影响卵胞浆内精子注射成功的因素
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国外医学妇产科学分册 1999年第26卷第1期
山东省计划生育科研所(250002)李娟综述 孟祥阁 叶鑫生审校
摘 要 胞浆内精子注射是治疗严重男性不育站最有效的方法之一，但影响其成功的因素较多，除了技术本身的因素外，还有精子、卵子状态以及卵子的激活等，对这些因素的深入了解，有助于提高其成功率。
关键词：ICSI 影响因素 卵子激活
卵胞浆内精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ISCI)是指用显微操作技术将单个精子注入卵胞浆内的过程。其成功超越了传统的体外受精(IVF)及其它显微授精技术，是近6年来治疗严重男性不育的重要手段。但影响其成功因素较多，本文通过对近几年来文献回顾，简要概述影响ISCI成功的因素，以便对其有更深入的了解，为临床服务。
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ISCI成功与否主要看其受精、卵裂以及妊娠率，ISCI技术本身对成功至关重要。精子、卵子状态、卵子的激活等也都直接影响其成功。
显微操作技术对ICSI成功的影响
ICSI技术的关键是：①精子注射入卵胞浆前必须完全制动。②精子真正注入卵胞浆并不被逐出。③显微操作对卵子的损伤。④技术熟练。
一、精子制动方法
一是选有活力的精子使其尾部制动，二是精子不加保护在液氮中反复冻融两次以制动；后一种方法因受精、卵裂率低，胚胎质量差，妊娠率极低，已被第一种方法取代。精子制动就是在ICSI前，选择形态正常，沿皿底缓慢运动的精子，用显微注射针压其尾部中点并迅速划过，精子立即停止活动；精子制动的目的是通过制动使精子细胞膜破裂[1]，精子被注入胞浆后，卵胞浆内某些因子通过破损的精子膜进入胞浆激活精子[2]，同时精子胞浆中的活化因子进入卵胞浆激活卵子[3]，另外精子制动还能避免精子在降低粘度的卵胞浆中恢复活性[4]，因精子尾的活动破坏细胞器。
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二、卵胞浆内精子注入
ICSI通过显微操作技术使精子越过透明带及卵膜两大屏障进入胞浆，只有刺破卵膜，精子才可能被送进胞浆；当注射针穿刺卵膜时，镜下可见卵膜产生一凹陷，当卵膜被穿透时可见凹陷的卵膜向注射针方向回缩，仔细观察还地发现，如果注射针内压力大于卵胞浆内压力时，注射针内精子会流向胞浆，反之精子及少量胞浆会反流入注射针。这时可回抽少量胞浆以进一步证实卵膜确已刺破，将回抽少量胞浆与精子一起缓慢注入胞浆，小心撤回注射针。检查精子是否确实留在胞浆内，以免由于操作失误或由于卵子的胞吐作用使精子留在卵周间隙。如精子被留在卵周间隙，那就相当于单精透明带下授精，受精率极低。
针尖侧面观放大图 针尖正面放大图
图1 显微注射针
针尖放大图
图2 显微固定针
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三、显微操作对卵子的损伤
1.显微操作工具 理想的显微注射针和显微固定针二者如图1、2所示，如显微注射针针尖过长易在操作时划卵膜，针尖太钝会由于操作时对卵子的过分挤压使其受损，注射针内径过粗易引起液体超负荷注入胞浆；用来固定卵子的显微固定针前端一定要平整，否则注射过程中卵子易滚动，使操作失误，还使卵受力不匀，易损伤卵子。
2.操作失误 在注射精子时随精子进入胞浆内液体量过多，引起卵细胞溶解。最近研究表明[5]，ICSI后胚胎发育期对胚胎移植后的结局有显著影响；移植2细胞胚胎的ICSI周期，妊娠率为9.3%；而移植胚胎中至少有一个大于2细胞期时，妊娠率为35.8%；有显著性差异。同样的情况在常规IVF中无显著性差异。说明ICSI对一些胚胎造成某种损伤，使细胞发育受到影响，阻碍着床。一般认为极体附近是卵子染色体所在位置，因此显微注射时注射针斜面要背向极体方面以免损伤染色体。
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四、技术熟练
卵子在培养箱外暴露时间越短越好，显微操作过程最好不超过5min。技术熟练是ICSI成功的前提，目前ICSI受精率及卵裂率的提高根本上是由于技术的提高。
精子状态对ICSI结果的影响
精是在睾丸及附睾中发和和变态而形成的，不同发育时期的生精细胞其成熟度不同，因此受精潜力也有所不同。在显微授精以前通常是用成熟精子授精。显微授精使附以睾及睾丸中的精子也具有了使成熟卵子受精的能力。
Aboulghar等[6]按精子的质量及来源分别统计ICSI后精子的受精能力，认为正常精液的精子ICSI后受精能力最高，非阻塞性无精症患者睾丸精子受精能力最低，而不同质量的异常精液及阻塞性无精症患者附睾及睾丸清子在受精及妊娠率上无显著性差异。造成这些差异的原因可能是ICSI所用精子尽管形态上正常，但其结构上可能存在不足之处，引起受精失败。
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Holden等[7]用冻融附睾精子做ICSI，受精率为47%，临床妊娠率为18.4%，因此，冻融附睾精子可使一次手术附睾取精多次ICSI治疗，以减轻病人痛苦。有关精子完整性对ICSI结果的影响，Palermo等[4]将精子尾部中点和机械方法去除，然后用去尾的精子做ICSI，初步得出受精率与完整精子ICSI后的近似，表明精核是受精卵发育为个体所必不可少的部分，而其尾部可能只是精子的运动器官。Rybouchkin等[8]用球形精子做ICSI通过卵子辅助激活使一位不育患者妊娠成功，说明球形精子也有使卵子受精的能力。
自然受精时，随着精卵膜融合，核膜破裂，精子被制动。在ICSI研究初期，研究者们多用不加保护刘在液氦中反复二次冻融精子，以使精子制动，这样制动后的精子用做ICSI，效果不佳，直到1992年Palermo等[9]用活精子注入卵胞浆内获首例人类用ICSI技术的试管婴儿诞一，此后许多IVF中心采用有活力的精子做ICSI均获成功。Poe-Zeigler等[10]研究精子成活力对ICSI后卵子受精、卵裂的影响，结果用活精子、死精子做ICSI，受精率分别为62.2%、16.2%，卵子裂率分别为91.3%、33.3%，均有显著性差异(P＝0.0001)；用活精子做胞浆注射组精及卵裂率高，胚胎质量好；用死精子做胞浆注射组受精率、卵裂率低，37个做ICSI的卵子仅有6个受精，其中只有两胚胎有一次卵裂，且胚胎内含碎片>50%，这种胚胎移植后不会妊娠；作者认为通过冻融得到的人死精子能使卵子受精但不能产生正常胚胎。因此，应选用有活力的形态正常的精子做ICSFI。Barros等[11]报道用一位精液中精子全部不动但显示有正常存活精子的患者的精子ICSI使其妊娠成功，并出生健康婴儿，说明只要精子存活，即使不活动也有使卵子受精的能力。
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Clarke等[12]用ICSI治疗严重抗精子抗体阳性不育患者，结果受精及妊娠率与阴性对照组无显著性差异，说明ICSI是治疗严重抗精子抗体阳性所致不育的一种有效办法。
卵子状态对ICSI结果的影响
文献报道ICSI所用卵子是处在第二次成熟分裂中期(M 11期)的成熟卵子，镜下可见第一极体，只有用出现第一极体的成熟卵子做ICSI才能获得满意的受精、卵裂及妊娠率。成熟女性一般每月只排一个卵子，在试管婴儿研究中，为获得高质量的足够的卵子用于体外受精-胚胎移植多采用促超排卵方案，Greenblatt等[13]的研究表明，促超排卵方案直接影响卵子的成熟度及其ICSI后受精、卵裂的结果，他们用GnRH-a长方案及短方案随机对病人进行促超排卵治疗。GnRH-a长方案是自促超排卵的前一周期的黄体中期开始用GnRH-a直到卵泡发育成熟、注射hCG日止。 GnRH-a短方案是自促超排卵周期第5在开始至注射hCG日止，结果GnRH-a长、短方案组回收到第一次成熟分裂中期卵(M I)分别为4%、60%，MII期卵分别为81%、26%，MII期以及MI期卵经过培养形成的MII期卵用于ICSI，GnRH-a长。短方案组ICSI后受精率分别28.3%、9%，卵裂率为23.7%、6.8%，均有显著性差异。作者认为GnRH-a长方案比短方案能获得更多的可直接用于ICSI的成熟卵，即MII期卵，MII期卵用来做ICSI受精率、卵裂率高，短方案组获MI期卵较多，MI期卵虽可经体外培养发育成MII期卵，但这样的卵ICSI后受精率、卵裂率较低，因此ICSI成功有赖于卵子成熟度，成熟好的卵子即MII期卵其受精、卵裂率均高。另外Navot等[14]通过对经ICSI治疗夫妇的临床结果分析认为，妇女年龄对ICSI结果有显著影响，大于36岁的妇女作ICSI后，其卵子存活率、胚胎移植率及妊娠高均明显低于36岁以下组的妇女，说明妇女年龄影响卵子质量、影响ICSFI结果。
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卵子激活对ICSI结果的影响
卵子激活是一个复杂的生理过程，是以形成雌雄原核、放出第二极体为标志并最终启动卵子代谢的一系列变化，ICSI越过精卵膜融合，直接将精子注入胞浆，其卵子激活过程有别于自然受精。一般认为ICSI时注射针穿刺卵膜及注射精前胞浆回吸对卵子的机械刺激及注入精子的生物刺激，两者共同作用引发Ca++释放从而激活卵子。回吸卵胞浆对卵子的激活作用目前遇到争议，Mansour等[15]认为回吸胞浆仅是证明卵膜被刺破的一种手段，并非卵子激活所必需，而且胞浆回吸使被注射卵子的损伤率提高，不做胞浆回吸同样可获得较高的爱精、卵裂率及高质量的胚胎；但较多的文献认为胞浆抽吸是激活卵子的必需步骤。Fishel等[3]提出精子尾部细胞膜损伤时，ICSI受精率明显提高，可能是精子通过损伤的细胞膜释放活化因子激活卵子。Edwords和Van Steirteghem[16]提出培养液中Ca++同精子一道注入胞浆可启动钙诱导钙释放，可能起到激活卵子的作用；Hoshi等[17]认为提高胞浆内Ca++浓度有助于激活卵子，Tesnrik等[18]认为ICSI后受精失败大多是由于卵子激活失败所引起，因此他们对ICSI后受精失败的卵进行Ca++辅助激活，使受精率从32%提高到91%。电击也可加速Ca++流入胞浆使卵子激活。已经证明Ca++与精卵激活及受精作用有关，但其作用机理尚有待于进一步研究。总之，Ca++释放不足可导致卵子激活失败。
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Lopes等[19]对150份精液精子染色体分析认为精子染色体断裂率与ICSI后受精率呈负相关，而精液中精子活动率越低，畸形率越高，精子染色体断裂发生率就越高。有资料表明，严重的少弱畸精症患者常伴有染色体基因方面异常，这些异常具有一定的遗传性，带有基因异常的精子单凭外观是不易鉴别的。因此ICSI可能会带来潜在性遗传风险。但另有数据显示通过ICSI治疗出生的婴儿染色体异常的出生率与正常出生的无显著性差异。由于ICSI应用于人类仅仅只有6年时间，许多问题如生育方面的问题尚需进一步随访。
参考文献
1 Dozortsev D et al.Hum Reprod,1994;(Oxf)9[Suppl,4],40
2 Flaherty SP et al.Reprod Fertil,1995;7:197-210
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3 Fishel S et al.Hum Reprod,1995;10:497-500
4 Palermo GD et al.Fertil Sterl,1995;63(6):1231-1240
5 Zhu J et al.Assjst Reprod Genet,1997;14(5):245-249
6 Aboulghar MA et al.Fertil Steril,1997;68(1):108-111
7 Holden CA et al.Fertil Steril,1997;67(1):81-87
8 Rybouchkin AV et al.Fertil Steril,1997;68(6):1144-1147
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9 Palermo G et al.Lancet,1992;67(6):1091-1094
10 Poc-Zeigler R et al.J Assist Reprod Genet,1997;14(5):277-281
11 Barros A et al.Fertil Steril,1997;67(6):1091-1094
12 Clarke GN et al.Fertil Steril,1997;68(1):112—117
13 Greenblatt EM et al.Fertil Steril,1995;64(3)557-563
14 Navot D et al.Lancet,1991;337:1375-1377
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15 Mansour RT et al.Fertil Steril,1996;66(2):256-259
16 Edwards RG et al.Hum Reprod,1993;8:998-989
17 Hoshi K et al.Hum Reprod,1992;7:871-875
18 Tesarik J,Sousa M,Fertil Steril,1995;63(2):343-349
19 Lopes S et al.Fertil Steril.1998;69(3):528-532
(收稿日期：1998-02-27 修回日期：1998-06-22)
录入：邰燕
校对：姬颖, 百拇医药
摘 要 胞浆内精子注射是治疗严重男性不育站最有效的方法之一，但影响其成功的因素较多，除了技术本身的因素外，还有精子、卵子状态以及卵子的激活等，对这些因素的深入了解，有助于提高其成功率。
关键词：ICSI 影响因素 卵子激活
卵胞浆内精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ISCI)是指用显微操作技术将单个精子注入卵胞浆内的过程。其成功超越了传统的体外受精(IVF)及其它显微授精技术，是近6年来治疗严重男性不育的重要手段。但影响其成功因素较多，本文通过对近几年来文献回顾，简要概述影响ISCI成功的因素，以便对其有更深入的了解，为临床服务。
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ISCI成功与否主要看其受精、卵裂以及妊娠率，ISCI技术本身对成功至关重要。精子、卵子状态、卵子的激活等也都直接影响其成功。
显微操作技术对ICSI成功的影响
ICSI技术的关键是：①精子注射入卵胞浆前必须完全制动。②精子真正注入卵胞浆并不被逐出。③显微操作对卵子的损伤。④技术熟练。
一、精子制动方法
一是选有活力的精子使其尾部制动，二是精子不加保护在液氮中反复冻融两次以制动；后一种方法因受精、卵裂率低，胚胎质量差，妊娠率极低，已被第一种方法取代。精子制动就是在ICSI前，选择形态正常，沿皿底缓慢运动的精子，用显微注射针压其尾部中点并迅速划过，精子立即停止活动；精子制动的目的是通过制动使精子细胞膜破裂[1]，精子被注入胞浆后，卵胞浆内某些因子通过破损的精子膜进入胞浆激活精子[2]，同时精子胞浆中的活化因子进入卵胞浆激活卵子[3]，另外精子制动还能避免精子在降低粘度的卵胞浆中恢复活性[4]，因精子尾的活动破坏细胞器。
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二、卵胞浆内精子注入
ICSI通过显微操作技术使精子越过透明带及卵膜两大屏障进入胞浆，只有刺破卵膜，精子才可能被送进胞浆；当注射针穿刺卵膜时，镜下可见卵膜产生一凹陷，当卵膜被穿透时可见凹陷的卵膜向注射针方向回缩，仔细观察还地发现，如果注射针内压力大于卵胞浆内压力时，注射针内精子会流向胞浆，反之精子及少量胞浆会反流入注射针。这时可回抽少量胞浆以进一步证实卵膜确已刺破，将回抽少量胞浆与精子一起缓慢注入胞浆，小心撤回注射针。检查精子是否确实留在胞浆内，以免由于操作失误或由于卵子的胞吐作用使精子留在卵周间隙。如精子被留在卵周间隙，那就相当于单精透明带下授精，受精率极低。
针尖侧面观放大图 针尖正面放大图
图1 显微注射针
针尖放大图
图2 显微固定针
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三、显微操作对卵子的损伤
1.显微操作工具 理想的显微注射针和显微固定针二者如图1、2所示，如显微注射针针尖过长易在操作时划卵膜，针尖太钝会由于操作时对卵子的过分挤压使其受损，注射针内径过粗易引起液体超负荷注入胞浆；用来固定卵子的显微固定针前端一定要平整，否则注射过程中卵子易滚动，使操作失误，还使卵受力不匀，易损伤卵子。
2.操作失误 在注射精子时随精子进入胞浆内液体量过多，引起卵细胞溶解。最近研究表明[5]，ICSI后胚胎发育期对胚胎移植后的结局有显著影响；移植2细胞胚胎的ICSI周期，妊娠率为9.3%；而移植胚胎中至少有一个大于2细胞期时，妊娠率为35.8%；有显著性差异。同样的情况在常规IVF中无显著性差异。说明ICSI对一些胚胎造成某种损伤，使细胞发育受到影响，阻碍着床。一般认为极体附近是卵子染色体所在位置，因此显微注射时注射针斜面要背向极体方面以免损伤染色体。
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四、技术熟练
卵子在培养箱外暴露时间越短越好，显微操作过程最好不超过5min。技术熟练是ICSI成功的前提，目前ICSI受精率及卵裂率的提高根本上是由于技术的提高。
精子状态对ICSI结果的影响
精是在睾丸及附睾中发和和变态而形成的，不同发育时期的生精细胞其成熟度不同，因此受精潜力也有所不同。在显微授精以前通常是用成熟精子授精。显微授精使附以睾及睾丸中的精子也具有了使成熟卵子受精的能力。
Aboulghar等[6]按精子的质量及来源分别统计ICSI后精子的受精能力，认为正常精液的精子ICSI后受精能力最高，非阻塞性无精症患者睾丸精子受精能力最低，而不同质量的异常精液及阻塞性无精症患者附睾及睾丸清子在受精及妊娠率上无显著性差异。造成这些差异的原因可能是ICSI所用精子尽管形态上正常，但其结构上可能存在不足之处，引起受精失败。
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Holden等[7]用冻融附睾精子做ICSI，受精率为47%，临床妊娠率为18.4%，因此，冻融附睾精子可使一次手术附睾取精多次ICSI治疗，以减轻病人痛苦。有关精子完整性对ICSI结果的影响，Palermo等[4]将精子尾部中点和机械方法去除，然后用去尾的精子做ICSI，初步得出受精率与完整精子ICSI后的近似，表明精核是受精卵发育为个体所必不可少的部分，而其尾部可能只是精子的运动器官。Rybouchkin等[8]用球形精子做ICSI通过卵子辅助激活使一位不育患者妊娠成功，说明球形精子也有使卵子受精的能力。
自然受精时，随着精卵膜融合，核膜破裂，精子被制动。在ICSI研究初期，研究者们多用不加保护刘在液氦中反复二次冻融精子，以使精子制动，这样制动后的精子用做ICSI，效果不佳，直到1992年Palermo等[9]用活精子注入卵胞浆内获首例人类用ICSI技术的试管婴儿诞一，此后许多IVF中心采用有活力的精子做ICSI均获成功。Poe-Zeigler等[10]研究精子成活力对ICSI后卵子受精、卵裂的影响，结果用活精子、死精子做ICSI，受精率分别为62.2%、16.2%，卵子裂率分别为91.3%、33.3%，均有显著性差异(P＝0.0001)；用活精子做胞浆注射组精及卵裂率高，胚胎质量好；用死精子做胞浆注射组受精率、卵裂率低，37个做ICSI的卵子仅有6个受精，其中只有两胚胎有一次卵裂，且胚胎内含碎片>50%，这种胚胎移植后不会妊娠；作者认为通过冻融得到的人死精子能使卵子受精但不能产生正常胚胎。因此，应选用有活力的形态正常的精子做ICSFI。Barros等[11]报道用一位精液中精子全部不动但显示有正常存活精子的患者的精子ICSI使其妊娠成功，并出生健康婴儿，说明只要精子存活，即使不活动也有使卵子受精的能力。
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Clarke等[12]用ICSI治疗严重抗精子抗体阳性不育患者，结果受精及妊娠率与阴性对照组无显著性差异，说明ICSI是治疗严重抗精子抗体阳性所致不育的一种有效办法。
卵子状态对ICSI结果的影响
文献报道ICSI所用卵子是处在第二次成熟分裂中期(M 11期)的成熟卵子，镜下可见第一极体，只有用出现第一极体的成熟卵子做ICSI才能获得满意的受精、卵裂及妊娠率。成熟女性一般每月只排一个卵子，在试管婴儿研究中，为获得高质量的足够的卵子用于体外受精-胚胎移植多采用促超排卵方案，Greenblatt等[13]的研究表明，促超排卵方案直接影响卵子的成熟度及其ICSI后受精、卵裂的结果，他们用GnRH-a长方案及短方案随机对病人进行促超排卵治疗。GnRH-a长方案是自促超排卵的前一周期的黄体中期开始用GnRH-a直到卵泡发育成熟、注射hCG日止。 GnRH-a短方案是自促超排卵周期第5在开始至注射hCG日止，结果GnRH-a长、短方案组回收到第一次成熟分裂中期卵(M I)分别为4%、60%，MII期卵分别为81%、26%，MII期以及MI期卵经过培养形成的MII期卵用于ICSI，GnRH-a长。短方案组ICSI后受精率分别28.3%、9%，卵裂率为23.7%、6.8%，均有显著性差异。作者认为GnRH-a长方案比短方案能获得更多的可直接用于ICSI的成熟卵，即MII期卵，MII期卵用来做ICSI受精率、卵裂率高，短方案组获MI期卵较多，MI期卵虽可经体外培养发育成MII期卵，但这样的卵ICSI后受精率、卵裂率较低，因此ICSI成功有赖于卵子成熟度，成熟好的卵子即MII期卵其受精、卵裂率均高。另外Navot等[14]通过对经ICSI治疗夫妇的临床结果分析认为，妇女年龄对ICSI结果有显著影响，大于36岁的妇女作ICSI后，其卵子存活率、胚胎移植率及妊娠高均明显低于36岁以下组的妇女，说明妇女年龄影响卵子质量、影响ICSFI结果。
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卵子激活对ICSI结果的影响
卵子激活是一个复杂的生理过程，是以形成雌雄原核、放出第二极体为标志并最终启动卵子代谢的一系列变化，ICSI越过精卵膜融合，直接将精子注入胞浆，其卵子激活过程有别于自然受精。一般认为ICSI时注射针穿刺卵膜及注射精前胞浆回吸对卵子的机械刺激及注入精子的生物刺激，两者共同作用引发Ca++释放从而激活卵子。回吸卵胞浆对卵子的激活作用目前遇到争议，Mansour等[15]认为回吸胞浆仅是证明卵膜被刺破的一种手段，并非卵子激活所必需，而且胞浆回吸使被注射卵子的损伤率提高，不做胞浆回吸同样可获得较高的爱精、卵裂率及高质量的胚胎；但较多的文献认为胞浆抽吸是激活卵子的必需步骤。Fishel等[3]提出精子尾部细胞膜损伤时，ICSI受精率明显提高，可能是精子通过损伤的细胞膜释放活化因子激活卵子。Edwords和Van Steirteghem[16]提出培养液中Ca++同精子一道注入胞浆可启动钙诱导钙释放，可能起到激活卵子的作用；Hoshi等[17]认为提高胞浆内Ca++浓度有助于激活卵子，Tesnrik等[18]认为ICSI后受精失败大多是由于卵子激活失败所引起，因此他们对ICSI后受精失败的卵进行Ca++辅助激活，使受精率从32%提高到91%。电击也可加速Ca++流入胞浆使卵子激活。已经证明Ca++与精卵激活及受精作用有关，但其作用机理尚有待于进一步研究。总之，Ca++释放不足可导致卵子激活失败。
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Lopes等[19]对150份精液精子染色体分析认为精子染色体断裂率与ICSI后受精率呈负相关，而精液中精子活动率越低，畸形率越高，精子染色体断裂发生率就越高。有资料表明，严重的少弱畸精症患者常伴有染色体基因方面异常，这些异常具有一定的遗传性，带有基因异常的精子单凭外观是不易鉴别的。因此ICSI可能会带来潜在性遗传风险。但另有数据显示通过ICSI治疗出生的婴儿染色体异常的出生率与正常出生的无显著性差异。由于ICSI应用于人类仅仅只有6年时间，许多问题如生育方面的问题尚需进一步随访。
参考文献
1 Dozortsev D et al.Hum Reprod,1994;(Oxf)9[Suppl,4],40
2 Flaherty SP et al.Reprod Fertil,1995;7:197-210
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3 Fishel S et al.Hum Reprod,1995;10:497-500
4 Palermo GD et al.Fertil Sterl,1995;63(6):1231-1240
5 Zhu J et al.Assjst Reprod Genet,1997;14(5):245-249
6 Aboulghar MA et al.Fertil Steril,1997;68(1):108-111
7 Holden CA et al.Fertil Steril,1997;67(1):81-87
8 Rybouchkin AV et al.Fertil Steril,1997;68(6):1144-1147
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9 Palermo G et al.Lancet,1992;67(6):1091-1094
10 Poc-Zeigler R et al.J Assist Reprod Genet,1997;14(5):277-281
11 Barros A et al.Fertil Steril,1997;67(6):1091-1094
12 Clarke GN et al.Fertil Steril,1997;68(1):112—117
13 Greenblatt EM et al.Fertil Steril,1995;64(3)557-563
14 Navot D et al.Lancet,1991;337:1375-1377
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15 Mansour RT et al.Fertil Steril,1996;66(2):256-259
16 Edwards RG et al.Hum Reprod,1993;8:998-989
17 Hoshi K et al.Hum Reprod,1992;7:871-875
18 Tesarik J,Sousa M,Fertil Steril,1995;63(2):343-349
19 Lopes S et al.Fertil Steril.1998;69(3):528-532
(收稿日期：1998-02-27 修回日期：1998-06-22)
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校对：姬颖, 百拇医药