金雀异黄素及二个结构改造物与抗肿瘤抗血小板作用的关系
佘戟 莫丽儿 翁云 梁念慈
摘 要 目的：合成金雀异黄素水溶性衍生物并研究它们在抗肿瘤、抗血小板作用中的影响。方法：通过浓硫酸酯化金雀异黄素(G)，加入饱和NaCl溶液，获得二个水溶性衍生物：金雀异黄素-4′-硫酸酯钠(G1)和金雀异黄素-7，4′-二硫酸酯二钠(G2)。同时研究了G与G1、G2抑制HL-60细胞生长和猪血小板聚集作用的关系。结果：各药物抑制HL-60细胞生长(24h)的IC50(μmol/L)值：G=49.5;G1>200;G2>300。对猪血小板聚集的抑制作用，G的IC50值为4.8μmol/L，而G1和G2则未表现出显著的抑制作用。结论：G具有较强的抑制HL-60细胞生长和猪血小板聚集的作用，而G1、G2由于4′-OH的封闭导致抑制效果不显著。
, 百拇医药
关键词：金雀异黄素 水溶性 衍生物 抗肿瘤 血小板
金雀异黄素(Genistein,4′,5,7-trihydroxyisoflavone，G)是大豆等多种植物体中的活性成分，具有明显地抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化及改善妇女更年期症状的作用[1，2]，但G的水溶性和脂溶性均相当差，生物利用度低。因此，用化学方法对G进行结构改造改善溶解度和药效已引起重视[3，4]。本文作者尝试合成了二种水溶性衍生物G1和G2，并将它们与G一起进行了抗肿瘤、抗血小板作用的初步研究。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
金雀异黄素(Sigma),Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech)，浓硫酸(d=1.84)(广州化学试剂厂)，PRMI-1640培养基(Gibco),凝血酶(Sigma),其它试剂均为分析纯，HL-60细胞(北京军事医学科学院)，猪血取自湛江屠宰场(电击)。
, 百拇医药
Lambda-2S型紫外/可见光谱仪(PE);KYKY-ZHP-5型双聚集高分辨率质谱(中国科学院);175C/UMA-500型显微红外光谱仪(Bio-RAD);DRX-400型400MHz超导核磁共振谱仪(Bruker);CO2孵箱(Precision);IS6000C型液闪计数仪(Beckman);TYXN-91智能型血液凝集仪(上海)。
1.2 衍生物制备方法
10ml平底烧瓶中加入白色粉末G 92.3mg,于0～5℃搅拌下滴加0.5ml浓硫酸，维持搅拌反应6h。加入6ml饱和NaCl水溶液，搅至奶黄色。静置至室温，减压抽滤，用4×1ml饱和NaCl水溶液洗涤，抽滤至干，滤饼真空干燥。干燥的滤饼经5×50ml无水乙醇抽提，抽提液合并浓缩至小体积，置冰箱冷却析出浅色物质，减压抽滤，滤饼用4ml 30%乙醇水溶液在70℃水浴下热溶解，静置至室温，经纸上电泳(缓冲液:HCOOH-AcOH-H2O=43∶147∶1820;1% FeCl3显色)确定二点:u=0.1937(cm2/v.h),呈紫黑色;u=0.406(cm2/v.h),呈紫红色；胶束纸色谱(展开剂：0.01mol/L SDS水溶液+4%异丙醇,5% AlCl3甲醇溶液显色)在365nm紫外灯下检出三点:Rf=0.37,显淡蓝绿色;Rf=0.46,显黄绿色;Rf=0.80,显亮青蓝色。
, 百拇医药
Sephadex LH-20柱(20×300mm)预先经30%乙醇水溶液平衡，然后加入上述4ml 30%乙醇样品水溶液，分别用30%,50%和80%乙醇水溶液依次洗脱，分管收集(5ml/15min),相同成分合并浓缩，减压抽滤，滤饼真空干燥，用水-丙酮=1∶10重结晶两次，得三个纯品：灰色粉末A,4.5mg；淡黄色晶状物B,84.8mg；粉红色不定形粉末C,21mg。
1.3 对HL-60细胞生长的抑制实验(数细胞法)
取对数生长期的HL-60细胞，用完全培养基稀释至2.0～3.0×105/ml的浓度，分装入培养瓶，每瓶10ml。分别在每瓶中加入10μl不同浓度的药物(DMSO作溶剂)，对照组只加入10μl相应的溶剂，加药的细胞于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中培养24h后做实验，用台盼兰染色并在倒置显微镜下进行细胞计数，每一浓度数5～6次，取均值。数据经直线回归，计算各药物抑制HL-60细胞生长的IC50值。
, 百拇医药
1.4 对猪血小板聚集的抑制实验(比浊法)
取猪血小板悬浮液(血小板浓度为2×108/ml)200μl,分别加入不同浓度的药物,37℃保温3min(DMSO浓度控制在0.5%),加入终浓度为250U/L的凝血酶作诱导剂(对照组不加凝血酶)，测定5min内的最大聚集率，每个浓度重复4次，取均值。数据经直线回归，计算各药物抑制猪血小板聚集的IC50值。2 结 果
2.1 衍生物的结构鉴定：见表1，2。
表1 化合物A、B、C的UV、MS、IR数据
mp(℃)
UVλMcOHmax(nm)
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GC-MS(m/z)
FAB-MS(m/z)
(间硝基苄醇为基质)
FT-IR(KBr)(cm-1)
A
297～298
261，325sh
271(M++1)
3 412(OH)，1 648，1 615(α，β-不饱和C=0)
270(M+)
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1 582，1 552，1 519，1 503(-Ar)
254(M+-16)
B
>300
261.2，325.5sh
371(M+)
3 320，3 255(OH)；1 662(α，β-不饱和C=0)
349(M+-Na)
1 579，1 512，1 436(-Ar)，1 414，1 360，1 328(S=0)
, 百拇医药
C
>300
262.1，324.7sh
473(M+)
3 200(OH),1 655(α,β-不饱和C=0)
451(M+-Na)
1 613，1 574，1 495，1 440(-Ar)
429(M+-Na)
1 372，1 336(S=0)
化合物A经GC-MS分析和微机谱库软件检索确定为金雀异黄素(G)。
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化合物B，纸上电泳：u=0.1937(cm2/v.h)；被确定为金雀异黄素-4′-硫酸酯钠(G1)。
化合物C，纸上电泳：u=0.406(cm2/v.h)；被确证为金雀异黄素-7，4′-二硫酸酯二钠(G2)。
2.2 各药物对HL-60细胞生长和猪血小板聚集的抑制作用
各药物抑制HL-60细胞生长(24h)的IC50(μmol/L)值:G=49.5;G1>200;G2>300。
对猪血小板聚集的抑制作用的结果显示，G具有较强的抑制活性,IC50值为4.8μmol/L;而G1和G2则未表现出显著的抑制作用。3 讨 论
, 百拇医药
在研究中，我们考察了各温度梯度对反应产物的影响，发现在常温以上直接使用浓硫酸对G的结构会产生破坏作用，使反应的转化率降低，并使产物成分复杂化。但采用吡啶等助溶剂，则给分离纯化带来许多困难。因此，此法宜于低温下进行，工艺简捷实用。
表2 化合物A、B、C的1HNMR(400MHz,DMSO-d6,DSS内标)δ/ppm
A
B
C
7-0H
10.87(1H，s)
10.60(1H，s)
5-OH
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12.95(1H，s)
12.89(1H，s)
12.84(1H，s)
4′-OH
9.57(1H，s)
C2-H
8.32(1H，s)
8.33(1H，s)
8.37(1H，s)
C2′,6′-H
7.36(2H，dd)
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7.69(2H，dd)
7.73(2H，dd)
C3′,5′-H
6.81(2H，dd)
7.37(2H，dd)
7.38(2H，dd)
C6-H
6.37(1H，d)
6.37(1H，d)
6.68(1H，d)
C8-H
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6.21(1H，d)
6.21(1H，d)
6.52(1H，d)
首次通过胶束纸色谱将G、G1、G2分离。常用的纸上电泳法检测产物成分时，由于反应产物中残留的G呈中性，在电泳中无法表现出来，使产物成分难以确定，会导致产品不纯；而通过胶束纸色谱经荧光检测可清晰地分辩出G、G1、G2成分，有利于纯化产物。
活性实验结果表明，G本身显示出较强的抑制HL-60细胞生长和猪血小板聚集的作用，但当转化成水溶性硫酸酯化，由于4′-OH的首先被封闭，导致G1、G2的抗肿瘤细胞生长的活性急剧降低，且不表现出抑制血小板聚集的作用，这与认为4′位和5位羟基是G具有生物活性所必需的报道[5]相符合，但G2的结果也说明7位羟基的封闭会使G1的活性进一步降低，由此表明仅通过浓硫酸直接酯化G的结构改造路线对保持G的生物活性强度是不适合的。酚类化合物的酚羟基对抗肿瘤作用有着重要意义[6]，G的各类生物活性作用不仅因为它具有异黄酮结构，而且也因其A、B环上存在三个酚羟基。我们知道，酚羟基的多寡与其活性具有一定关系，且各羟基之间可能存在协同作用[4]，由于G的酚羟基数目较少(相对槲皮素、杨梅黄素等)，所以，封闭其中一个都将导致活性的较大损失，这预示我们不应仅对其酚羟基进行改造，而应考虑在保留G的酚羟基存在的同时，通过其它位置或与其它基团的改造以及改变G的剂型来达到改变G的临床给药方式，促进G在体内的吸收，为此本研究组将继续于这方面的探讨。 *本课题由广东省高教厅重点学科专项基金[粤高教科(1996)4号]和广东医学院青年科学基金[(1997)XQ9704号]共同资助
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作者简介：佘戟，35岁，1987年毕业于湖南师范大学化学系，讲师
作者单位：佘 戟 莫丽儿 湛江 524023 广东医学院化学教研室；翁云 梁念慈 医用生物化学研究所
参考文献
[1]郑高利.大豆异黄酮的药理作用Ⅰ.中国现代应用药学杂志，1998，15(1)∶4.
[2]郑高利.大豆异黄酮的药理作用Ⅱ.中国现代应用药学杂志，1998，15(2)∶9.
[3]Chang YC,Nair MG,Nitiss JL.Metabolites of daidzein and genistein and their biogical activities.J of Nat Prod,1995,58(12)∶1901.
[4]王昕，姚崇舜，陈济民.葛根黄豆苷元结构改造及其构效关系.沈阳药科大学学报，1996，13(4)∶300.
[5]Barnes S,Pelerson TG.Biochemical largets of the isoflavone genistein in tumor cell lines.Society for Experimental Biology and Mcdicine,1995,208(1)∶103.
[6]薛惟建，李德华.酚类化合物的抗肿瘤作用机制.药学学报，1985，20(6)∶477., 百拇医药(佘戟 莫丽儿 翁云 梁念慈)
摘 要 目的：合成金雀异黄素水溶性衍生物并研究它们在抗肿瘤、抗血小板作用中的影响。方法：通过浓硫酸酯化金雀异黄素(G)，加入饱和NaCl溶液，获得二个水溶性衍生物：金雀异黄素-4′-硫酸酯钠(G1)和金雀异黄素-7，4′-二硫酸酯二钠(G2)。同时研究了G与G1、G2抑制HL-60细胞生长和猪血小板聚集作用的关系。结果：各药物抑制HL-60细胞生长(24h)的IC50(μmol/L)值：G=49.5;G1>200;G2>300。对猪血小板聚集的抑制作用，G的IC50值为4.8μmol/L，而G1和G2则未表现出显著的抑制作用。结论：G具有较强的抑制HL-60细胞生长和猪血小板聚集的作用，而G1、G2由于4′-OH的封闭导致抑制效果不显著。
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关键词：金雀异黄素 水溶性 衍生物 抗肿瘤 血小板
金雀异黄素(Genistein,4′,5,7-trihydroxyisoflavone，G)是大豆等多种植物体中的活性成分，具有明显地抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化及改善妇女更年期症状的作用[1，2]，但G的水溶性和脂溶性均相当差，生物利用度低。因此，用化学方法对G进行结构改造改善溶解度和药效已引起重视[3，4]。本文作者尝试合成了二种水溶性衍生物G1和G2，并将它们与G一起进行了抗肿瘤、抗血小板作用的初步研究。
1 实验部分
1.1 试剂与仪器
金雀异黄素(Sigma),Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech)，浓硫酸(d=1.84)(广州化学试剂厂)，PRMI-1640培养基(Gibco),凝血酶(Sigma),其它试剂均为分析纯，HL-60细胞(北京军事医学科学院)，猪血取自湛江屠宰场(电击)。
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Lambda-2S型紫外/可见光谱仪(PE);KYKY-ZHP-5型双聚集高分辨率质谱(中国科学院);175C/UMA-500型显微红外光谱仪(Bio-RAD);DRX-400型400MHz超导核磁共振谱仪(Bruker);CO2孵箱(Precision);IS6000C型液闪计数仪(Beckman);TYXN-91智能型血液凝集仪(上海)。
1.2 衍生物制备方法
10ml平底烧瓶中加入白色粉末G 92.3mg,于0～5℃搅拌下滴加0.5ml浓硫酸，维持搅拌反应6h。加入6ml饱和NaCl水溶液，搅至奶黄色。静置至室温，减压抽滤，用4×1ml饱和NaCl水溶液洗涤，抽滤至干，滤饼真空干燥。干燥的滤饼经5×50ml无水乙醇抽提，抽提液合并浓缩至小体积，置冰箱冷却析出浅色物质，减压抽滤，滤饼用4ml 30%乙醇水溶液在70℃水浴下热溶解，静置至室温，经纸上电泳(缓冲液:HCOOH-AcOH-H2O=43∶147∶1820;1% FeCl3显色)确定二点:u=0.1937(cm2/v.h),呈紫黑色;u=0.406(cm2/v.h),呈紫红色；胶束纸色谱(展开剂：0.01mol/L SDS水溶液+4%异丙醇,5% AlCl3甲醇溶液显色)在365nm紫外灯下检出三点:Rf=0.37,显淡蓝绿色;Rf=0.46,显黄绿色;Rf=0.80,显亮青蓝色。
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Sephadex LH-20柱(20×300mm)预先经30%乙醇水溶液平衡，然后加入上述4ml 30%乙醇样品水溶液，分别用30%,50%和80%乙醇水溶液依次洗脱，分管收集(5ml/15min),相同成分合并浓缩，减压抽滤，滤饼真空干燥，用水-丙酮=1∶10重结晶两次，得三个纯品：灰色粉末A,4.5mg；淡黄色晶状物B,84.8mg；粉红色不定形粉末C,21mg。
1.3 对HL-60细胞生长的抑制实验(数细胞法)
取对数生长期的HL-60细胞，用完全培养基稀释至2.0～3.0×105/ml的浓度，分装入培养瓶，每瓶10ml。分别在每瓶中加入10μl不同浓度的药物(DMSO作溶剂)，对照组只加入10μl相应的溶剂，加药的细胞于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱中培养24h后做实验，用台盼兰染色并在倒置显微镜下进行细胞计数，每一浓度数5～6次，取均值。数据经直线回归，计算各药物抑制HL-60细胞生长的IC50值。
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1.4 对猪血小板聚集的抑制实验(比浊法)
取猪血小板悬浮液(血小板浓度为2×108/ml)200μl,分别加入不同浓度的药物,37℃保温3min(DMSO浓度控制在0.5%),加入终浓度为250U/L的凝血酶作诱导剂(对照组不加凝血酶)，测定5min内的最大聚集率，每个浓度重复4次，取均值。数据经直线回归，计算各药物抑制猪血小板聚集的IC50值。2 结 果
2.1 衍生物的结构鉴定：见表1，2。
表1 化合物A、B、C的UV、MS、IR数据
mp(℃)
UVλMcOHmax(nm)
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GC-MS(m/z)
FAB-MS(m/z)
(间硝基苄醇为基质)
FT-IR(KBr)(cm-1)
A
297～298
261，325sh
271(M++1)
3 412(OH)，1 648，1 615(α，β-不饱和C=0)
270(M+)
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1 582，1 552，1 519，1 503(-Ar)
254(M+-16)
B
>300
261.2，325.5sh
371(M+)
3 320，3 255(OH)；1 662(α，β-不饱和C=0)
349(M+-Na)
1 579，1 512，1 436(-Ar)，1 414，1 360，1 328(S=0)
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C
>300
262.1，324.7sh
473(M+)
3 200(OH),1 655(α,β-不饱和C=0)
451(M+-Na)
1 613，1 574，1 495，1 440(-Ar)
429(M+-Na)
1 372，1 336(S=0)
化合物A经GC-MS分析和微机谱库软件检索确定为金雀异黄素(G)。
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化合物B，纸上电泳：u=0.1937(cm2/v.h)；被确定为金雀异黄素-4′-硫酸酯钠(G1)。
化合物C，纸上电泳：u=0.406(cm2/v.h)；被确证为金雀异黄素-7，4′-二硫酸酯二钠(G2)。
2.2 各药物对HL-60细胞生长和猪血小板聚集的抑制作用
各药物抑制HL-60细胞生长(24h)的IC50(μmol/L)值:G=49.5;G1>200;G2>300。
对猪血小板聚集的抑制作用的结果显示，G具有较强的抑制活性,IC50值为4.8μmol/L;而G1和G2则未表现出显著的抑制作用。3 讨 论
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在研究中，我们考察了各温度梯度对反应产物的影响，发现在常温以上直接使用浓硫酸对G的结构会产生破坏作用，使反应的转化率降低，并使产物成分复杂化。但采用吡啶等助溶剂，则给分离纯化带来许多困难。因此，此法宜于低温下进行，工艺简捷实用。
表2 化合物A、B、C的1HNMR(400MHz,DMSO-d6,DSS内标)δ/ppm
A
B
C
7-0H
10.87(1H，s)
10.60(1H，s)
5-OH
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12.95(1H，s)
12.89(1H，s)
12.84(1H，s)
4′-OH
9.57(1H，s)
C2-H
8.32(1H，s)
8.33(1H，s)
8.37(1H，s)
C2′,6′-H
7.36(2H，dd)
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7.69(2H，dd)
7.73(2H，dd)
C3′,5′-H
6.81(2H，dd)
7.37(2H，dd)
7.38(2H，dd)
C6-H
6.37(1H，d)
6.37(1H，d)
6.68(1H，d)
C8-H
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6.21(1H，d)
6.52(1H，d)
首次通过胶束纸色谱将G、G1、G2分离。常用的纸上电泳法检测产物成分时，由于反应产物中残留的G呈中性，在电泳中无法表现出来，使产物成分难以确定，会导致产品不纯；而通过胶束纸色谱经荧光检测可清晰地分辩出G、G1、G2成分，有利于纯化产物。
活性实验结果表明，G本身显示出较强的抑制HL-60细胞生长和猪血小板聚集的作用，但当转化成水溶性硫酸酯化，由于4′-OH的首先被封闭，导致G1、G2的抗肿瘤细胞生长的活性急剧降低，且不表现出抑制血小板聚集的作用，这与认为4′位和5位羟基是G具有生物活性所必需的报道[5]相符合，但G2的结果也说明7位羟基的封闭会使G1的活性进一步降低，由此表明仅通过浓硫酸直接酯化G的结构改造路线对保持G的生物活性强度是不适合的。酚类化合物的酚羟基对抗肿瘤作用有着重要意义[6]，G的各类生物活性作用不仅因为它具有异黄酮结构，而且也因其A、B环上存在三个酚羟基。我们知道，酚羟基的多寡与其活性具有一定关系，且各羟基之间可能存在协同作用[4]，由于G的酚羟基数目较少(相对槲皮素、杨梅黄素等)，所以，封闭其中一个都将导致活性的较大损失，这预示我们不应仅对其酚羟基进行改造，而应考虑在保留G的酚羟基存在的同时，通过其它位置或与其它基团的改造以及改变G的剂型来达到改变G的临床给药方式，促进G在体内的吸收，为此本研究组将继续于这方面的探讨。 *本课题由广东省高教厅重点学科专项基金[粤高教科(1996)4号]和广东医学院青年科学基金[(1997)XQ9704号]共同资助
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作者简介：佘戟，35岁，1987年毕业于湖南师范大学化学系，讲师
作者单位：佘 戟 莫丽儿 湛江 524023 广东医学院化学教研室；翁云 梁念慈 医用生物化学研究所
参考文献
[1]郑高利.大豆异黄酮的药理作用Ⅰ.中国现代应用药学杂志，1998，15(1)∶4.
[2]郑高利.大豆异黄酮的药理作用Ⅱ.中国现代应用药学杂志，1998，15(2)∶9.
[3]Chang YC,Nair MG,Nitiss JL.Metabolites of daidzein and genistein and their biogical activities.J of Nat Prod,1995,58(12)∶1901.
[4]王昕，姚崇舜，陈济民.葛根黄豆苷元结构改造及其构效关系.沈阳药科大学学报，1996，13(4)∶300.
[5]Barnes S,Pelerson TG.Biochemical largets of the isoflavone genistein in tumor cell lines.Society for Experimental Biology and Mcdicine,1995,208(1)∶103.
[6]薛惟建，李德华.酚类化合物的抗肿瘤作用机制.药学学报，1985，20(6)∶477., 百拇医药(佘戟 莫丽儿 翁云 梁念慈)