缺血/再灌注时心肌细胞凋亡的研究进展
作者：刘琦 常志文
单位：首都医科大学附属北京同仁医院干部医疗科
关键词：
首都医科大学学报000437 细胞凋亡(apoptosis)或程序化细胞死亡(programmed cell death)是机体自胚胎起即存在的一种细胞死亡的方式,是维持细胞增生、死亡间平衡的重要方式。在胚胎发育过程中,通过凋亡可清除对机体无用和有害的细胞,清除多余的、发育不正常的细胞。在成年机体中,通过凋亡消除衰老的细胞,代之以新生细胞，从而维持组织器官中细胞数量的稳定。通过凋亡还可清除体内受伤的或有癌前病变的细胞,防止癌变;凋亡还参与机体的防御机制,当机体受到病毒感染时,可通过诱导感染病毒细胞凋亡来清除入侵病毒。但凋亡异常亦可造成肿瘤、自身免疫性疾病等。因此凋亡在机体发生、发展过程中具有广泛的病理、生理意义。
1 细胞凋亡的特点
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本世纪60年代,人们就注意到细胞死亡有2种不同的方式。1972年，病理学家Kerr首次提出了细胞凋亡这一概念。此后的一些研究也都进一步证实，细胞凋亡是一种具有独特的形态学和生化改变的与坏死截然不同的另一种死亡方式，是一种经基因严密调控的需能量参与的过程。它只涉及单个细胞的死亡，其典型的特征是细胞缩小、胞质凝缩，内质网疏松并与胞膜融合；核糖体等聚集，但无结构破坏，染色质固缩，密度增高并集聚于核膜周边，嗜碱性增强，核仁裂解，继而细胞膜出泡、内陷，将细胞自行分割成多个具有膜包裹的凋亡小体(apoptosis body)。凋亡小体可迅速被周围具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、降解，整个过程无细胞质漏出，故而无炎症反应。在凋亡过程中激活核酸内切酶在组蛋白八聚体之间的连接区切开DNA，使其成为180～200 bp整数倍的DNA片段，在琼脂凝胶电泳上形成独特的DNA区带图谱(DNA ladder)。利用这一特点，可用以检测凋亡细胞的存在[1，2]。
而细胞死亡的另一种方式为坏死。其特点为细胞胀大，细胞器肿胀、破坏、辨认不清，晚期有胞核破碎，染色质断裂成许多不规则的小凝块，胞膜破裂，细胞内容物外逸，诱发周围细胞的炎症反应。因此坏死一般是成片发生的，在形态上易与凋亡相区别。
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2 细胞凋亡基因调控的一些因素
2.1 bcl-2家族
bcl-2家族是最先被注意到与细胞凋亡有密切关系的基因之一，是1985年首先在B细胞滤泡性淋巴瘤中发现的，属抗凋亡基因。在T、B淋巴细胞的发育过程中，若有bcl-2基因的过表达，可促使细胞增生。将该基因通过表达载体导入细胞并使之表达能提高细胞对各种致命因素(如射线、生长因子的撤除等)的抵抗力，延长细胞寿命[3]。家族的另一成员Bax被6个外显子编码，Bax的表达或过表达，促使细胞凋亡[4]。 Miscao等对15例急性心肌梗死及12例陈旧性心肌梗死病人的尸体心肌进行免疫组化研究发现[5]，在心梗的早期存活的心肌细胞中有bcl-2的表达或过表达，这提示bcl-2的表达挽救了早期缺血的心肌细胞。而在心梗急性期的存活心肌细胞中未发现Bax的表达。反之，在陈旧阶段则多见有Bax的表达或过表达 。这证明bcl-2可抑制心肌细胞凋亡，而Bax诱导和促使细胞的凋亡。但bcl-2家族促使或抑制细胞凋亡的机制尚不明确。
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2.2 P53
P53基因是一种重要的抗癌基因。近年来人们发现P53与细胞凋亡有密切关系。Yonish Rouach等在1991年首先报道了野生型P53(wtP53)能诱导白细胞的凋亡[6]，突变型P53则抑制细胞凋亡。有研究表明，在家兔动脉硬化斑块中有P53突变蛋白存在，而野生型P53基因低表达。因此，P53基因可能在动脉硬化的发生发展中起重要意义。
2.3 c-myc
近年研究发现c-myc 基因具有刺激细胞增生和凋亡的双重调节作用。作为转录因子，c-myc 蛋白一方面激活那些介导细胞增生的基因，另一方面也激活介导凋亡的基因，使细胞增生或凋亡。若同时接受了其他附加存活因素，如生长因子存在、bcl-2 表达等，则增生占优势；反之发生细胞凋亡。bcl-2能够阻断c-myc诱导凋亡的作用，但不影响其增生作用[7]。
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2.4 Fas
Fas又称Apo-1，与Fas配体结合是引起细胞凋亡的主要途径之一[8]。Oshimi等证明了Fas与其抗体(或配体)结合后立即引起细胞内Ca2+浓度升高，Ca2+流入细胞内造成钙超载而致细胞死亡。 Fas抗原、抗体(配体)相互作用激动细胞凋亡信号传导系统可被bcl-2的表达所抑制。
3 缺血与再灌注时心肌细胞凋亡
过去认为心肌细胞和神经元细胞这些末期分化的细胞不发生细胞凋亡。1993年，国外学者在右室发育不良性心律失常的病人心肌上发现了凋亡的证据，首次证明人类心肌也存在细胞凋亡。近年来体内、体外实验发现多种损伤可诱发细胞凋亡。如缺血再灌注、心肌梗死、快速心室起搏、机械牵拉和自发性高血压大鼠,这些发现使人们对于心脏疾病有了新的理解和认识。
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溶栓治疗急性心肌梗死的目的是使与梗死心肌相关联的阻塞的冠状动脉再灌注，以挽救缺血心肌、减小梗死面积、提高心脏功能。但与此同时，再灌注本身也可对心肌产生有害影响。罗爱伦等以犬的心肌酶变化来研究缺血再灌注损伤[9]，结果显示心肌复跳后5 min，实验组与对照组间CK和CK-MB无显著差异，而在复跳后35 min、60 min 组间差异明显。提示心肌缺血再灌注过程中，心肌损伤可能由再灌注开始，并逐渐加重。Fliss用鼠的缺血再灌注模型，应用末端标记方法(ISEL) 对缺血及再灌注心肌进行检测发现[10]：无论是持续给予缺血刺激(2.25 h)，还是缺血后再灌注(缺血45 min后再灌注1 h)，均发现有心肌细胞的凋亡现象，且认为再灌注促进细胞凋亡的发生。这与Gottlieb等所做的兔的缺血再灌注后心肌细胞凋亡的结果相似[11]。Fliss等在上述同一实验中还发现缺血再灌注心肌中有大量白细胞浸润，并推测在再灌注心肌中白细胞浸润的速度可能与心肌细胞凋亡的速度相关。Saraste等对8例急性心梗(其中6例为溶栓成功)病人的尸检心肌分析证实在心肌梗死区及梗死边缘区均发现有典型的凋亡细胞[12]，边缘区明显多于梗死区，而在远处非梗死区及对照组心肌未发现有细胞凋亡。这说明在人的心肌梗死及心梗扩展中细胞凋亡可能有重要的作用。
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心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中所起的作用越来越引起人们的重视。发生再灌注损伤的机制尚不明确，可能与以下几点有关：①钙超载。在缺氧，尤其是再灌注期间NHE(Na-H exchanger)被激活，致细胞内Na+浓度增高，这增加了Na-Ca交换，使Ca2+集聚于细胞内，Ca2+增高可能与凋亡启动有关。HOE 642(NHE阻断剂)及Ca2+拮抗剂可抑制因钙超载致细胞凋亡，减少再灌注损伤[13]，在动物实验中与对照组相比较，可缩小梗死面积。②氧自由基致损伤。氧化还原反应是机体内最为广泛和重要的反应。在缺血再灌注时可产生大量的活性氧自由基。它们能与蛋白质、DNA和脂质体等反应引起蛋白质氧化、DNA断裂、胞膜出泡等细胞凋亡的典型特征，一些抗氧化物质及清除自由基的药物可减轻这一反应[14]。③炎性细胞浸润。缺血时有大量的白细胞被激活，这些白细胞经趋化游走随灌注血流进入缺血心肌，并粘附、聚集于此，可机械阻塞心肌毛细血管，加重心肌缺血性损伤，扩大心梗面积；还可产生氧自由基使心肌细胞凋亡。刘建等用白细胞滤过器滤除循环中的部分白细胞，给心肌提供一个低白细胞环境的再灌注血液，对心肌再灌注损伤有明显的保护作用[15]。
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综上所述，细胞凋亡现象存在于心肌缺血再灌注损伤的过程中，提示凋亡相关基因可能参与调控这一过程，并可能为各种损伤因素的始发环节。因此，从细胞凋亡的角度对缺血再灌注进行研究，将会从新的层次来解释心肌细胞损伤的机制，对急性心肌梗死溶栓术及PTCA术后心肌细胞再生及功能恢复的治疗带来新的前景。
参考文献
1，Kerr J F R,Wyllie A H.Apoptosis:A basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics.Br J Cancer,1972,26:239～257
2，Wyllie A H,Kerr J F.Cell death:The significant of apoptosis.Int Rev Cytol,1980,68:251～306
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3，Tsujimoto Y.Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma.Science,1985,228:1440～1443
4，Yang E,Zha J,Jockel J,et al.Bad,a heteroddimeric partner for bcl-x andbcl-2,displaces Bax and promotes cell death.Cell,1995,80:285～291
5，Misao J,Hayakawa Y,Ohno M,et al.Expr-ession of bcl-2 protein,an inhibitor of apoptosis,and Bax,an accelerator of apoptosis,in ventriculor myocytes of human heart with myocardial infarction.Circulation,1996,94:1506～1512
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6，Yonish Rouach E,Resnitzky D,Lotem J,et al.Wild-type P-53 induce apoptosis of myelid leukemic cell that is inhibited by inteerleukin-6.Nature,1991,352:345～437
7，Williams,Christopher A S.Molecular regulation of apoptosis:Genic controls on cell death.Cell,1993,74:777～779
8，Fraser A,Evan G.A license to kill.Cell,1996,85(6):781～784
9，罗爱伦,郭向阳,徐守春,等.卡托普利对缺血再灌注心脏保护作用的实验室研究.中华心血管疾病杂志,1998,26(3):226～228
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10，Fliss H,Gattinger D.Apoptosis in ischemic and reperfused rat mhocardium.Circ Res,1996,79:949～956
11，Gottlieb E A,Burleson K O,Kloner R A,et al.Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes.J Clin Invest,1994,94:1621～1629
12，Saraste A,Pulddi K,Kallagoki M,et al.Apoptosis in human acute myocardial infaraction.Circulation,1997,95:320～323
13，Chakrabarti S,Hoqne A N E,Karmazyn M.A rapid ischemia induced apoptosis in isolate rat heart and its atteuation by the sodium-hydrogen exchange inhibitor HOE642(Cariporide).J Mol Cell Cardiol,1997,29:3169～3174
14，Zweier J L,Rayburn B K,Flaherty J T,et al.Recombinant superoxide dismutase reduces oxygen free radical concentrations in reperfused myocar-dium.J Clin Invest,1987,80:1728～1734
15，刘建.白细胞滤过器预防缺血再灌注心肌损伤的实验室研究.中国循环杂志,1998,13:202～204
收稿日期：1999-11-25, http://www.100md.com
单位：首都医科大学附属北京同仁医院干部医疗科
关键词：
首都医科大学学报000437 细胞凋亡(apoptosis)或程序化细胞死亡(programmed cell death)是机体自胚胎起即存在的一种细胞死亡的方式,是维持细胞增生、死亡间平衡的重要方式。在胚胎发育过程中,通过凋亡可清除对机体无用和有害的细胞,清除多余的、发育不正常的细胞。在成年机体中,通过凋亡消除衰老的细胞,代之以新生细胞，从而维持组织器官中细胞数量的稳定。通过凋亡还可清除体内受伤的或有癌前病变的细胞,防止癌变;凋亡还参与机体的防御机制,当机体受到病毒感染时,可通过诱导感染病毒细胞凋亡来清除入侵病毒。但凋亡异常亦可造成肿瘤、自身免疫性疾病等。因此凋亡在机体发生、发展过程中具有广泛的病理、生理意义。
1 细胞凋亡的特点
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本世纪60年代,人们就注意到细胞死亡有2种不同的方式。1972年，病理学家Kerr首次提出了细胞凋亡这一概念。此后的一些研究也都进一步证实，细胞凋亡是一种具有独特的形态学和生化改变的与坏死截然不同的另一种死亡方式，是一种经基因严密调控的需能量参与的过程。它只涉及单个细胞的死亡，其典型的特征是细胞缩小、胞质凝缩，内质网疏松并与胞膜融合；核糖体等聚集，但无结构破坏，染色质固缩，密度增高并集聚于核膜周边，嗜碱性增强，核仁裂解，继而细胞膜出泡、内陷，将细胞自行分割成多个具有膜包裹的凋亡小体(apoptosis body)。凋亡小体可迅速被周围具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、降解，整个过程无细胞质漏出，故而无炎症反应。在凋亡过程中激活核酸内切酶在组蛋白八聚体之间的连接区切开DNA，使其成为180～200 bp整数倍的DNA片段，在琼脂凝胶电泳上形成独特的DNA区带图谱(DNA ladder)。利用这一特点，可用以检测凋亡细胞的存在[1，2]。
而细胞死亡的另一种方式为坏死。其特点为细胞胀大，细胞器肿胀、破坏、辨认不清，晚期有胞核破碎，染色质断裂成许多不规则的小凝块，胞膜破裂，细胞内容物外逸，诱发周围细胞的炎症反应。因此坏死一般是成片发生的，在形态上易与凋亡相区别。
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2 细胞凋亡基因调控的一些因素
2.1 bcl-2家族
bcl-2家族是最先被注意到与细胞凋亡有密切关系的基因之一，是1985年首先在B细胞滤泡性淋巴瘤中发现的，属抗凋亡基因。在T、B淋巴细胞的发育过程中，若有bcl-2基因的过表达，可促使细胞增生。将该基因通过表达载体导入细胞并使之表达能提高细胞对各种致命因素(如射线、生长因子的撤除等)的抵抗力，延长细胞寿命[3]。家族的另一成员Bax被6个外显子编码，Bax的表达或过表达，促使细胞凋亡[4]。 Miscao等对15例急性心肌梗死及12例陈旧性心肌梗死病人的尸体心肌进行免疫组化研究发现[5]，在心梗的早期存活的心肌细胞中有bcl-2的表达或过表达，这提示bcl-2的表达挽救了早期缺血的心肌细胞。而在心梗急性期的存活心肌细胞中未发现Bax的表达。反之，在陈旧阶段则多见有Bax的表达或过表达 。这证明bcl-2可抑制心肌细胞凋亡，而Bax诱导和促使细胞的凋亡。但bcl-2家族促使或抑制细胞凋亡的机制尚不明确。
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2.2 P53
P53基因是一种重要的抗癌基因。近年来人们发现P53与细胞凋亡有密切关系。Yonish Rouach等在1991年首先报道了野生型P53(wtP53)能诱导白细胞的凋亡[6]，突变型P53则抑制细胞凋亡。有研究表明，在家兔动脉硬化斑块中有P53突变蛋白存在，而野生型P53基因低表达。因此，P53基因可能在动脉硬化的发生发展中起重要意义。
2.3 c-myc
近年研究发现c-myc 基因具有刺激细胞增生和凋亡的双重调节作用。作为转录因子，c-myc 蛋白一方面激活那些介导细胞增生的基因，另一方面也激活介导凋亡的基因，使细胞增生或凋亡。若同时接受了其他附加存活因素，如生长因子存在、bcl-2 表达等，则增生占优势；反之发生细胞凋亡。bcl-2能够阻断c-myc诱导凋亡的作用，但不影响其增生作用[7]。
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2.4 Fas
Fas又称Apo-1，与Fas配体结合是引起细胞凋亡的主要途径之一[8]。Oshimi等证明了Fas与其抗体(或配体)结合后立即引起细胞内Ca2+浓度升高，Ca2+流入细胞内造成钙超载而致细胞死亡。 Fas抗原、抗体(配体)相互作用激动细胞凋亡信号传导系统可被bcl-2的表达所抑制。
3 缺血与再灌注时心肌细胞凋亡
过去认为心肌细胞和神经元细胞这些末期分化的细胞不发生细胞凋亡。1993年，国外学者在右室发育不良性心律失常的病人心肌上发现了凋亡的证据，首次证明人类心肌也存在细胞凋亡。近年来体内、体外实验发现多种损伤可诱发细胞凋亡。如缺血再灌注、心肌梗死、快速心室起搏、机械牵拉和自发性高血压大鼠,这些发现使人们对于心脏疾病有了新的理解和认识。
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溶栓治疗急性心肌梗死的目的是使与梗死心肌相关联的阻塞的冠状动脉再灌注，以挽救缺血心肌、减小梗死面积、提高心脏功能。但与此同时，再灌注本身也可对心肌产生有害影响。罗爱伦等以犬的心肌酶变化来研究缺血再灌注损伤[9]，结果显示心肌复跳后5 min，实验组与对照组间CK和CK-MB无显著差异，而在复跳后35 min、60 min 组间差异明显。提示心肌缺血再灌注过程中，心肌损伤可能由再灌注开始，并逐渐加重。Fliss用鼠的缺血再灌注模型，应用末端标记方法(ISEL) 对缺血及再灌注心肌进行检测发现[10]：无论是持续给予缺血刺激(2.25 h)，还是缺血后再灌注(缺血45 min后再灌注1 h)，均发现有心肌细胞的凋亡现象，且认为再灌注促进细胞凋亡的发生。这与Gottlieb等所做的兔的缺血再灌注后心肌细胞凋亡的结果相似[11]。Fliss等在上述同一实验中还发现缺血再灌注心肌中有大量白细胞浸润，并推测在再灌注心肌中白细胞浸润的速度可能与心肌细胞凋亡的速度相关。Saraste等对8例急性心梗(其中6例为溶栓成功)病人的尸检心肌分析证实在心肌梗死区及梗死边缘区均发现有典型的凋亡细胞[12]，边缘区明显多于梗死区，而在远处非梗死区及对照组心肌未发现有细胞凋亡。这说明在人的心肌梗死及心梗扩展中细胞凋亡可能有重要的作用。
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心肌细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中所起的作用越来越引起人们的重视。发生再灌注损伤的机制尚不明确，可能与以下几点有关：①钙超载。在缺氧，尤其是再灌注期间NHE(Na-H exchanger)被激活，致细胞内Na+浓度增高，这增加了Na-Ca交换，使Ca2+集聚于细胞内，Ca2+增高可能与凋亡启动有关。HOE 642(NHE阻断剂)及Ca2+拮抗剂可抑制因钙超载致细胞凋亡，减少再灌注损伤[13]，在动物实验中与对照组相比较，可缩小梗死面积。②氧自由基致损伤。氧化还原反应是机体内最为广泛和重要的反应。在缺血再灌注时可产生大量的活性氧自由基。它们能与蛋白质、DNA和脂质体等反应引起蛋白质氧化、DNA断裂、胞膜出泡等细胞凋亡的典型特征，一些抗氧化物质及清除自由基的药物可减轻这一反应[14]。③炎性细胞浸润。缺血时有大量的白细胞被激活，这些白细胞经趋化游走随灌注血流进入缺血心肌，并粘附、聚集于此，可机械阻塞心肌毛细血管，加重心肌缺血性损伤，扩大心梗面积；还可产生氧自由基使心肌细胞凋亡。刘建等用白细胞滤过器滤除循环中的部分白细胞，给心肌提供一个低白细胞环境的再灌注血液，对心肌再灌注损伤有明显的保护作用[15]。
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综上所述，细胞凋亡现象存在于心肌缺血再灌注损伤的过程中，提示凋亡相关基因可能参与调控这一过程，并可能为各种损伤因素的始发环节。因此，从细胞凋亡的角度对缺血再灌注进行研究，将会从新的层次来解释心肌细胞损伤的机制，对急性心肌梗死溶栓术及PTCA术后心肌细胞再生及功能恢复的治疗带来新的前景。
参考文献
1，Kerr J F R,Wyllie A H.Apoptosis:A basic biological phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics.Br J Cancer,1972,26:239～257
2，Wyllie A H,Kerr J F.Cell death:The significant of apoptosis.Int Rev Cytol,1980,68:251～306
, 百拇医药
3，Tsujimoto Y.Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma.Science,1985,228:1440～1443
4，Yang E,Zha J,Jockel J,et al.Bad,a heteroddimeric partner for bcl-x andbcl-2,displaces Bax and promotes cell death.Cell,1995,80:285～291
5，Misao J,Hayakawa Y,Ohno M,et al.Expr-ession of bcl-2 protein,an inhibitor of apoptosis,and Bax,an accelerator of apoptosis,in ventriculor myocytes of human heart with myocardial infarction.Circulation,1996,94:1506～1512
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6，Yonish Rouach E,Resnitzky D,Lotem J,et al.Wild-type P-53 induce apoptosis of myelid leukemic cell that is inhibited by inteerleukin-6.Nature,1991,352:345～437
7，Williams,Christopher A S.Molecular regulation of apoptosis:Genic controls on cell death.Cell,1993,74:777～779
8，Fraser A,Evan G.A license to kill.Cell,1996,85(6):781～784
9，罗爱伦,郭向阳,徐守春,等.卡托普利对缺血再灌注心脏保护作用的实验室研究.中华心血管疾病杂志,1998,26(3):226～228
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10，Fliss H,Gattinger D.Apoptosis in ischemic and reperfused rat mhocardium.Circ Res,1996,79:949～956
11，Gottlieb E A,Burleson K O,Kloner R A,et al.Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes.J Clin Invest,1994,94:1621～1629
12，Saraste A,Pulddi K,Kallagoki M,et al.Apoptosis in human acute myocardial infaraction.Circulation,1997,95:320～323
13，Chakrabarti S,Hoqne A N E,Karmazyn M.A rapid ischemia induced apoptosis in isolate rat heart and its atteuation by the sodium-hydrogen exchange inhibitor HOE642(Cariporide).J Mol Cell Cardiol,1997,29:3169～3174
14，Zweier J L,Rayburn B K,Flaherty J T,et al.Recombinant superoxide dismutase reduces oxygen free radical concentrations in reperfused myocar-dium.J Clin Invest,1987,80:1728～1734
15，刘建.白细胞滤过器预防缺血再灌注心肌损伤的实验室研究.中国循环杂志,1998,13:202～204
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