重组梅毒螺旋体抗原的研究进展
http://www.100md.com
国外医学皮肤性病学分册 1999年第25卷第6期
中国医学科学院皮肤病研究所 尹跃平综述
中国协和医科大学皮肤病研究所 徐文严审校
摘要 在梅毒螺旋体人工培养尚未获得成功的情况下，基因克隆(即DNA重组)技术的出现为该病原的研究开辟了一条新的途径。应用基因工程技术目前已制备出多种重组梅毒螺旋体抗原，这些抗原的制备对梅毒发病机理的探讨、疫苗的研制、以及血清学诊断试验的建立与应用具有重要意义，为梅毒的预防和控制提供了更加有效的手段。
关键词：梅毒螺旋体 重组抗原
一、概况
梅毒是一种临床表现极为复杂，几乎可累及全身各器官的性病。尽管本世纪40代年发现了治疗梅毒的理想药物——青霉素，但目前该病在全球仍然是一项重要的公共卫生问题[1]。目前尚未解决梅毒的病原体——梅毒螺旋体(Treponema pallidum,TP)的人工培养问题，从而阻碍了对TP致病机理探讨、疫苗研制、以及梅毒血清学诊断技术开发等方面的深入研究。80年代初，随着分子生物学技术的发展，特别是基因工程(DNA重组)技术的出现使梅毒螺旋体的研究进入一个新的阶段[2]，目前，TP的全部基因组DNA序列已经被解析[1]。通过重组TP DNA的克隆以及在大肠杆菌中的表达，制备出多种重组TP抗原，为梅毒的研究提供了一条新的途径。现就近10年来有关重组TP抗原的研究现况进行复习。
, http://www.100md.com
二、重组TP抗原的特性及制备
目前已重组的TP抗原有近20多种，如TpN15、TpN17、TpN19、TpN29～35(TpD)、TpN44.5(TmP A)、TpN47、TpN35(Tmp C)等[3]。现将其中部分有应用前景的重组TP抗原分述如下。
(一)TP15kD抗原[4]：15kD蛋白是一种脂蛋白，首先由Hensel等1985年分离鉴定，它在TP膜蛋白中的含量相对较少，但在免疫印迹试验中与人梅毒血清间显示了超强的反应性，同时对实验梅毒兔的淋巴细胞有很强的增生反应，表明15kD蛋白不仅具有较强的体液免疫原性，而且有较强的细胞免疫原性，但Centurion-Lara等[5]实验表明，此蛋白对TP感染没有任何免疫保护性。重组15kD抗原基因由Norgard 等用特异的单克隆抗体从TP基因库中筛选得到[4]。其最新报道的表达质粒为pMALc2[5]，该质粒在DNA插入位点的上游含有麦芽糖结合蛋白基因，使表达的融合蛋白易于分离和提纯。
, http://www.100md.com
(二)4D抗原：4D抗原是分子量分19kD的一种TP外膜蛋白，Radolf等[6]研究发现无论是自然状态还是重组4D蛋白都由二巯键交叉相联成寡聚结构，且耐蛋白酶，表明4D抗原可能在TP外膜保持完整结构中起着非常重要的作用。重组TP4D抗原首先由Feniger等在E coli RRI大肠杆菌中表达和分离提纯[7]。Borenstein等用肌注和静脉注射的方法探讨了重组TP 4D抗原对实验性梅青的影响，显示以4D抗原免疫动物后能够改变实验梅毒的病程，表明4D抗原免疫实验动物后，可对感染梅毒产生部分保护的作用。提示重组TP抗原是制备疫苗的又一可能途径。
(三)TP24 kD抗原：此重组蛋白是以质粒pUC8为载体在大肠杆菌中表达的一种分泌蛋白[8]，具有很强的免疫原性，其编码TP24kD抗原的DNA序列仅存在于致病性的TP基因中，而非致病性TP中不存在此DNA序列，提示TP24kD抗原与TP的致病性相关，但与TP致病性的关系有待进一步研究。Hsu等人的实验发现，重现24kD的表达可以改变大肠杆菌的生长形态，出现与一般大肠杆菌不一样的扁平粗糙的菌落和丝状样生长，表明24KD抗原与TP的生长特性相关。
, http://www.100md.com
(四)TmP A和TmP B：TmP A是一个分子量为42kD的TP膜蛋白。Schouls[9]等构建了能在大肠杆菌K-12中大量表达该重组蛋白的质粒载体pPLc245。Ijsselmuiden等[10]用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法探讨了重组TmPA抗原在血清学诊断中的意义，通过对148例未治疗和167例已治疗的梅毒血清以及190例非梅毒血清进行了检测，其敏感性分别为：一期梅毒76%、二期梅毒100%、早期稳性梅毒98%，在治疗后1年以内的梅毒患者中，其抗TmP A的滴度明显下降，这表明TmP A不仅在梅毒血清诊断中有意义，而且可望用于梅毒治疗效果的监测。TmP B基因位于TmP A基因下游[9]。Schouls等人的实验表明，抗TmP B抗体渡度随着梅毒患者的治疗呈下降趋势，因而可望用于梅毒治疗的监测。但单独用Tmp B抗原不适宜作血清学诊断，因为梅毒患者血清的很大一部分对Tmp B不起反应。Wicher等[11]用重组TP抗原对豚鼠进行免疫，结果发现，重组TP抗原中只有TmP B可以改变梅毒的病程，提示重组TmP B抗原在疫苗制备中可能有一定的意义。
, 百拇医药
(五)TP47kD抗原：该蛋白为TP整合性膜蛋白抗原，1986年Norgard等[12]在大肠杆菌中首先克隆及表达了重组47kD抗原。多中心研究发现[13]，此蛋白有很强的免疫原性，在TP中含量非常丰富，且为致病菌特有的蛋白。Chamberlain等[12]采用含有依赖T7 RNA多聚酶的表达载体，建立了高效表达重组47kD的系统，并对此重组抗原与自TP中分离得到的自然47kD蛋白进行了生物学分析与比较，结果表明这两种来源的47kD抗原其生物学特性相同，均为含蛋白脂质，其疏水性可能与致病性有关。为了探讨疏水性结构与抗原性的关系，Weigel等[14]表达了非酰化的亲水性重组47kD抗原，通过免疫印迹试验对116例不同期的梅毒血清进行检测，表明亲水性重组47kD抗原的抗原性保持不变，说明酰化结构与抗原性无关。
除了上述蛋白抗原外尚有多种具有较强抗原性的TP重组抗原，如Tromp2( 28kD)[15]，TmPC(35kD)及34kD抗原等。这些重组抗原的生物学及免疫学特性等有待进一步探讨。
, http://www.100md.com
三、重组TP抗原在血清学诊断中的应用
尽管Fujimura等[16]用ELISA检测了不同重组抗原的免疫反应性，发现G17的反应性比M47、S42和G15都高。但近年来的应用研究趋向于将2种或2种以上的重组抗原联合使用，综合两种或多种抗原的不同特性，从而使其具有更高的特异性和敏感性。
(一)15kD与47 kD组合[17]：目前认为15 kD和47 kD是两种抗原性最强的TP蛋白，Zrein等对以重组15 kD和47 kD为抗原的酶免疫试剂盒——ELISyph-rG的敏感性和特异性进行了评价。在TPHA检测阳性的血清中，其ELISyph-rG结果和TPHA抗体滴度之间的相关性为0.94。在对VDRL方法检测为阴性的1822份正常健康自愿者血清(其中440份血清用TPHA检测为阴性)检测后，结果在这1822份血清中用ELISyph-rG法检测出4份阳性血清。用FTA-ABS和WB法对阳性血清进行进一步确证发现，其敏感性达100%，特异性大于99.8%，认为以重组15 kD和47 kD为抗原的ELISyph-rG法可代替VDRL和TPHA法，适合用于大样本的筛检。
, http://www.100md.com
(二)15 kD、17 kD、47 kD组：此3种TP抗原存于梅毒的整个病程中[18]，包括晚期稳性梅毒。尤其对于伴有HIV感染的梅毒患者在抗TP的含量低于一般梅毒患者的情况下亦能检测到抗47 kD抗体。Gerber等[3]人对3种重组抗原的联合应用进行了研究，结果表明18例梅毒患者中，17例患者在整个病程中均可检测到抗体，而42例正常人血清中无1例抗体阳性，提示这种检测方法有很高的敏感性和特异性。Young等[18]对这3种重组蛋白为抗原的酶免疫试剂盒——ICE Syphilis(immune-capture EIA)进行了评价，并与自然TP为抗原的试剂盒——Captia SelectSyph-G、TPHA、FTA-ABS及VDRL进行了比较，结果显示ICE Syphilis的特异性明显高于Captia SelectSyph-G(分别为99.8%与99.2%，P〈0.02〉，其敏感性也明显高于Captia SelectSyph-G、FTA-ABS及TPHA(分别为99%～100%，P〈0.01，91.4%～92.4%，92.4%和97.1%〉。在15例伴HIV感染的梅毒患者中，血清ICE Syphilis检测结果均为阳性，而Captia SelectSyph-G检测结果出现3例阴性。由此可见，ICE Syphilis 检测方法的高特异性及高敏感性将为梅毒的筛检测提供一种理想的手段。
, http://www.100md.com
Young等还建立了应用这3种重组蛋白为抗原的快速检测梅毒的胶乳凝集方法——Syphilis Fast [19]，并通过检测1518份随机血清标本，对Captia SelectSyph-G和VDRL的特异性进行了比较，以及在99份各期梅毒血清和15例筛检阳性的血清中对其敏感性进行了评价，其特异性(99.8%)明显高于Captia SelectSyyph-G(99.2%)和VDRL(99.1%)(P〈0.02〉，但其敏感性与Captia SelectSyph-G间没显著性差异(分别为93%和92.1%)，但这两种方法的敏感性均显著高于VDRL(46.5%)(P〈0.001)。由此可见，Syphilis Fast法可望成为一种特异性高、检测速度快、操作简便的梅毒筛检方法。
四、展望
Farley 等[20]认为，对有关人群进行梅毒筛检是控制和预防梅毒的重要措施之一。目前常规用于梅毒筛检和诊断的血清学试验主要有两种，一种是对脂类抗原的非螺旋体试验方法(如VDRL、RPR)，另一种是特异性梅毒螺旋体试验(如TPHA、FTA-ABS)。前者敏感性和特异性不高，存在着假阳性和假阴性，而后者最大的问题是抗原来源的缺乏，尚未得到解决。因为TP目前还不能人工培养，其用于诊断试验的TP主要通过兔睾丸接种获得，这既需要一定的实验室条件，又费时、费力、费材料。因此探讨重组TP抗原的梅毒血清学诊断中的应用是制备重组抗原的主要目的之一，重组蛋白的制备使我们能够在实验室里得到不同目的抗原，这一方面为建立现有梅毒血清学诊断的替代方法提供了条件，同时又为建立特异性和敏感性更高的诊断新方法奠定了基础，如通过重组抗原制备单克隆抗体，以建立检测梅毒抗原的方法，将为神经梅毒、早期隐性梅毒的实验室诊断提供新的手段。同时通过对不同重组抗原的结构，以及生物学和免疫学的分析，可以达到筛选TP致病因子和开发TP疫苗的目的，为TP的预防和治疗提供更加有效的手段。
, 百拇医药
参考文献
1.Fraser GM et al. Science ,1998;281(17):375-388
2.Walfifld AM et al. Science ,1982;216(30):522-523
3. Gerber A et al. Immunobiology ,1996;196(5):535-549
4.Purcell BK et al. Infect Immun,1989;57:3708-3414
5.Centurion-Lara A et al. Infect Immun,1997;65(4):1440-1444
6.Radolf JD et al. J Bacteriol,1987;169(4):1365-1371
, http://www.100md.com
7. Borenstein LA et al.J Immunol,1988;140:2415-2421
8. Hsu PL et al. Infect Immun,1988;56:1135-1143
9.Schouls LM et al. Infect Immun,1989;57:2612-2623
10. Ijsselmuiden OE et al. J Clin Microbiol,1989;27(1):152-157
11. Wicher K et al. Infect Immun,1991;59:4343-4348
12. Chamberlain NR et al. Infeet Immun,1988;56:71-78
, 百拇医药
13. Chamberlain NR et al. Infect Immun,1989;57:2878-2885
14.Weigel LM et al. Infect Immun,1992;60:1568-1576
15.Champion CI et al.J Bacteriol,1997;179:1230-1238
16. Fujimura K et al. J Clin Lab Anal,1997;11:315-322
17.Zrein M et al. J Clin Microbiol,1995;33:525-527
18. Young H et al. J Clin Microbiol.1998;36:913-917
19. Young H et al. Int J STD AIDS,1998;9:196-200
20.Farley TA et al. Sex Transm Dis .1997;24:227-228
2000-02-29 18：24
校对：杜育苗, http://www.100md.com
中国协和医科大学皮肤病研究所 徐文严审校
摘要 在梅毒螺旋体人工培养尚未获得成功的情况下，基因克隆(即DNA重组)技术的出现为该病原的研究开辟了一条新的途径。应用基因工程技术目前已制备出多种重组梅毒螺旋体抗原，这些抗原的制备对梅毒发病机理的探讨、疫苗的研制、以及血清学诊断试验的建立与应用具有重要意义，为梅毒的预防和控制提供了更加有效的手段。
关键词：梅毒螺旋体 重组抗原
一、概况
梅毒是一种临床表现极为复杂，几乎可累及全身各器官的性病。尽管本世纪40代年发现了治疗梅毒的理想药物——青霉素，但目前该病在全球仍然是一项重要的公共卫生问题[1]。目前尚未解决梅毒的病原体——梅毒螺旋体(Treponema pallidum,TP)的人工培养问题，从而阻碍了对TP致病机理探讨、疫苗研制、以及梅毒血清学诊断技术开发等方面的深入研究。80年代初，随着分子生物学技术的发展，特别是基因工程(DNA重组)技术的出现使梅毒螺旋体的研究进入一个新的阶段[2]，目前，TP的全部基因组DNA序列已经被解析[1]。通过重组TP DNA的克隆以及在大肠杆菌中的表达，制备出多种重组TP抗原，为梅毒的研究提供了一条新的途径。现就近10年来有关重组TP抗原的研究现况进行复习。
, http://www.100md.com
二、重组TP抗原的特性及制备
目前已重组的TP抗原有近20多种，如TpN15、TpN17、TpN19、TpN29～35(TpD)、TpN44.5(TmP A)、TpN47、TpN35(Tmp C)等[3]。现将其中部分有应用前景的重组TP抗原分述如下。
(一)TP15kD抗原[4]：15kD蛋白是一种脂蛋白，首先由Hensel等1985年分离鉴定，它在TP膜蛋白中的含量相对较少，但在免疫印迹试验中与人梅毒血清间显示了超强的反应性，同时对实验梅毒兔的淋巴细胞有很强的增生反应，表明15kD蛋白不仅具有较强的体液免疫原性，而且有较强的细胞免疫原性，但Centurion-Lara等[5]实验表明，此蛋白对TP感染没有任何免疫保护性。重组15kD抗原基因由Norgard 等用特异的单克隆抗体从TP基因库中筛选得到[4]。其最新报道的表达质粒为pMALc2[5]，该质粒在DNA插入位点的上游含有麦芽糖结合蛋白基因，使表达的融合蛋白易于分离和提纯。
, http://www.100md.com
(二)4D抗原：4D抗原是分子量分19kD的一种TP外膜蛋白，Radolf等[6]研究发现无论是自然状态还是重组4D蛋白都由二巯键交叉相联成寡聚结构，且耐蛋白酶，表明4D抗原可能在TP外膜保持完整结构中起着非常重要的作用。重组TP4D抗原首先由Feniger等在E coli RRI大肠杆菌中表达和分离提纯[7]。Borenstein等用肌注和静脉注射的方法探讨了重组TP 4D抗原对实验性梅青的影响，显示以4D抗原免疫动物后能够改变实验梅毒的病程，表明4D抗原免疫实验动物后，可对感染梅毒产生部分保护的作用。提示重组TP抗原是制备疫苗的又一可能途径。
(三)TP24 kD抗原：此重组蛋白是以质粒pUC8为载体在大肠杆菌中表达的一种分泌蛋白[8]，具有很强的免疫原性，其编码TP24kD抗原的DNA序列仅存在于致病性的TP基因中，而非致病性TP中不存在此DNA序列，提示TP24kD抗原与TP的致病性相关，但与TP致病性的关系有待进一步研究。Hsu等人的实验发现，重现24kD的表达可以改变大肠杆菌的生长形态，出现与一般大肠杆菌不一样的扁平粗糙的菌落和丝状样生长，表明24KD抗原与TP的生长特性相关。
, http://www.100md.com
(四)TmP A和TmP B：TmP A是一个分子量为42kD的TP膜蛋白。Schouls[9]等构建了能在大肠杆菌K-12中大量表达该重组蛋白的质粒载体pPLc245。Ijsselmuiden等[10]用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法探讨了重组TmPA抗原在血清学诊断中的意义，通过对148例未治疗和167例已治疗的梅毒血清以及190例非梅毒血清进行了检测，其敏感性分别为：一期梅毒76%、二期梅毒100%、早期稳性梅毒98%，在治疗后1年以内的梅毒患者中，其抗TmP A的滴度明显下降，这表明TmP A不仅在梅毒血清诊断中有意义，而且可望用于梅毒治疗效果的监测。TmP B基因位于TmP A基因下游[9]。Schouls等人的实验表明，抗TmP B抗体渡度随着梅毒患者的治疗呈下降趋势，因而可望用于梅毒治疗的监测。但单独用Tmp B抗原不适宜作血清学诊断，因为梅毒患者血清的很大一部分对Tmp B不起反应。Wicher等[11]用重组TP抗原对豚鼠进行免疫，结果发现，重组TP抗原中只有TmP B可以改变梅毒的病程，提示重组TmP B抗原在疫苗制备中可能有一定的意义。
, 百拇医药
(五)TP47kD抗原：该蛋白为TP整合性膜蛋白抗原，1986年Norgard等[12]在大肠杆菌中首先克隆及表达了重组47kD抗原。多中心研究发现[13]，此蛋白有很强的免疫原性，在TP中含量非常丰富，且为致病菌特有的蛋白。Chamberlain等[12]采用含有依赖T7 RNA多聚酶的表达载体，建立了高效表达重组47kD的系统，并对此重组抗原与自TP中分离得到的自然47kD蛋白进行了生物学分析与比较，结果表明这两种来源的47kD抗原其生物学特性相同，均为含蛋白脂质，其疏水性可能与致病性有关。为了探讨疏水性结构与抗原性的关系，Weigel等[14]表达了非酰化的亲水性重组47kD抗原，通过免疫印迹试验对116例不同期的梅毒血清进行检测，表明亲水性重组47kD抗原的抗原性保持不变，说明酰化结构与抗原性无关。
除了上述蛋白抗原外尚有多种具有较强抗原性的TP重组抗原，如Tromp2( 28kD)[15]，TmPC(35kD)及34kD抗原等。这些重组抗原的生物学及免疫学特性等有待进一步探讨。
, http://www.100md.com
三、重组TP抗原在血清学诊断中的应用
尽管Fujimura等[16]用ELISA检测了不同重组抗原的免疫反应性，发现G17的反应性比M47、S42和G15都高。但近年来的应用研究趋向于将2种或2种以上的重组抗原联合使用，综合两种或多种抗原的不同特性，从而使其具有更高的特异性和敏感性。
(一)15kD与47 kD组合[17]：目前认为15 kD和47 kD是两种抗原性最强的TP蛋白，Zrein等对以重组15 kD和47 kD为抗原的酶免疫试剂盒——ELISyph-rG的敏感性和特异性进行了评价。在TPHA检测阳性的血清中，其ELISyph-rG结果和TPHA抗体滴度之间的相关性为0.94。在对VDRL方法检测为阴性的1822份正常健康自愿者血清(其中440份血清用TPHA检测为阴性)检测后，结果在这1822份血清中用ELISyph-rG法检测出4份阳性血清。用FTA-ABS和WB法对阳性血清进行进一步确证发现，其敏感性达100%，特异性大于99.8%，认为以重组15 kD和47 kD为抗原的ELISyph-rG法可代替VDRL和TPHA法，适合用于大样本的筛检。
, http://www.100md.com
(二)15 kD、17 kD、47 kD组：此3种TP抗原存于梅毒的整个病程中[18]，包括晚期稳性梅毒。尤其对于伴有HIV感染的梅毒患者在抗TP的含量低于一般梅毒患者的情况下亦能检测到抗47 kD抗体。Gerber等[3]人对3种重组抗原的联合应用进行了研究，结果表明18例梅毒患者中，17例患者在整个病程中均可检测到抗体，而42例正常人血清中无1例抗体阳性，提示这种检测方法有很高的敏感性和特异性。Young等[18]对这3种重组蛋白为抗原的酶免疫试剂盒——ICE Syphilis(immune-capture EIA)进行了评价，并与自然TP为抗原的试剂盒——Captia SelectSyph-G、TPHA、FTA-ABS及VDRL进行了比较，结果显示ICE Syphilis的特异性明显高于Captia SelectSyph-G(分别为99.8%与99.2%，P〈0.02〉，其敏感性也明显高于Captia SelectSyph-G、FTA-ABS及TPHA(分别为99%～100%，P〈0.01，91.4%～92.4%，92.4%和97.1%〉。在15例伴HIV感染的梅毒患者中，血清ICE Syphilis检测结果均为阳性，而Captia SelectSyph-G检测结果出现3例阴性。由此可见，ICE Syphilis 检测方法的高特异性及高敏感性将为梅毒的筛检测提供一种理想的手段。
, http://www.100md.com
Young等还建立了应用这3种重组蛋白为抗原的快速检测梅毒的胶乳凝集方法——Syphilis Fast [19]，并通过检测1518份随机血清标本，对Captia SelectSyph-G和VDRL的特异性进行了比较，以及在99份各期梅毒血清和15例筛检阳性的血清中对其敏感性进行了评价，其特异性(99.8%)明显高于Captia SelectSyyph-G(99.2%)和VDRL(99.1%)(P〈0.02〉，但其敏感性与Captia SelectSyph-G间没显著性差异(分别为93%和92.1%)，但这两种方法的敏感性均显著高于VDRL(46.5%)(P〈0.001)。由此可见，Syphilis Fast法可望成为一种特异性高、检测速度快、操作简便的梅毒筛检方法。
四、展望
Farley 等[20]认为，对有关人群进行梅毒筛检是控制和预防梅毒的重要措施之一。目前常规用于梅毒筛检和诊断的血清学试验主要有两种，一种是对脂类抗原的非螺旋体试验方法(如VDRL、RPR)，另一种是特异性梅毒螺旋体试验(如TPHA、FTA-ABS)。前者敏感性和特异性不高，存在着假阳性和假阴性，而后者最大的问题是抗原来源的缺乏，尚未得到解决。因为TP目前还不能人工培养，其用于诊断试验的TP主要通过兔睾丸接种获得，这既需要一定的实验室条件，又费时、费力、费材料。因此探讨重组TP抗原的梅毒血清学诊断中的应用是制备重组抗原的主要目的之一，重组蛋白的制备使我们能够在实验室里得到不同目的抗原，这一方面为建立现有梅毒血清学诊断的替代方法提供了条件，同时又为建立特异性和敏感性更高的诊断新方法奠定了基础，如通过重组抗原制备单克隆抗体，以建立检测梅毒抗原的方法，将为神经梅毒、早期隐性梅毒的实验室诊断提供新的手段。同时通过对不同重组抗原的结构，以及生物学和免疫学的分析，可以达到筛选TP致病因子和开发TP疫苗的目的，为TP的预防和治疗提供更加有效的手段。
, 百拇医药
参考文献
1.Fraser GM et al. Science ,1998;281(17):375-388
2.Walfifld AM et al. Science ,1982;216(30):522-523
3. Gerber A et al. Immunobiology ,1996;196(5):535-549
4.Purcell BK et al. Infect Immun,1989;57:3708-3414
5.Centurion-Lara A et al. Infect Immun,1997;65(4):1440-1444
6.Radolf JD et al. J Bacteriol,1987;169(4):1365-1371
, http://www.100md.com
7. Borenstein LA et al.J Immunol,1988;140:2415-2421
8. Hsu PL et al. Infect Immun,1988;56:1135-1143
9.Schouls LM et al. Infect Immun,1989;57:2612-2623
10. Ijsselmuiden OE et al. J Clin Microbiol,1989;27(1):152-157
11. Wicher K et al. Infect Immun,1991;59:4343-4348
12. Chamberlain NR et al. Infeet Immun,1988;56:71-78
, 百拇医药
13. Chamberlain NR et al. Infect Immun,1989;57:2878-2885
14.Weigel LM et al. Infect Immun,1992;60:1568-1576
15.Champion CI et al.J Bacteriol,1997;179:1230-1238
16. Fujimura K et al. J Clin Lab Anal,1997;11:315-322
17.Zrein M et al. J Clin Microbiol,1995;33:525-527
18. Young H et al. J Clin Microbiol.1998;36:913-917
19. Young H et al. Int J STD AIDS,1998;9:196-200
20.Farley TA et al. Sex Transm Dis .1997;24:227-228
2000-02-29 18：24
校对：杜育苗, http://www.100md.com