生物素化壳聚糖微球用于体外肿瘤靶向治疗
作者：方华丰 周宜开 任恕
单位：同济医科大学环境医学研究所，武汉 430030
关键词：靶向治疗；壳聚糖；微球；生物素-亲和素系统
同济医科大学学报000407 摘要 生物素-亲和素介导的肿瘤靶向治疗是近几年 来肿瘤早期诊断、治疗研究的热点。将包封有TNFα的壳聚糖微球生物素化，以生物素化无 唾液酸胎球蛋白为导向系统，采用“三步法”研究了微球体外抗肿瘤毒性实验。结果表明： 生物素化壳聚糖微球对体外培养的肝癌细胞SMMC-7721有显著的抑制作用(抑制率为60.8% ，P<0.01)。
中图法分类号 R969， R944.9
Tumor Targeted Therapy with Biotinylated Chitosan Microspheres in vitro
, 百拇医药
Fang Huafeng Zhou Yikai Ren Shu
(Institute of Environmental Medicine, Tongji Medical Un iversity, Wuhan 430030)
Abstract Chitosan microspheres loading TNFα were biotinylated by BNHS. The antitumor activity against SMMC-7721 was studied in vitro by “thr ee-step” method, which employed biotinylated asialofetuin as a pretargeting ag ent. It was found that biotinylated chitosan microspheres could obviously inhibi t the hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 cultured in vitro with the i nhibitory rate being 60.8 % (P<0.01). The results demonstrated that bioti nylated asialofetuin-avidin-biotinylated microspheres could be used for targeted thera py of tumor.
, 百拇医药
Key words targeted therapy; chitosan; microspheres; biotin- avidin system
生物素-亲和素系统(BAS)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统，具有灵敏度 高、特异性高、稳定性高等特点，被广泛用于生物医学各领域[1，2]。1994年，St ella等将BAS用于结肠癌患者手术中诊断肿瘤灶的放射免疫导向手术(RIGS)系统[3] 。近年来， BAS介导的肿瘤导向治疗成为肿瘤治疗的最新研究热点之一[4，5]。但是现有文献 报道的 都是将放射性核素(或药物)直接与生物素或亲和素相连接，这种方法载药量很低，而且易 引起药物失活，本实验以微球包封药物，使本系统更具实用性。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
, http://www.100md.com
TNFα壳聚糖微球的制备及所需原料见文献[6]。
亲和素(Avidin, Av，Sigma)；亲和素辣根过氧化物酶(Av-HRP，Sigma)；活性生物素(Bi o tin-LC-NHS，Sigma)；无唾液酸胎球蛋白(asialofetuin, AF, Sigma)；鲁米诺(lumin ol，Serva)；对碘苯酚(paraiodophenol, PIP, Merck)；四甲基偶氮唑盐(MTT, Sigma)；人肝癌细胞SMMC 7721：由中科院上海细胞所提供。
发光工作液用0.2 mol/L pH8.5硼酸盐缓冲溶液配制(含luminol 3×10-4 mo l/L，H2O2 5.0×10-3 mol/L，PIP 6.0×10-4 mol/L)，临用前配制 ，静置2 h后使用。LKB-1251发光仪(Pharmacia公司)，HL-2920P酶标仪，显微镜，S-520 型扫描电镜。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1微球及无唾液酸胎球蛋白的生物素化：取TNFα壳聚糖微球约50mg,加Biotin-LC-NHS的二甲基甲酰胺(DMF)1.0ml(1.0mg/ml)，置于小烧杯内，加pH6.8PBS4.0ml，20℃，磁力搅拌(125r/min)，反应4h，于4℃、pH7.4PBS(0.01mol/L)透析过夜，冷冻干燥。TNFα的生物素化采用相同的方法。
称取无唾液酸胎球蛋白约10 mg，置于小烧杯中，加水2.0 ml，用0.01 mol/L NaHCO 3调pH至8.5，加Biotin-LC-NHS的DMF液0.5 ml (1 mg/ml)， 20℃，磁力搅拌(125 r pmin)反应4 h，于4℃、pH7.4 PBS(0.01 mol/L)透析过夜，冷冻干燥。
1.2.2 生物素化微球化学发光检测：取上述生物素化壳聚糖微球5 mg，加PBS 1.0 ml，Av-HRP(100 μg/ml)5 μl，室温振荡反应30 min，离心15 min ，将沉淀用PBS洗涤，将微球重新悬浮于1.0 ml PBS中，取50 μl, 加pH8.5硼酸盐缓冲液150 μl，发光工作液100 μl ,摇匀，静置5 mi n,于 25℃测其6 s发光强度的积分值，同时以未生物素化壳聚糖微球作对照实验。
, 百拇医药
1.2.3 生物素化后微球基本特征参数的测定： 生物素化后TNFα壳聚糖微球基本特征参数的测定及灭菌实验参见文献[6]进行。
1.2.4 抗癌活性检测：本实验采用细胞株SMMC-7721，置于37℃ 5% CO2细胞培养箱中培养 。在RPMI-1640培养 基中添加100 ml/L小牛血清，青霉素G、链霉素及HEPES作为肿瘤细胞培养液，每2 d更 换细胞培养液并传代1次。
取指数生长期SMMC-7721细胞，用0.02%EDTA 制成单细胞悬液，用培养液调至约2×104 /ml，取100 μl/ml接种于96孔培养板中，于5%CO2细胞培养箱中，24 h后，分别加入生 物素化无唾液酸胎球蛋白2 μl、培养液100 μl，培养30 min。用培养液洗涤3次，加亲和 素5 μl、培养液100 μl, 培养30 min，洗涤，加生物素化壳聚糖微球适量、培养液100μl , 培养30 min，洗涤，加培养液100μl，每种微球及对照实验做3个平行孔。
, http://www.100md.com
培养48 h后,在培养板的试验孔与对照孔中各加0.1%MTT 20 μl/孔(5 μg/ml)，培养4 h 后,弃去培养液，加入酸化异丙醇100 μl/孔，振摇20 min后,HL-2920P酶标仪测定每孔570 nm处OD值,计算细胞抑制率。
细胞抑制＝(对照组OD-实验组OD值)/对照组OD值×100%
1.2.5 微球体外靶向治疗的电镜观察：实验前在24孔培养板中加入玻片，肝癌细胞培养及微球的加入方法同1.2.4，培养一定时 间后，从培养孔中取出盖玻片，PBS洗涤，25 g/L戊二醛及10 g/L锇酸双重固定30 min，梯度乙酸脱水10 min，醋酸浸泡15 min, 临界点干燥,离子溅射法喷金,S-520型扫描 电镜观察。
2 结果
2.1 微球生物素化
, http://www.100md.com
壳聚糖分子上的氨基属于伯氨基，性质比较活泼，可以与生物素琥珀酰亚胺酯反应。生物素 化反应大多数情况下是在偏碱的条件下进行，但考虑到TNFα在pH8.8时生物素化，部分活 性丧失，而在pH6.8时生物素化，活性却几乎没有损失[4]。
利用Luminol-H2O2-HRP-PIP增强化学发光系统检测微球的生物素化。影响化学发光 的因素很多，本文增强化学发光检测条件按文献[7]进行，结果生物素化壳聚糖微 球发 光强度为2782±127，而未生物素化壳聚糖微球发光强度为57±14，二者之间有极显著性差 异(P<0.01)。说明微球上都结合了生物素。
微球的生物素化反应在pH6.8磷酸盐缓冲液中进行，整个反应过程有机溶剂量较少(少量DMF )，不影响药物生物活性[4]，实验结果表明：生物素化过程对微球的大小、药物含 量、体外释放度等无显著影响。
, http://www.100md.com
2.2 MTT法检测抗癌活性
采用“三步法”测定了微球对肿瘤的抑制作用，每一步都设立对照组，其基本过程为： 第一步加生物素化无唾液酸胎球蛋白(B-AF)，对照组：RPMI-1640(Ⅰ)、无唾液酸胎 球蛋白(Ⅱ)；第二步加亲合素，对照组：不加亲合素(Ⅲ)；第三步加生物素化壳聚糖微 球，对照组：未生物素化壳聚糖微球(Ⅳ)、生物素化空白壳聚糖微球(Ⅴ)。
表1 生物素化TNFα微球抗癌活性 组别
剂量(U)
OD
包封率 (%)
Ⅰ
-
0.352±0.042
, http://www.100md.com
Ⅱ
1000
0.335±0.046
Ⅲ
1000
0.333±0.037
Ⅳ
1000
0.336±0.052
对照组
1000
0.138±0.015
60.80 %**
, 百拇医药
包封组
1000
0.246±0.024
48.00%
由表1可以看出，三步法可将微球结合于细胞表面而对肝癌细胞有显著的杀伤作用， 三 步法中每缺少一种成分，都会大大影响药物抗肿瘤作用。生物素化TNFα微球与同量生物素 化TNFα都有较强的体外抗肿瘤作用，都明显高于游离药物。48 h的细胞毒性作用，前者强 于后者，可能与药物从微球中缓慢释放而维持药物与癌细胞接触的有效药物浓度和持续时间 有关，微球及微球中所含BSA也对TNFα失活起了一定的保护作用，从而大大降低了TNFα的 失活速度，提高了TNFα的体外抗癌活性。
2.3 显微镜观察
扫描电镜下，对照组肝癌细胞形态比较完整，细胞表面光滑，与微球共同培养的肝癌细胞形 态不一，有的呈菱形，有的为不规则状，细胞表面粗糙，可见一个或多个微球粘附于癌细胞 表面。3 讨论
, 百拇医药
BAS介导的肿瘤导向治疗可分为“两步法”和“三步法”。现在研究比较热门的是“三 步法”[5]：首先注射生物素化单抗，使之富集于肿瘤部位，再静脉注射亲和素作 为“追逐”大分子，它们能与循环中尚未清除的生物素化单抗结合而形成聚集体，从而迅速 被网状 内皮细胞如肝脏中的Kupffer细胞所内吞而被清除。这样，一定时间后，肿瘤部位生物素化 单抗-亲和素与非肿瘤部位相比达到最大值。最后注射生物素标记的效应分子。与单抗-效 应分子直接共价相比，这种方法最大的优点是预定位及体内标记，因而具有更高的导向性和 更低的毒副作用。本实验以生物素化微球替代生物素化效应分子，使这种方法更具实用性。
本实验研究了体外三步法对肝癌细胞的杀伤作用,实验表明生物素化无唾液酸胎球蛋白对 肝癌细胞有一定的选择性，可以通过生物素-亲和素的桥连作用，与生物素化微球连接，表 现出较强的抗肿瘤作用和较低的毒副作用。选择不同特异性的单克隆抗体，本系统可用于不同肿瘤的导向治疗。有关其它肿瘤的导向治 疗以及体内应用尚需进一步探讨。
, 百拇医药
国家自然科学基金资助项目(No.39990570)
方华丰，男，1969年生，博士研究生
参 考 文 献
1，Wilchek M, Bayer E A. The avidin-biotin comples in bioanalytical applications. Anal Biochem，1988,171:1
2，方华丰,周宜开.生物素-亲和素系统在生物传感器中的应用.化学传感器, 1997, 17(3), 177
3，Stella M, De Nardi P, Paganelli G et al. Avidin-biotin system i n radioimmunoguided surgery for colorectal cancer. Advantages and limits. Dis Colon Rectum, 1994,37:335
, 百拇医药
4，Angelo C, Anna G, Angelina S et al. Tumor targeting with biotinylated tumor necrosis factor α: structure-activity relationships and mechanism of action on avidin pretargeted tumor cell. Cancer Research,1998, 58:3866
5，Paganelli G, Grana C, Chinol M. Antibody-guided three-step therapy for high grade glioma with yttrium-90 biotin. Eur J Nucl Med, 1999,26:348
6，方华丰, 周宜开. 肿瘤坏死因子壳聚糖微球的制备及抗癌活性. 同济医科大学 学报,2000, 29(1)： 53
7，袁津玮, 周宜开, 孙雅量等. 用化学发光自显影技术检测甲型肝炎病毒和人 IgM. 同济医科大学学报, 1997, 26(5): 362
(1999-07-12 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学环境医学研究所，武汉 430030
关键词：靶向治疗；壳聚糖；微球；生物素-亲和素系统
同济医科大学学报000407 摘要 生物素-亲和素介导的肿瘤靶向治疗是近几年 来肿瘤早期诊断、治疗研究的热点。将包封有TNFα的壳聚糖微球生物素化，以生物素化无 唾液酸胎球蛋白为导向系统，采用“三步法”研究了微球体外抗肿瘤毒性实验。结果表明： 生物素化壳聚糖微球对体外培养的肝癌细胞SMMC-7721有显著的抑制作用(抑制率为60.8% ，P<0.01)。
中图法分类号 R969， R944.9
Tumor Targeted Therapy with Biotinylated Chitosan Microspheres in vitro
, 百拇医药
Fang Huafeng Zhou Yikai Ren Shu
(Institute of Environmental Medicine, Tongji Medical Un iversity, Wuhan 430030)
Abstract Chitosan microspheres loading TNFα were biotinylated by BNHS. The antitumor activity against SMMC-7721 was studied in vitro by “thr ee-step” method, which employed biotinylated asialofetuin as a pretargeting ag ent. It was found that biotinylated chitosan microspheres could obviously inhibi t the hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 cultured in vitro with the i nhibitory rate being 60.8 % (P<0.01). The results demonstrated that bioti nylated asialofetuin-avidin-biotinylated microspheres could be used for targeted thera py of tumor.
, 百拇医药
Key words targeted therapy; chitosan; microspheres; biotin- avidin system
生物素-亲和素系统(BAS)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统，具有灵敏度 高、特异性高、稳定性高等特点，被广泛用于生物医学各领域[1，2]。1994年，St ella等将BAS用于结肠癌患者手术中诊断肿瘤灶的放射免疫导向手术(RIGS)系统[3] 。近年来， BAS介导的肿瘤导向治疗成为肿瘤治疗的最新研究热点之一[4，5]。但是现有文献 报道的 都是将放射性核素(或药物)直接与生物素或亲和素相连接，这种方法载药量很低，而且易 引起药物失活，本实验以微球包封药物，使本系统更具实用性。
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
, http://www.100md.com
TNFα壳聚糖微球的制备及所需原料见文献[6]。
亲和素(Avidin, Av，Sigma)；亲和素辣根过氧化物酶(Av-HRP，Sigma)；活性生物素(Bi o tin-LC-NHS，Sigma)；无唾液酸胎球蛋白(asialofetuin, AF, Sigma)；鲁米诺(lumin ol，Serva)；对碘苯酚(paraiodophenol, PIP, Merck)；四甲基偶氮唑盐(MTT, Sigma)；人肝癌细胞SMMC 7721：由中科院上海细胞所提供。
发光工作液用0.2 mol/L pH8.5硼酸盐缓冲溶液配制(含luminol 3×10-4 mo l/L，H2O2 5.0×10-3 mol/L，PIP 6.0×10-4 mol/L)，临用前配制 ，静置2 h后使用。LKB-1251发光仪(Pharmacia公司)，HL-2920P酶标仪，显微镜，S-520 型扫描电镜。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1微球及无唾液酸胎球蛋白的生物素化：取TNFα壳聚糖微球约50mg,加Biotin-LC-NHS的二甲基甲酰胺(DMF)1.0ml(1.0mg/ml)，置于小烧杯内，加pH6.8PBS4.0ml，20℃，磁力搅拌(125r/min)，反应4h，于4℃、pH7.4PBS(0.01mol/L)透析过夜，冷冻干燥。TNFα的生物素化采用相同的方法。
称取无唾液酸胎球蛋白约10 mg，置于小烧杯中，加水2.0 ml，用0.01 mol/L NaHCO 3调pH至8.5，加Biotin-LC-NHS的DMF液0.5 ml (1 mg/ml)， 20℃，磁力搅拌(125 r pmin)反应4 h，于4℃、pH7.4 PBS(0.01 mol/L)透析过夜，冷冻干燥。
1.2.2 生物素化微球化学发光检测：取上述生物素化壳聚糖微球5 mg，加PBS 1.0 ml，Av-HRP(100 μg/ml)5 μl，室温振荡反应30 min，离心15 min ，将沉淀用PBS洗涤，将微球重新悬浮于1.0 ml PBS中，取50 μl, 加pH8.5硼酸盐缓冲液150 μl，发光工作液100 μl ,摇匀，静置5 mi n,于 25℃测其6 s发光强度的积分值，同时以未生物素化壳聚糖微球作对照实验。
, 百拇医药
1.2.3 生物素化后微球基本特征参数的测定： 生物素化后TNFα壳聚糖微球基本特征参数的测定及灭菌实验参见文献[6]进行。
1.2.4 抗癌活性检测：本实验采用细胞株SMMC-7721，置于37℃ 5% CO2细胞培养箱中培养 。在RPMI-1640培养 基中添加100 ml/L小牛血清，青霉素G、链霉素及HEPES作为肿瘤细胞培养液，每2 d更 换细胞培养液并传代1次。
取指数生长期SMMC-7721细胞，用0.02%EDTA 制成单细胞悬液，用培养液调至约2×104 /ml，取100 μl/ml接种于96孔培养板中，于5%CO2细胞培养箱中，24 h后，分别加入生 物素化无唾液酸胎球蛋白2 μl、培养液100 μl，培养30 min。用培养液洗涤3次，加亲和 素5 μl、培养液100 μl, 培养30 min，洗涤，加生物素化壳聚糖微球适量、培养液100μl , 培养30 min，洗涤，加培养液100μl，每种微球及对照实验做3个平行孔。
, http://www.100md.com
培养48 h后,在培养板的试验孔与对照孔中各加0.1%MTT 20 μl/孔(5 μg/ml)，培养4 h 后,弃去培养液，加入酸化异丙醇100 μl/孔，振摇20 min后,HL-2920P酶标仪测定每孔570 nm处OD值,计算细胞抑制率。
细胞抑制＝(对照组OD-实验组OD值)/对照组OD值×100%
1.2.5 微球体外靶向治疗的电镜观察：实验前在24孔培养板中加入玻片，肝癌细胞培养及微球的加入方法同1.2.4，培养一定时 间后，从培养孔中取出盖玻片，PBS洗涤，25 g/L戊二醛及10 g/L锇酸双重固定30 min，梯度乙酸脱水10 min，醋酸浸泡15 min, 临界点干燥,离子溅射法喷金,S-520型扫描 电镜观察。
2 结果
2.1 微球生物素化
, http://www.100md.com
壳聚糖分子上的氨基属于伯氨基，性质比较活泼，可以与生物素琥珀酰亚胺酯反应。生物素 化反应大多数情况下是在偏碱的条件下进行，但考虑到TNFα在pH8.8时生物素化，部分活 性丧失，而在pH6.8时生物素化，活性却几乎没有损失[4]。
利用Luminol-H2O2-HRP-PIP增强化学发光系统检测微球的生物素化。影响化学发光 的因素很多，本文增强化学发光检测条件按文献[7]进行，结果生物素化壳聚糖微 球发 光强度为2782±127，而未生物素化壳聚糖微球发光强度为57±14，二者之间有极显著性差 异(P<0.01)。说明微球上都结合了生物素。
微球的生物素化反应在pH6.8磷酸盐缓冲液中进行，整个反应过程有机溶剂量较少(少量DMF )，不影响药物生物活性[4]，实验结果表明：生物素化过程对微球的大小、药物含 量、体外释放度等无显著影响。
, http://www.100md.com
2.2 MTT法检测抗癌活性
采用“三步法”测定了微球对肿瘤的抑制作用，每一步都设立对照组，其基本过程为： 第一步加生物素化无唾液酸胎球蛋白(B-AF)，对照组：RPMI-1640(Ⅰ)、无唾液酸胎 球蛋白(Ⅱ)；第二步加亲合素，对照组：不加亲合素(Ⅲ)；第三步加生物素化壳聚糖微 球，对照组：未生物素化壳聚糖微球(Ⅳ)、生物素化空白壳聚糖微球(Ⅴ)。
表1 生物素化TNFα微球抗癌活性 组别
剂量(U)
OD
包封率 (%)
Ⅰ
-
0.352±0.042
, http://www.100md.com
Ⅱ
1000
0.335±0.046
Ⅲ
1000
0.333±0.037
Ⅳ
1000
0.336±0.052
对照组
1000
0.138±0.015
60.80 %**
, 百拇医药
包封组
1000
0.246±0.024
48.00%
由表1可以看出，三步法可将微球结合于细胞表面而对肝癌细胞有显著的杀伤作用， 三 步法中每缺少一种成分，都会大大影响药物抗肿瘤作用。生物素化TNFα微球与同量生物素 化TNFα都有较强的体外抗肿瘤作用，都明显高于游离药物。48 h的细胞毒性作用，前者强 于后者，可能与药物从微球中缓慢释放而维持药物与癌细胞接触的有效药物浓度和持续时间 有关，微球及微球中所含BSA也对TNFα失活起了一定的保护作用，从而大大降低了TNFα的 失活速度，提高了TNFα的体外抗癌活性。
2.3 显微镜观察
扫描电镜下，对照组肝癌细胞形态比较完整，细胞表面光滑，与微球共同培养的肝癌细胞形 态不一，有的呈菱形，有的为不规则状，细胞表面粗糙，可见一个或多个微球粘附于癌细胞 表面。3 讨论
, 百拇医药
BAS介导的肿瘤导向治疗可分为“两步法”和“三步法”。现在研究比较热门的是“三 步法”[5]：首先注射生物素化单抗，使之富集于肿瘤部位，再静脉注射亲和素作 为“追逐”大分子，它们能与循环中尚未清除的生物素化单抗结合而形成聚集体，从而迅速 被网状 内皮细胞如肝脏中的Kupffer细胞所内吞而被清除。这样，一定时间后，肿瘤部位生物素化 单抗-亲和素与非肿瘤部位相比达到最大值。最后注射生物素标记的效应分子。与单抗-效 应分子直接共价相比，这种方法最大的优点是预定位及体内标记，因而具有更高的导向性和 更低的毒副作用。本实验以生物素化微球替代生物素化效应分子，使这种方法更具实用性。
本实验研究了体外三步法对肝癌细胞的杀伤作用,实验表明生物素化无唾液酸胎球蛋白对 肝癌细胞有一定的选择性，可以通过生物素-亲和素的桥连作用，与生物素化微球连接，表 现出较强的抗肿瘤作用和较低的毒副作用。选择不同特异性的单克隆抗体，本系统可用于不同肿瘤的导向治疗。有关其它肿瘤的导向治 疗以及体内应用尚需进一步探讨。
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国家自然科学基金资助项目(No.39990570)
方华丰，男，1969年生，博士研究生
参 考 文 献
1，Wilchek M, Bayer E A. The avidin-biotin comples in bioanalytical applications. Anal Biochem，1988,171:1
2，方华丰,周宜开.生物素-亲和素系统在生物传感器中的应用.化学传感器, 1997, 17(3), 177
3，Stella M, De Nardi P, Paganelli G et al. Avidin-biotin system i n radioimmunoguided surgery for colorectal cancer. Advantages and limits. Dis Colon Rectum, 1994,37:335
, 百拇医药
4，Angelo C, Anna G, Angelina S et al. Tumor targeting with biotinylated tumor necrosis factor α: structure-activity relationships and mechanism of action on avidin pretargeted tumor cell. Cancer Research,1998, 58:3866
5，Paganelli G, Grana C, Chinol M. Antibody-guided three-step therapy for high grade glioma with yttrium-90 biotin. Eur J Nucl Med, 1999,26:348
6，方华丰, 周宜开. 肿瘤坏死因子壳聚糖微球的制备及抗癌活性. 同济医科大学 学报,2000, 29(1)： 53
7，袁津玮, 周宜开, 孙雅量等. 用化学发光自显影技术检测甲型肝炎病毒和人 IgM. 同济医科大学学报, 1997, 26(5): 362
(1999-07-12 收稿), 百拇医药