日本脑炎病毒E蛋白基因酵母双杂交表达载体的构建
作者：樊英如 马文煜 黄庆生 薛小平 付莉
单位：樊英如(第四军医大学微生物教研室，陕西西安710032)；马文煜(第四军医大学微生物教研室，陕西西安710032)；黄庆生(第四军医大学微生物教研室，陕西西安710032)；薛小平(第四军医大学微生物教研室，陕西西安710032)；付莉(第四军医大学微生物教研室，陕西西安710032)
关键词：日本脑炎病毒；酵母双杂交；载体构建
细胞与分子免疫学杂志000304
中图号：Q782 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0196-02▲
日本脑炎病毒(JEV)为黄病毒属成员，基因组为单股正链RNA，长约11kb，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白〔1〕。其中3个结构蛋白分别为衣壳蛋白C、膜蛋白M和囊膜蛋白E。E蛋白为该病毒外部的糖蛋白，由500个氨基酸组成，相对分子质量(Mr)约为53000，具有多种生物学功能，包括受体结合活性和膜融合作用等，与病毒的致病性及组织亲嗜性密切相关〔2〕。
, 百拇医药
酵母双杂交技术，是一种新近发展的研究蛋白质之间相互作用的方法。为研究JEV的受体，我们将编码JEV中具有受体结合活性的E蛋白的基因(约1.5kb)克隆入酵母表达载体中，为下一步从VERO细胞cDNA文库中筛选JEV受体打下了基础。
1 材料和方法
1.1材料酵母双杂交(Rasrecruitmentsystem)系统由Aronheim惠赠。限制性内切酶和T4DNA连接酶购自大连宝生物公司。Expand逆转录酶购自宝灵曼公司(B.M)。pBluescriptKS(-)和大肠杆菌DH5α由本室保存。RNA提取液〔3〕自行配制。WizardPlus质粒纯化试剂盒购自Promega公司；NucleoTrap胶回收试剂盒购自Clontech公司。引物由上海生工公司合成。
1.2方法
1.2.1PCR引物的设计根据JEVSA14株序列〔4〕，通过计算机辅助分析，结合表达载体ADNSJUNRAS(61)△F的读框设计引物，其序列如下:P1:5′GCTAAGCTTATGTTTAATTGTCTGGGAATGGGC3′；
, 百拇医药
P2:5′GTCCCCGGGAGCATGCACATTGGTCGCTAA3′.
1.2.2RNA的提取及cDNA第1链的制备将JEV干燥毒种用无血清RPMI1640溶解，在昆明种乳鼠脑内连传3代，用RNA提取液(含8mol/L异硫氰酸胍、50mmol/L枸橼酸钠、100mmol/L2ME及10g/LSarkocyl)提取RNA。然后，取4μL新鲜提取的JEVRNA，加1μL25mmol/L的逆转录引物(引物2)。70℃10min后，立即冰浴5min，采用BM公司的逆转录酶，加入缓冲液、RNA酶抑制剂和dNTP等，总反应体积为20μL，于42℃逆转录120min。
1.2.3JEVE蛋白基因的扩增以上述cDNA第1链为模板，用引物1和2扩增，反应条件为：94℃50s，55℃50s，72℃90s，共进行30个循环。
1.2.4PCR产物的克隆将PCR产物用SmaI/HindIII双酶切，然后用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。克隆载体pBluescriptKS()先用ClaI切，切后用Klenow补平，再用HindIII酶切。酶切完成后，按片段∶载体为3∶1的比例，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜。取连接产物5μL，转化感受态菌DH5α，37℃培养16h。挑取菌落，以小量碱裂解法提取质粒，进行EcoRI/SalI双酶切及PCR鉴定。鉴定正确后，送大连宝生物公司测序。重组质粒命名为pBluescriptKS(-)/E。
, http://www.100md.com
1.2.5JEVE蛋白基因的亚克隆将含有插入片段的载体pBluescriptKS(-)先用ClaⅠ单酶切，然后加入Klenow将其补平，再用HindⅢ酶切,NucleoTrap胶回收试剂盒回收切下的E蛋白基因片段。将其与用SmaⅠ/HindⅢ双酶切后的ADNSJUNRAS(61)△F载体相连，转化感受态DH5α，筛选阳性克隆。小量碱裂解法提质粒后，用HindⅢ/SmaI双酶切，可切出相应大小的片段。重组质粒命名为ADNSJUNRAS(61)△F/E。
2 结果
2.1JEVE蛋白基因的扩增扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳后，显示有长约1.5kb的片段(图1A)。
图1JEVE蛋白基因酵母双杂交表达载体的构建
A：JEVE蛋白基因的扩增;B：重组质粒pBluescriptKS(-)/E的酶切鉴定;C：重组质粒ADNSJUNRAS(61)△F/E的酶切鉴定.
, 百拇医药
A1:为PCR产物；B1为阳性克隆；C2,3,5：为阳性克隆;C1,4：为阴性克隆;M为λDNA/HindⅢmarker(从上到下依次为：
23.1,9.4,6.5,2.3,2.0kb).
2.2PCR产物的克隆重组质粒pBluescriptKS(-)/E用EcoRI/SalI双酶切，可切下相应大小的片段。其中大片段约2.9kb，为载体pBluescriptKS(-)；小片段约1.5kb，为JEVE蛋白基因(图1B)。
2.3JEVE蛋白基因的亚克隆重组质粒ADNSJUNRAS(61)△F/E用SmaⅠ/HindⅢ双酶切，可切下相应大小的片段。其中大片段约9kb，为载体ADNSJUNRAS(61)△F；小片段约1.5kb，为JEVE蛋白基因(图1C)。
3 讨论
, 百拇医药
病毒受体是指能特异性地与病毒结合、介导病毒内化，并促进病毒感染的细胞膜组分，它决定着病毒的宿主范围和对组织及细胞的亲嗜性。研究病毒受体对了解病毒的感染机制，以及病毒性疾病的预防及治疗都具有十分重要的意义。因此，病毒受体的研究多年来一直倍受关注。但包括JEV在内的黄病毒属成员的受体均未明确。Kimura等〔5〕曾报道，在JEV敏感细胞VERO表面发现一种Mr为74000的分子，可能为JEV受体或为受体的组成成分。
自从80年代末，Fields和Song〔6〕,首次描述双向杂交系统(thetwohybridsystem)以来，这一研究蛋白间相互作用的实验方法已得到广泛应用。其可行性和有效性，在验证已知蛋白间的相互作用或在筛选与靶蛋白相互作用的候选蛋白的研究中已被证实。但是目前商品化的酵母双杂交系统都是建立在对RNA聚合酶Ⅱ激活的基础上的，这就意味着双杂交过程必需在细胞核内完成，从而限制了大量需定位到膜上才能表现其正常生物学功能的蛋白质，以及本身具有激活转录功能的蛋白质在这一系统中的应用。针对这一问题，Aronheim等〔7〕设计了由SOS蛋白介导的双杂交系统，也称之为SOS救活系统(SOSrecruitmentsystem,SRS)。后来在此基础上加以改进，发展了更为有效的RRS系统(Rasrecruitmentsystem)〔8〕，克服了SRS系统的某些局限，成为研究病毒受体的理想系统。我们利用RRS系统，已成功地构建了含有JEVE蛋白基因的ADNSJUNRAS载体，但是否能转化入酵母细胞并正确表达，尚需进一步验证。■
, http://www.100md.com
作者简介：樊英如，女，29，硕生士西安市长乐西路17号 ， Tel.(029)3374526
参考文献:
〔1〕 Chambers JJ， Hahn CS， Galler R， et al. Flavivirus genome organization, expression, and replication〔J〕 . Ann Rev Microbiol， 1990; 44: 649- 688.
〔2〕 Rey FA, Heinz FX, Mandl C, et al. The envelope glycoprotein from tick borne encephalitis virus at 2A resolution〔J〕 . Nature， 1995； 375(25):291- 298.
〔3〕 Chomozynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate phenol chloroform extraction〔J〕 . Anal Biochem,1987;162:156- 159.
, http://www.100md.com
〔4〕 Nitayaphan S,Grant JA, Chang GJ, et al. Nucleotide sequence of the derivative SA 14 strain of Japanese encephalitis virus and its attenuated vaccine derivative ,SA 14 14 2〔J〕 .Virology,1990;177:541- 552.
〔5〕 Kumara,T, Kumara Kurada J, Nagashima K, et al. Analysis of virus cell binding characteristic on the determination of Japanese encephalitis virus susceptibility〔J〕 . Arch Virol, 1994； 139:239- 251.
〔6〕 Fields S, Song OA. Novel genetic system to detect protein protein interactions〔J〕 . Nature,1989； 340: 245- 2467.
, http://www.100md.com
〔7〕 Aronheim A, Zandi E, Hennemann H, et al. Isolation of an AP 1 repressor by a novel method for detecting protein protein interactions〔J〕 . Mol Cell Biol, 1997;17:3094- 3102.
〔8〕 Yehoshua C, Broader, Signal Katz, et al. The Ras recruitment system, a novel approach to the study of protein protein interactions〔J〕 . Current Biol,1998; 8: 1121- 1124.
收稿日期：1999-12-06
修回日期：1999-12-20, http://www.100md.com
单位：樊英如(第四军医大学微生物教研室，陕西西安710032)；马文煜(第四军医大学微生物教研室，陕西西安710032)；黄庆生(第四军医大学微生物教研室，陕西西安710032)；薛小平(第四军医大学微生物教研室，陕西西安710032)；付莉(第四军医大学微生物教研室，陕西西安710032)
关键词：日本脑炎病毒；酵母双杂交；载体构建
细胞与分子免疫学杂志000304
中图号：Q782 文献标识码：A 文章编号：1007-8738(2000)03-0196-02▲
日本脑炎病毒(JEV)为黄病毒属成员，基因组为单股正链RNA，长约11kb，编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白〔1〕。其中3个结构蛋白分别为衣壳蛋白C、膜蛋白M和囊膜蛋白E。E蛋白为该病毒外部的糖蛋白，由500个氨基酸组成，相对分子质量(Mr)约为53000，具有多种生物学功能，包括受体结合活性和膜融合作用等，与病毒的致病性及组织亲嗜性密切相关〔2〕。
, 百拇医药
酵母双杂交技术，是一种新近发展的研究蛋白质之间相互作用的方法。为研究JEV的受体，我们将编码JEV中具有受体结合活性的E蛋白的基因(约1.5kb)克隆入酵母表达载体中，为下一步从VERO细胞cDNA文库中筛选JEV受体打下了基础。
1 材料和方法
1.1材料酵母双杂交(Rasrecruitmentsystem)系统由Aronheim惠赠。限制性内切酶和T4DNA连接酶购自大连宝生物公司。Expand逆转录酶购自宝灵曼公司(B.M)。pBluescriptKS(-)和大肠杆菌DH5α由本室保存。RNA提取液〔3〕自行配制。WizardPlus质粒纯化试剂盒购自Promega公司；NucleoTrap胶回收试剂盒购自Clontech公司。引物由上海生工公司合成。
1.2方法
1.2.1PCR引物的设计根据JEVSA14株序列〔4〕，通过计算机辅助分析，结合表达载体ADNSJUNRAS(61)△F的读框设计引物，其序列如下:P1:5′GCTAAGCTTATGTTTAATTGTCTGGGAATGGGC3′；
, 百拇医药
P2:5′GTCCCCGGGAGCATGCACATTGGTCGCTAA3′.
1.2.2RNA的提取及cDNA第1链的制备将JEV干燥毒种用无血清RPMI1640溶解，在昆明种乳鼠脑内连传3代，用RNA提取液(含8mol/L异硫氰酸胍、50mmol/L枸橼酸钠、100mmol/L2ME及10g/LSarkocyl)提取RNA。然后，取4μL新鲜提取的JEVRNA，加1μL25mmol/L的逆转录引物(引物2)。70℃10min后，立即冰浴5min，采用BM公司的逆转录酶，加入缓冲液、RNA酶抑制剂和dNTP等，总反应体积为20μL，于42℃逆转录120min。
1.2.3JEVE蛋白基因的扩增以上述cDNA第1链为模板，用引物1和2扩增，反应条件为：94℃50s，55℃50s，72℃90s，共进行30个循环。
1.2.4PCR产物的克隆将PCR产物用SmaI/HindIII双酶切，然后用低熔点琼脂糖凝胶电泳回收。克隆载体pBluescriptKS()先用ClaI切，切后用Klenow补平，再用HindIII酶切。酶切完成后，按片段∶载体为3∶1的比例，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜。取连接产物5μL，转化感受态菌DH5α，37℃培养16h。挑取菌落，以小量碱裂解法提取质粒，进行EcoRI/SalI双酶切及PCR鉴定。鉴定正确后，送大连宝生物公司测序。重组质粒命名为pBluescriptKS(-)/E。
, http://www.100md.com
1.2.5JEVE蛋白基因的亚克隆将含有插入片段的载体pBluescriptKS(-)先用ClaⅠ单酶切，然后加入Klenow将其补平，再用HindⅢ酶切,NucleoTrap胶回收试剂盒回收切下的E蛋白基因片段。将其与用SmaⅠ/HindⅢ双酶切后的ADNSJUNRAS(61)△F载体相连，转化感受态DH5α，筛选阳性克隆。小量碱裂解法提质粒后，用HindⅢ/SmaI双酶切，可切出相应大小的片段。重组质粒命名为ADNSJUNRAS(61)△F/E。
2 结果
2.1JEVE蛋白基因的扩增扩增产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳后，显示有长约1.5kb的片段(图1A)。
图1JEVE蛋白基因酵母双杂交表达载体的构建
A：JEVE蛋白基因的扩增;B：重组质粒pBluescriptKS(-)/E的酶切鉴定;C：重组质粒ADNSJUNRAS(61)△F/E的酶切鉴定.
, 百拇医药
A1:为PCR产物；B1为阳性克隆；C2,3,5：为阳性克隆;C1,4：为阴性克隆;M为λDNA/HindⅢmarker(从上到下依次为：
23.1,9.4,6.5,2.3,2.0kb).
2.2PCR产物的克隆重组质粒pBluescriptKS(-)/E用EcoRI/SalI双酶切，可切下相应大小的片段。其中大片段约2.9kb，为载体pBluescriptKS(-)；小片段约1.5kb，为JEVE蛋白基因(图1B)。
2.3JEVE蛋白基因的亚克隆重组质粒ADNSJUNRAS(61)△F/E用SmaⅠ/HindⅢ双酶切，可切下相应大小的片段。其中大片段约9kb，为载体ADNSJUNRAS(61)△F；小片段约1.5kb，为JEVE蛋白基因(图1C)。
3 讨论
, 百拇医药
病毒受体是指能特异性地与病毒结合、介导病毒内化，并促进病毒感染的细胞膜组分，它决定着病毒的宿主范围和对组织及细胞的亲嗜性。研究病毒受体对了解病毒的感染机制，以及病毒性疾病的预防及治疗都具有十分重要的意义。因此，病毒受体的研究多年来一直倍受关注。但包括JEV在内的黄病毒属成员的受体均未明确。Kimura等〔5〕曾报道，在JEV敏感细胞VERO表面发现一种Mr为74000的分子，可能为JEV受体或为受体的组成成分。
自从80年代末，Fields和Song〔6〕,首次描述双向杂交系统(thetwohybridsystem)以来，这一研究蛋白间相互作用的实验方法已得到广泛应用。其可行性和有效性，在验证已知蛋白间的相互作用或在筛选与靶蛋白相互作用的候选蛋白的研究中已被证实。但是目前商品化的酵母双杂交系统都是建立在对RNA聚合酶Ⅱ激活的基础上的，这就意味着双杂交过程必需在细胞核内完成，从而限制了大量需定位到膜上才能表现其正常生物学功能的蛋白质，以及本身具有激活转录功能的蛋白质在这一系统中的应用。针对这一问题，Aronheim等〔7〕设计了由SOS蛋白介导的双杂交系统，也称之为SOS救活系统(SOSrecruitmentsystem,SRS)。后来在此基础上加以改进，发展了更为有效的RRS系统(Rasrecruitmentsystem)〔8〕，克服了SRS系统的某些局限，成为研究病毒受体的理想系统。我们利用RRS系统，已成功地构建了含有JEVE蛋白基因的ADNSJUNRAS载体，但是否能转化入酵母细胞并正确表达，尚需进一步验证。■
, http://www.100md.com
作者简介：樊英如，女，29，硕生士西安市长乐西路17号 ， Tel.(029)3374526
参考文献:
〔1〕 Chambers JJ， Hahn CS， Galler R， et al. Flavivirus genome organization, expression, and replication〔J〕 . Ann Rev Microbiol， 1990; 44: 649- 688.
〔2〕 Rey FA, Heinz FX, Mandl C, et al. The envelope glycoprotein from tick borne encephalitis virus at 2A resolution〔J〕 . Nature， 1995； 375(25):291- 298.
〔3〕 Chomozynski P, Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidine thiocyanate phenol chloroform extraction〔J〕 . Anal Biochem,1987;162:156- 159.
, http://www.100md.com
〔4〕 Nitayaphan S,Grant JA, Chang GJ, et al. Nucleotide sequence of the derivative SA 14 strain of Japanese encephalitis virus and its attenuated vaccine derivative ,SA 14 14 2〔J〕 .Virology,1990;177:541- 552.
〔5〕 Kumara,T, Kumara Kurada J, Nagashima K, et al. Analysis of virus cell binding characteristic on the determination of Japanese encephalitis virus susceptibility〔J〕 . Arch Virol, 1994； 139:239- 251.
〔6〕 Fields S, Song OA. Novel genetic system to detect protein protein interactions〔J〕 . Nature,1989； 340: 245- 2467.
, http://www.100md.com
〔7〕 Aronheim A, Zandi E, Hennemann H, et al. Isolation of an AP 1 repressor by a novel method for detecting protein protein interactions〔J〕 . Mol Cell Biol, 1997;17:3094- 3102.
〔8〕 Yehoshua C, Broader, Signal Katz, et al. The Ras recruitment system, a novel approach to the study of protein protein interactions〔J〕 . Current Biol,1998; 8: 1121- 1124.
收稿日期：1999-12-06
修回日期：1999-12-20, http://www.100md.com