷冻融解后继续卵裂的多细胞胚胎进行移植，与混合两种胚胎移植者比较，结果发现能显著提高胚胎植入率和分娩率，在无继续卵裂的胚胎组无一发生分娩。
三、母体因素
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经过冷冻融解后，胚胎在何时移植入母体及母体在此时应作好哪些准备就成为胚胎冷冻成功最后的决定因素。
(一)年龄 以往研究结果表明，40岁以上年龄组患者的生育能力明显下降，在进行冷冻胚胎移植时的情况也一样。Queenan等[13]发现，虽然在激素替代周期也有这种随年龄增高而出现妊娠率和植入率下降趋势，但在自然周期，这种临床妊娠率和植入率的下降更为显著，其原因可能是激素替代治疗克服了年龄对植入率和妊娠率的副作用。Schalkoff等[27]发现，40岁以上年龄组的妊娠率急剧下降，在22例患者中无一发生妊娠，而在35～39岁年龄组的妊娠率为31%；Al-Shawaf等[28]的研究也发现，在40岁以上年龄组之前并示当生妊娠率的显著下降。上述研究结果提示自然周期妊娠率下降发生在35～40岁之间，也提示激素替代治疗拮抗了这种作用。
(二)移植时机 一般情况下，融解胚胎移植时都要求子宫内膜的发育与胚胎年龄同步化。通常，采用自然周期对冷冻胚胎进行移植，但也采用激素刺激周期(在无排卵时)和人工周期。在自然周期，一般在排卵当天或第2d进行移植。在无排卵或月经周期不规则的患者，常使用激素替代治疗，给胚胎移植时机带来困难。Barouxs等[29]对卵巢功能衰竭患者移植冷冻胚胎的妊娠率达31%，而且，子宫内膜和胚胎年龄并没有严格同步化，这一研究结果表明，子宫内膜窗开放的时间较前认为的长。Kondo等[12]将胚胎移植延后一天或一天以上，也发现子宫内膜发育和胚胎发育阶段两者不同步并不降低妊娠率。
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有研究表明，激素替代周期的妊娠率高于自然周期者[25]。同时，采用自然周期获得妊娠依赖于子宫内膜和胚胎年龄的严格同步化，冷冻融解胚胎的移植时机必须使子宫内膜与胚胎年龄相匹配。为了获得同步化。对卵泡发育及激素水平的监测工作相当繁重。为了避免卵巢功能的影响，Jaroudi等[30]提出一个固定激素替代方案，使胚胎移植周期因卵巢功能不全等所造成的取消率下降，也因避免激素和B超监测而方便了患者和实验室工作人员，同时，还预先知道哪一天移植。Queenan等[13]对在Jones研究所7年的冷冻移植周期做了一项回顾性评价，自然周期和激素替代周期的总妊娠率相似(28%和30%)，植入率几乎相等(12%和10%)，但是，多胎妊娠率在自然周期高于激素替代周期(P=0.062)。
以往在外源性甾体激素人工周期之前，常使用促性腺激素释放激素(GnRH)下调垂体。为了分析人工周期不使用GnRH的可能性，Simon等[31]采用随机、前瞻性研究方法，比较了使用与不使用GnRH人工周期(17-βoestradiol和progesterone)对冷冻胚胎移植结果的影响，两组的妊娠率相似(分别为26.4%和21.1%)。在人工周期之前不使用GnRH下调垂体进一步简化了移植周期和降低了费用。
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(三)子宫内膜厚度 一些研究表明，子宫内膜厚度和移植结果之间的关系密切。获得成功植入的最低子宫内膜厚度为5～8mm[32]。为了使子宫内膜厚度达到该标准，Simon等[31]在使用和不使用GnRH组分别采用17β-雌二醇4mg/d和6mg/d。
综上所述，人类胚胎冷冻结果常以冷冻融解后的胚胎存活率、植入率和妊娠率等一些参数进行评价。多方面因素如胚胎冷冻融解方法、胚胎自身及母体均会影响最终的结果，其中尤以胚胎质量与母体年龄起最为重要的作用。
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(收稿日期：1999-01-04)
录入：李夏阁
校对时间：2000/3/9 17：36 任媛媛, 百拇医药