建立人胚胎干细胞系的研究进展
作者：李牧 葛伟文
单位：李牧(中国医学科学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津 300020)；葛伟文(中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)
关键词：胚胎；干细胞
中国病理生理杂志000327 [中图分类号] Q813 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)03-0283-03
Progress in the establishment of human embryonic stem cell lines
LI Mu
(State Key Lab of Experimental Hematology,Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020, China)
, http://www.100md.com
GE Wei-wen
(Institute of Hygiene & Environmental Medicine, Chinese Academy of Military Medicine， Tianjin 300050, China)
【A Review】 Embryonic stem(ES) cells are derived from totipotent cells of the early mammalian embryo and are capable of unlimited, undifferentiated proliferation in vitro. The establishment of mouse ES cell lines demonstrated the unmatchable convenience for the study of mouse embryonic development and the particular gene regulation and function. It has been long expected to construct such cell line for human. Here we summarized the development in the construction of human ES cell line, its potential utilization in various fields and the possible ethical dilemmas it brought with were also discussed.
, http://www.100md.com
[MeSH] Embryo; Stem cells
(引言):本文概括介绍了人类胚胎干细胞系的建立、其广阔而独特的应用前景及发展中可能出现的问题和障碍。
在最近一期的SCIENCE(1998年11月6日出版)和PNAS(1998年11月10日出版)杂志上，分别报道了两个实验室以不同手段几乎同时成功地建立起人胚胎干细胞系，学者们给予了极高的评价，反映人们在这一领域长时间的期望和对将来的热切憧憬。本文介绍这一领域的历史、现状和展望。
存在于哺乳动物发育早期胚胎(着床前)中的多能干细胞，具有持续增殖而不分化的能力，以及经诱导后可分化形成一个成熟个体中所有类型的细胞潜能[1]。这种被称作胚胎干细胞(embryonic stem, ES)的特殊细胞在基础研究及临床应用中都具有十分重要的价值。然而，ES细胞往往难以在体外保持其不分化的增殖状态，严重影响了人们对这种细胞的研究和应用。直到最近，人们还普遍认为，脊椎动物中只有小鼠ES才能在体外建成无限繁殖又不分化的细胞系[2]。许多工作都致力于揭示影响建系能力的各种因素，如供体基因型及细胞体外培养周期等[2]。目前以为，小鼠ES细胞系的建立[3,4]从根本上依赖于小鼠细胞所特有的某种信号传递系统，如白血病抑制因子(leukemia inhibitive factor, LIF)及相关细胞因子系统或某种相应的应急系统[5]。人们尚不清楚其它细胞，包括人体细胞中是否也具有与此相类似的系统。
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小鼠ES细胞系的建立，结合基因打靶技术的应用，向人们展示了ES细胞系所能提供给人们的极广阔的应用前景。人们能够获得大量特定基因型的细胞用于罹病细胞的替换或系统的重建；也使得人们可以培育出特定基因的纯合小鼠，可以在整体水平研究小鼠胚胎发育、基因功能与调控等多种现象。这种优势一直激励着人们知难而上，致力于人ES细胞系的建立。Thomson领导的小组，多年从事哺乳类动物胚胎干细胞的研究，期间所积累起的经验，使他们敢于尝试人ES细胞系的建立[6]。他们将合法获得的体外受精的人早期胚胎在体外培养至囊胚期，参照恒河猴ES细胞分离法[7]，以抗BeWO细胞的单抗作免疫标记，剔除外层细胞，以35 gray γ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞作滋养层，体外培养人囊胚内细胞群(inner cell mass)，9～15 d后，将长出的细胞团吹散或者用胰酶或EDTA消化，然后继续在小鼠滋养层细胞上生长；挑选具有均一的未分化形态的单克隆细胞团，吹散成50～100个细胞的小团后再行培养；如此重复，直至成系。期间每一步都需观察细胞染色体核型，以确定其未曾癌变。此后细胞系经吹打或胶原酶IV处理长期传代。作者从14个囊胚中，最终建立起5个人类ES细胞系，包括3个XY核型细胞系及两个XX核型细胞系。这些成系细胞从形态上观察，具有较高的核质比例、明显的核仁及与恒河猴ES细胞相似的克隆形态；它们表达高水平的端粒酶活性，端粒酶负责维持染色体末端的完整性[8]，为包括人胚胎干细胞在内的永生细胞所特有，分化细胞内无此酶活性[9]；细胞表面表达灵掌类胚胎干细胞所特有的未分化抗原，包括SSEA-3，-4、TRA-1-60，-81及碱性磷酸酯酶。作者还将所建细胞注射到严重联合免疫缺陷的小鼠(SCID mice)中，获得畸胎瘤，组织学实验分析其中包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞，直接证明所建细胞具有多向分化的全能性。作者已经成功地将细胞体外传至32代，并经反复的冻融，细胞核型依然保持正常和稳定。
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Gearhart领导的小组，几乎在同时发表了他们建立人胚胎干细胞系的报道[10]。他们采取了与Thomson小组不同的方法，从5～9周龄流产胎儿的性腺嵴(gonadal ridges)及肠系膜中分离原始的干细胞(primordial germ cells，PGCs)，这也是一种多能的胚胎干细胞，为区别ES细胞，命名为embryonic germ (EG) 细胞。这样有可能避免因直接利用胚胎而造成的伦理学上的麻烦。作者将EG细胞体外培养于小鼠成纤维细胞层上，培养体系中加入重组人白血病抑制因子，重组人碱性成纤维细胞生长因子及forskolin， 7～21 d后形成较大的多细胞集落，其形态与小鼠EG或ES细胞集落相似。作者经过一系列与Thomson实验室相似的免疫组化及功能实验，证明获得了可成系的两种核型的人胚胎干细胞集落。
人ES细胞系的建立将促进对人胚胎发育细节的基础研究。在此之前，有关人胚胎发育的研究都是基于动物模型，主要是小鼠模型之上，然而，人与动物胚胎之间却存在很大的差别，例如，人与小鼠在胎盘、胚胎外膜结构及胚胎层面上都有本质上的区别。如今，人们可以培育出大量人胚胎发育过程中不同时期的细胞，通过对它们基因表达的研究观察，有望认识畸胎儿发生的机制。另一个有望在短期内就能体现的优势在于医用药物的筛选中，目前用于药物筛选的细胞都来源于动物或癌细胞这样非正常的人体细胞，而ES细胞系可以经体外定向诱导，为人们提供大量各种组织类型的人体细胞。定向分化的尝试在小鼠中已取得可喜结果，神经元、造血细胞及心肌细胞已在体外经诱导获得[11～13]，而体外随意诱导人类体细胞的愿望可望不久成为现实。ES细胞系最大的优势可能在于能为器官移植提供无免疫异原性的材料[14]。许多人类的疾病，如帕金森氏病及某些类型的糖尿病都是个别类型细胞的死亡或功能异常引起的，只要向病人移植正常功能的同类细胞，即可获得治疗。人们可以以多种手段改造ES细胞系，经定向诱导分化，即可获得无免疫排斥的单纯特定细胞用以移植[15]，手段包括：1) 建立包含多种MHC基因型的胚胎干细胞库以供随意选用；2) 建立经遗传改构的通用型MHC基因型胚胎干细胞系，这种细胞已在小鼠中获得初步的成功；3) 借助基因打靶技术，度身定做一个与受者MHC同型的ES细胞系；4) 借助核移植技术，将受者细胞的全部基因组转移给ES细胞，建立特定受体相同基因组型的干细胞系。
, 百拇医药
当然，目前欢呼新时代的到来尚为时过早，依然存在许多有待提高甚至验证的因素。作者所报道的实验方法和步骤从表面上看来并无特殊之处，许多其它实验室一直在以同样的方法试图获得人ES细胞系，人们希望进一步看到这一实验结果的可靠性和重复性；另外，从14个囊胚出发才建立起5个细胞系，是否还能提高建系效率；以前人们一直认为，小鼠细胞中LIF相关信号系统的存在是支持从小鼠囊胚建立小鼠ES细胞系的关键，那么，是什么系统对于建立人ES细胞系至关重要呢？甚至还有人怀疑，借助小鼠建系的经验和方法，是否真能建立起人的ES细胞系呢。进一步讲，即使解决了上述疑惑，人们依然还有很多工作要完成，首先人们还不能有效地诱导干细胞向特定的细胞类型分化，另外，更困难的是，还不能有效地建立起无免疫原性的ES细胞系。而撇开技术因素，人ES细胞系的建立和应用还涉及到伦理道德方面观念的制约。在90年代初，当人们第一次谈论起建立人ES细胞系前景时，美国政府已经制定出法律限制国家基金资助相应的工作，而在今年10月通过的美国国家拨款条例中又就此内容进行了更严格的限定。SCIENCE杂志在刊登相应文章的同时，还特意发表了编者按，解释发表此类文章背后的抉择，显得极其谨慎。种种限制制约了多数研究者继续从事这一领域的工作，而愿意提供开展这方面工作的私人和集团基金也因担心没有回报而忧心忡忡，必然会影响这一领域的顺利发展。但很显然，这一领域发展中的瓶颈问题已经得到初步的解决，人们有理由为此感到欢欣鼓舞。
, 百拇医药
(本文承蒙吴克复教授、尤胜国教授审阅，谨致谢忱。)
[参 考 文 献]
[1] Thomson J A, Marshall V S. Primate embryonic stem cells[J]. Curr Top Dev Biol, 1998,38:133～165.
[2] Hong Y, Winkler C, Schartl M. Efficiency of cell culture derivation from blastula embryos and of chimera formation in the medaka(Oryzias latipes) depends on donor genotype and passage number[J]. Dev Genes Evol, 1998, 208(10): 595～602.
, 百拇医药
[3]Evans MJ. Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J]. Nature,1981, 292(5819):154～156.
[4] Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1981, 78(12):7634～7638.
[5] Dani C, Chambers I, Johnstone S, et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: A new ES cell regulatory pathway[J]. Dev Biol, 1998, 203(1):149～162.
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[6] Thomson J A, Itskovitz-Eldor J, Shapiro S S, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J]. Science, 1998, 282(5391):1145～1147.
[7] Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, et al. Isolation of a primate embryonic stem cell line[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92(17):7844～7848.
[8] Harley C B. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb[J]? Mutat Res, 1991, 256(2-6):271～282.
, 百拇医药
[9] Wright W E, Piatyszek M A, Rainey W E, et al. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells[J]. Dev Genet, 1996, 18(2):173～179.
[10] Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, et al. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(23):13726～13731.
[11] Bain G, Kitchens D, Yao M, et al. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro[J]. Dev Biol, 1995, 168(2):342～357.
, http://www.100md.com
[12] Wiles MV, Keller G. Multiple hematopoietic lineages develop from embryonic stem (ES) cells in culture[J]. Development, 1991, 111(2):259～267.
[13] Klug MG, Soonpaa MH, Koh GY, et al. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts [J]. J Clin Invest, 1996, 98(1):216～224.
[14] Marshall E. A versatile cell line raises scientific hopes, legal questions [J]. Science, 1998, 282(5391):1021～1022.
[15] Gearhart J. New potential for human embryonic stem cells[J]. Science, 1998, 282(5391):1061～1062.
[收稿日期] 1998-12-04 [修回日期] 1999-04-13
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单位：李牧(中国医学科学院血液学研究所实验血液学国家重点实验室，天津 300020)；葛伟文(中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所，天津 300050)
关键词：胚胎；干细胞
中国病理生理杂志000327 [中图分类号] Q813 [文献标识码] A
[文章编号] 1000-4718(2000)03-0283-03
Progress in the establishment of human embryonic stem cell lines
LI Mu
(State Key Lab of Experimental Hematology,Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300020, China)
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GE Wei-wen
(Institute of Hygiene & Environmental Medicine, Chinese Academy of Military Medicine， Tianjin 300050, China)
【A Review】 Embryonic stem(ES) cells are derived from totipotent cells of the early mammalian embryo and are capable of unlimited, undifferentiated proliferation in vitro. The establishment of mouse ES cell lines demonstrated the unmatchable convenience for the study of mouse embryonic development and the particular gene regulation and function. It has been long expected to construct such cell line for human. Here we summarized the development in the construction of human ES cell line, its potential utilization in various fields and the possible ethical dilemmas it brought with were also discussed.
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[MeSH] Embryo; Stem cells
(引言):本文概括介绍了人类胚胎干细胞系的建立、其广阔而独特的应用前景及发展中可能出现的问题和障碍。
在最近一期的SCIENCE(1998年11月6日出版)和PNAS(1998年11月10日出版)杂志上，分别报道了两个实验室以不同手段几乎同时成功地建立起人胚胎干细胞系，学者们给予了极高的评价，反映人们在这一领域长时间的期望和对将来的热切憧憬。本文介绍这一领域的历史、现状和展望。
存在于哺乳动物发育早期胚胎(着床前)中的多能干细胞，具有持续增殖而不分化的能力，以及经诱导后可分化形成一个成熟个体中所有类型的细胞潜能[1]。这种被称作胚胎干细胞(embryonic stem, ES)的特殊细胞在基础研究及临床应用中都具有十分重要的价值。然而，ES细胞往往难以在体外保持其不分化的增殖状态，严重影响了人们对这种细胞的研究和应用。直到最近，人们还普遍认为，脊椎动物中只有小鼠ES才能在体外建成无限繁殖又不分化的细胞系[2]。许多工作都致力于揭示影响建系能力的各种因素，如供体基因型及细胞体外培养周期等[2]。目前以为，小鼠ES细胞系的建立[3,4]从根本上依赖于小鼠细胞所特有的某种信号传递系统，如白血病抑制因子(leukemia inhibitive factor, LIF)及相关细胞因子系统或某种相应的应急系统[5]。人们尚不清楚其它细胞，包括人体细胞中是否也具有与此相类似的系统。
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小鼠ES细胞系的建立，结合基因打靶技术的应用，向人们展示了ES细胞系所能提供给人们的极广阔的应用前景。人们能够获得大量特定基因型的细胞用于罹病细胞的替换或系统的重建；也使得人们可以培育出特定基因的纯合小鼠，可以在整体水平研究小鼠胚胎发育、基因功能与调控等多种现象。这种优势一直激励着人们知难而上，致力于人ES细胞系的建立。Thomson领导的小组，多年从事哺乳类动物胚胎干细胞的研究，期间所积累起的经验，使他们敢于尝试人ES细胞系的建立[6]。他们将合法获得的体外受精的人早期胚胎在体外培养至囊胚期，参照恒河猴ES细胞分离法[7]，以抗BeWO细胞的单抗作免疫标记，剔除外层细胞，以35 gray γ射线照射的小鼠胚胎成纤维细胞作滋养层，体外培养人囊胚内细胞群(inner cell mass)，9～15 d后，将长出的细胞团吹散或者用胰酶或EDTA消化，然后继续在小鼠滋养层细胞上生长；挑选具有均一的未分化形态的单克隆细胞团，吹散成50～100个细胞的小团后再行培养；如此重复，直至成系。期间每一步都需观察细胞染色体核型，以确定其未曾癌变。此后细胞系经吹打或胶原酶IV处理长期传代。作者从14个囊胚中，最终建立起5个人类ES细胞系，包括3个XY核型细胞系及两个XX核型细胞系。这些成系细胞从形态上观察，具有较高的核质比例、明显的核仁及与恒河猴ES细胞相似的克隆形态；它们表达高水平的端粒酶活性，端粒酶负责维持染色体末端的完整性[8]，为包括人胚胎干细胞在内的永生细胞所特有，分化细胞内无此酶活性[9]；细胞表面表达灵掌类胚胎干细胞所特有的未分化抗原，包括SSEA-3，-4、TRA-1-60，-81及碱性磷酸酯酶。作者还将所建细胞注射到严重联合免疫缺陷的小鼠(SCID mice)中，获得畸胎瘤，组织学实验分析其中包含了源于全部3个胚层的各种分化细胞，直接证明所建细胞具有多向分化的全能性。作者已经成功地将细胞体外传至32代，并经反复的冻融，细胞核型依然保持正常和稳定。
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Gearhart领导的小组，几乎在同时发表了他们建立人胚胎干细胞系的报道[10]。他们采取了与Thomson小组不同的方法，从5～9周龄流产胎儿的性腺嵴(gonadal ridges)及肠系膜中分离原始的干细胞(primordial germ cells，PGCs)，这也是一种多能的胚胎干细胞，为区别ES细胞，命名为embryonic germ (EG) 细胞。这样有可能避免因直接利用胚胎而造成的伦理学上的麻烦。作者将EG细胞体外培养于小鼠成纤维细胞层上，培养体系中加入重组人白血病抑制因子，重组人碱性成纤维细胞生长因子及forskolin， 7～21 d后形成较大的多细胞集落，其形态与小鼠EG或ES细胞集落相似。作者经过一系列与Thomson实验室相似的免疫组化及功能实验，证明获得了可成系的两种核型的人胚胎干细胞集落。
人ES细胞系的建立将促进对人胚胎发育细节的基础研究。在此之前，有关人胚胎发育的研究都是基于动物模型，主要是小鼠模型之上，然而，人与动物胚胎之间却存在很大的差别，例如，人与小鼠在胎盘、胚胎外膜结构及胚胎层面上都有本质上的区别。如今，人们可以培育出大量人胚胎发育过程中不同时期的细胞，通过对它们基因表达的研究观察，有望认识畸胎儿发生的机制。另一个有望在短期内就能体现的优势在于医用药物的筛选中，目前用于药物筛选的细胞都来源于动物或癌细胞这样非正常的人体细胞，而ES细胞系可以经体外定向诱导，为人们提供大量各种组织类型的人体细胞。定向分化的尝试在小鼠中已取得可喜结果，神经元、造血细胞及心肌细胞已在体外经诱导获得[11～13]，而体外随意诱导人类体细胞的愿望可望不久成为现实。ES细胞系最大的优势可能在于能为器官移植提供无免疫异原性的材料[14]。许多人类的疾病，如帕金森氏病及某些类型的糖尿病都是个别类型细胞的死亡或功能异常引起的，只要向病人移植正常功能的同类细胞，即可获得治疗。人们可以以多种手段改造ES细胞系，经定向诱导分化，即可获得无免疫排斥的单纯特定细胞用以移植[15]，手段包括：1) 建立包含多种MHC基因型的胚胎干细胞库以供随意选用；2) 建立经遗传改构的通用型MHC基因型胚胎干细胞系，这种细胞已在小鼠中获得初步的成功；3) 借助基因打靶技术，度身定做一个与受者MHC同型的ES细胞系；4) 借助核移植技术，将受者细胞的全部基因组转移给ES细胞，建立特定受体相同基因组型的干细胞系。
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当然，目前欢呼新时代的到来尚为时过早，依然存在许多有待提高甚至验证的因素。作者所报道的实验方法和步骤从表面上看来并无特殊之处，许多其它实验室一直在以同样的方法试图获得人ES细胞系，人们希望进一步看到这一实验结果的可靠性和重复性；另外，从14个囊胚出发才建立起5个细胞系，是否还能提高建系效率；以前人们一直认为，小鼠细胞中LIF相关信号系统的存在是支持从小鼠囊胚建立小鼠ES细胞系的关键，那么，是什么系统对于建立人ES细胞系至关重要呢？甚至还有人怀疑，借助小鼠建系的经验和方法，是否真能建立起人的ES细胞系呢。进一步讲，即使解决了上述疑惑，人们依然还有很多工作要完成，首先人们还不能有效地诱导干细胞向特定的细胞类型分化，另外，更困难的是，还不能有效地建立起无免疫原性的ES细胞系。而撇开技术因素，人ES细胞系的建立和应用还涉及到伦理道德方面观念的制约。在90年代初，当人们第一次谈论起建立人ES细胞系前景时，美国政府已经制定出法律限制国家基金资助相应的工作，而在今年10月通过的美国国家拨款条例中又就此内容进行了更严格的限定。SCIENCE杂志在刊登相应文章的同时，还特意发表了编者按，解释发表此类文章背后的抉择，显得极其谨慎。种种限制制约了多数研究者继续从事这一领域的工作，而愿意提供开展这方面工作的私人和集团基金也因担心没有回报而忧心忡忡，必然会影响这一领域的顺利发展。但很显然，这一领域发展中的瓶颈问题已经得到初步的解决，人们有理由为此感到欢欣鼓舞。
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(本文承蒙吴克复教授、尤胜国教授审阅，谨致谢忱。)
[参 考 文 献]
[1] Thomson J A, Marshall V S. Primate embryonic stem cells[J]. Curr Top Dev Biol, 1998,38:133～165.
[2] Hong Y, Winkler C, Schartl M. Efficiency of cell culture derivation from blastula embryos and of chimera formation in the medaka(Oryzias latipes) depends on donor genotype and passage number[J]. Dev Genes Evol, 1998, 208(10): 595～602.
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[3]Evans MJ. Kaufman MH. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J]. Nature,1981, 292(5819):154～156.
[4] Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1981, 78(12):7634～7638.
[5] Dani C, Chambers I, Johnstone S, et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: A new ES cell regulatory pathway[J]. Dev Biol, 1998, 203(1):149～162.
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[6] Thomson J A, Itskovitz-Eldor J, Shapiro S S, et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J]. Science, 1998, 282(5391):1145～1147.
[7] Thomson JA, Kalishman J, Golos TG, et al. Isolation of a primate embryonic stem cell line[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995, 92(17):7844～7848.
[8] Harley C B. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb[J]? Mutat Res, 1991, 256(2-6):271～282.
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[9] Wright W E, Piatyszek M A, Rainey W E, et al. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells[J]. Dev Genet, 1996, 18(2):173～179.
[10] Shamblott MJ, Axelman J, Wang S, et al. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(23):13726～13731.
[11] Bain G, Kitchens D, Yao M, et al. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro[J]. Dev Biol, 1995, 168(2):342～357.
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[12] Wiles MV, Keller G. Multiple hematopoietic lineages develop from embryonic stem (ES) cells in culture[J]. Development, 1991, 111(2):259～267.
[13] Klug MG, Soonpaa MH, Koh GY, et al. Genetically selected cardiomyocytes from differentiating embronic stem cells form stable intracardiac grafts [J]. J Clin Invest, 1996, 98(1):216～224.
[14] Marshall E. A versatile cell line raises scientific hopes, legal questions [J]. Science, 1998, 282(5391):1021～1022.
[15] Gearhart J. New potential for human embryonic stem cells[J]. Science, 1998, 282(5391):1061～1062.
[收稿日期] 1998-12-04 [修回日期] 1999-04-13
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