铁氰化钾对血管基膜的特殊染色作用
作者：孙异临 曲宝清
单位：北京市神经外科研究所
关键词：铁氰化钾；血管基膜；电子显微镜
首都医科大学学报000407 提要：为探讨铁氰化钾〔potassium ferricyanide K3Fe(CN)6〕对血管基膜的特殊染色作用，以铁氰化钾作为染色剂对生物样本进行处理，并在透射电镜下观察血管基膜对该物质的反应。结果显示，用铁氰化钾浸染后的病理标本，血管基膜部位染色明显加深，电子密度增高。提示：铁氰化钾可以与血管基膜结合，从而为研究血管基膜的超微病理变化提供了1种新的电子染色技术。
中图分类号：R361+.3
The Special Staining of K3Fe(CN)6 to Vessel Basement Membran
, http://www.100md.com
Sun Yilin,Qu Baoqing
(Beijing Neurosurgical Institute)
Abstract:To evaluate the special stain ing effect of potassium ferricyanide on vessel basement membrane,using the K3Fe(CN)6 to treat the biopse specimen and examine the reaction of basement membrane to it under the electron microscope.The result showed the potassium ferricyanide increased the electron-contrast of vessel basement membrane and clearly showed the ultrastructure of it.The staining method provides a kind of special electron-stained technology for studying the ultrastructure changes of basement membrane.
, http://www.100md.com
Key words:potassium ferricyanide;basement membrane;electron micoscope
在电子显微镜生物标本制备技术中，超薄切片染色的原理是利用不同的组织成分对不同重金属盐的亲和力来增强组织结构对电子的散射，从而在电镜下产生黑白反差的图像。目前常用的电子染色剂有醋酸双氧铀和枸橼酸铅及固定剂四氧化锇。1997年10月至1999年3月我们利用铁氰化钾〔potassium ferricyanide K3Fe(CN)6〕作为电子染色剂清晰地显示了血管基膜的超微结构，明显增强了该部位组织结构的电子反差。
1 材料和方法
铁氰化钾由新加坡国立大学医学院电镜室赠送。电镜标本取自本院神经外科活检病理组织，分别为脑血管烟雾病、海绵状血管瘤及血管瘤型脑膜瘤。
, http://www.100md.com
将手术台边取材标本即刻置入3%戊二醛固定2 h，磷酸缓冲液(pH 7.4)冲洗3次，进行1%四氧化锇后固定，在该固定液内按0.015 g/mL的质量浓度加入铁氰化钾，2 h后双蒸水冲洗3次，梯度乙醇脱水，环氧树脂EPON812浸透、包埋。样品聚合后制备超薄切片，常规醋酸双氧铀、枸橼酸铅染色，于Phillps EM208S透射电子显微镜下观察。对照组标本作常规固定处理，即四氧化锇固定液内不加入铁氰化钾。
2 结果
电镜结果显示，相对原子质量并不是很高的铁氰化钾对血管基膜有特殊的亲和作用，用铁氰化钾试剂处理过的标本，血管基膜部位的电子密度明显增加，大大提高了基膜的分辨率，清晰显示了基膜的微细结构(图1)。与对照组染色标本比较，血管基膜的电子反差明显增加(图2)。
3 讨论
众所周知，由于受到电子波长的影响，电镜不能像光学显微镜那样借助颜色来分辨组织的各种成分。电子显微镜所观察的图像为黑白反差的影像，在电镜影像上呈现的反差除受到电子显微镜本身加速电压的高低和物镜光栏大小等因素影响外，更重要的是由标本内不同组织结构对电子的散射能力不同所决定。标本中不同密度的组织对电子的散射程度不一样，凡是能使组织中特定部位选择性地增加密度的物质都具有电子染色的作用。在生物标本中某些组织结构可与某些金属离子特异地结合，并产生较强的电子散射，从而使该部位的组织成分得到明显的反差及高分辨率[1，2]。通常所用的电子染色剂多为原子序数较高的重金属盐类。有关电子染色剂的研究曾有过报道[3]，目前已知某些物质具有专一的染色特性，可以特异地显示组织内某些特定的化学成分，如锰主要显示磷脂蛋白复合物；铅在高pH的条件下可显示细胞的膜系统结构；醋酸双氧铀则主要与细胞核内的DNA结合等。Bruijin曾证实重金属锇与氰化物结合后处理的生物标本可以使糖原产生选择性着色[4]。Qvortrup在电镜下观察大鼠淋巴管时注意到，四氧化锇与铁氰化钾结合物可以清晰地显示淋巴管上皮细胞内的管状内质网[5]。Lami报道在处理猫颈动脉体电镜活检标本时，将经戊二醛固定过的组织置入0.5 mmol/L铁氰化钾、醋酸缓冲液内，室温孵育30 min，在电镜下发现内质网池高尔基复合体囊泡及线粒体嵴均表现有强烈的着色反应[6]。
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图1 铁氰化钾染色标本 血管内皮和血管周围细胞外侧均可见1层清晰的高电子密度的基膜物质 ×6 300
图2 对照组标本 血管基膜分层淡染，电子密度低，结构模糊不清 ×6 300
在对血管性疾病的病理研究中不可避免地要涉及到血管基膜的病变。基膜是毛细血管内皮细胞外周一层完整的均质样的物质，厚约40 nm左右，该物质由内皮细胞分泌而成，且不断更新。它对血管有着一定的支持、固定及屏障作用，对某些分子的通透有一定的选择性。在病理因素作用下血管基膜物质可表现为增厚、疏松、变薄甚至出现断断续续不完整等形态变化。在某些免疫性疾病中免疫复合物可沉积于血管基底膜导致基膜增厚，此外在某些炎症介质及蛋白水解酶的作用下基底膜可被破坏，出现不规则缺损而呈虫蚀样改变，也有部分先天性疾病可出现基底膜疏松变薄发育不良等[7]。
, 百拇医药
本方法证实铁氰化钾与血管基膜物质有较高的亲和性，利用该方法可以清晰地显示血管基膜的超微结构，特异性地增加血管基膜的电子反差，从而为研究该部位的超微病理变化找到一种特殊的电子染色技术。
参考文献
1，黄立.电子显微镜生物标本制备技术.淮阴:江苏科学技术出版社,1982.183
2，Desmond H K.Techniques for electron microscopy.Philadelphia P A:F A Davis Company,1965.166～310
3，Stijskal J.Discontinuities of the glomerular capillary wall and basement membrane in renal diseases.Lab Invest,1978,28:149
, http://www.100md.com
4，De Bruijn W C,Denbeejien P.Glycogen its che-mistry and morphological appearance in the electron microscope.Ⅱ.The complex formed in the selective comtrast staining of glycogen.Histochem J,1975,7(3):205～229
5，Qvortrup K,Rostgaard J.Ultrastructure of the epithelial cells of the endolymphatic duct in the rat.Acta Otolaryngol,1994,114(1):30～39
6，AL Lami F.Studies of osmium deposits in the carotid body of the cat.Stain Technol,1976,51(3):163～167
7，Rumpelt H J.Hereditary nephropathy correlation of clinical data with glomerular basement membrane alteratons.Clin Nephrol,1980,13:203
收稿日期：2000-03-03, http://www.100md.com
单位：北京市神经外科研究所
关键词：铁氰化钾；血管基膜；电子显微镜
首都医科大学学报000407 提要：为探讨铁氰化钾〔potassium ferricyanide K3Fe(CN)6〕对血管基膜的特殊染色作用，以铁氰化钾作为染色剂对生物样本进行处理，并在透射电镜下观察血管基膜对该物质的反应。结果显示，用铁氰化钾浸染后的病理标本，血管基膜部位染色明显加深，电子密度增高。提示：铁氰化钾可以与血管基膜结合，从而为研究血管基膜的超微病理变化提供了1种新的电子染色技术。
中图分类号：R361+.3
The Special Staining of K3Fe(CN)6 to Vessel Basement Membran
, http://www.100md.com
Sun Yilin,Qu Baoqing
(Beijing Neurosurgical Institute)
Abstract:To evaluate the special stain ing effect of potassium ferricyanide on vessel basement membrane,using the K3Fe(CN)6 to treat the biopse specimen and examine the reaction of basement membrane to it under the electron microscope.The result showed the potassium ferricyanide increased the electron-contrast of vessel basement membrane and clearly showed the ultrastructure of it.The staining method provides a kind of special electron-stained technology for studying the ultrastructure changes of basement membrane.
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Key words:potassium ferricyanide;basement membrane;electron micoscope
在电子显微镜生物标本制备技术中，超薄切片染色的原理是利用不同的组织成分对不同重金属盐的亲和力来增强组织结构对电子的散射，从而在电镜下产生黑白反差的图像。目前常用的电子染色剂有醋酸双氧铀和枸橼酸铅及固定剂四氧化锇。1997年10月至1999年3月我们利用铁氰化钾〔potassium ferricyanide K3Fe(CN)6〕作为电子染色剂清晰地显示了血管基膜的超微结构，明显增强了该部位组织结构的电子反差。
1 材料和方法
铁氰化钾由新加坡国立大学医学院电镜室赠送。电镜标本取自本院神经外科活检病理组织，分别为脑血管烟雾病、海绵状血管瘤及血管瘤型脑膜瘤。
, http://www.100md.com
将手术台边取材标本即刻置入3%戊二醛固定2 h，磷酸缓冲液(pH 7.4)冲洗3次，进行1%四氧化锇后固定，在该固定液内按0.015 g/mL的质量浓度加入铁氰化钾，2 h后双蒸水冲洗3次，梯度乙醇脱水，环氧树脂EPON812浸透、包埋。样品聚合后制备超薄切片，常规醋酸双氧铀、枸橼酸铅染色，于Phillps EM208S透射电子显微镜下观察。对照组标本作常规固定处理，即四氧化锇固定液内不加入铁氰化钾。
2 结果
电镜结果显示，相对原子质量并不是很高的铁氰化钾对血管基膜有特殊的亲和作用，用铁氰化钾试剂处理过的标本，血管基膜部位的电子密度明显增加，大大提高了基膜的分辨率，清晰显示了基膜的微细结构(图1)。与对照组染色标本比较，血管基膜的电子反差明显增加(图2)。
3 讨论
众所周知，由于受到电子波长的影响，电镜不能像光学显微镜那样借助颜色来分辨组织的各种成分。电子显微镜所观察的图像为黑白反差的影像，在电镜影像上呈现的反差除受到电子显微镜本身加速电压的高低和物镜光栏大小等因素影响外，更重要的是由标本内不同组织结构对电子的散射能力不同所决定。标本中不同密度的组织对电子的散射程度不一样，凡是能使组织中特定部位选择性地增加密度的物质都具有电子染色的作用。在生物标本中某些组织结构可与某些金属离子特异地结合，并产生较强的电子散射，从而使该部位的组织成分得到明显的反差及高分辨率[1，2]。通常所用的电子染色剂多为原子序数较高的重金属盐类。有关电子染色剂的研究曾有过报道[3]，目前已知某些物质具有专一的染色特性，可以特异地显示组织内某些特定的化学成分，如锰主要显示磷脂蛋白复合物；铅在高pH的条件下可显示细胞的膜系统结构；醋酸双氧铀则主要与细胞核内的DNA结合等。Bruijin曾证实重金属锇与氰化物结合后处理的生物标本可以使糖原产生选择性着色[4]。Qvortrup在电镜下观察大鼠淋巴管时注意到，四氧化锇与铁氰化钾结合物可以清晰地显示淋巴管上皮细胞内的管状内质网[5]。Lami报道在处理猫颈动脉体电镜活检标本时，将经戊二醛固定过的组织置入0.5 mmol/L铁氰化钾、醋酸缓冲液内，室温孵育30 min，在电镜下发现内质网池高尔基复合体囊泡及线粒体嵴均表现有强烈的着色反应[6]。
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图1 铁氰化钾染色标本 血管内皮和血管周围细胞外侧均可见1层清晰的高电子密度的基膜物质 ×6 300
图2 对照组标本 血管基膜分层淡染，电子密度低，结构模糊不清 ×6 300
在对血管性疾病的病理研究中不可避免地要涉及到血管基膜的病变。基膜是毛细血管内皮细胞外周一层完整的均质样的物质，厚约40 nm左右，该物质由内皮细胞分泌而成，且不断更新。它对血管有着一定的支持、固定及屏障作用，对某些分子的通透有一定的选择性。在病理因素作用下血管基膜物质可表现为增厚、疏松、变薄甚至出现断断续续不完整等形态变化。在某些免疫性疾病中免疫复合物可沉积于血管基底膜导致基膜增厚，此外在某些炎症介质及蛋白水解酶的作用下基底膜可被破坏，出现不规则缺损而呈虫蚀样改变，也有部分先天性疾病可出现基底膜疏松变薄发育不良等[7]。
, 百拇医药
本方法证实铁氰化钾与血管基膜物质有较高的亲和性，利用该方法可以清晰地显示血管基膜的超微结构，特异性地增加血管基膜的电子反差，从而为研究该部位的超微病理变化找到一种特殊的电子染色技术。
参考文献
1，黄立.电子显微镜生物标本制备技术.淮阴:江苏科学技术出版社,1982.183
2，Desmond H K.Techniques for electron microscopy.Philadelphia P A:F A Davis Company,1965.166～310
3，Stijskal J.Discontinuities of the glomerular capillary wall and basement membrane in renal diseases.Lab Invest,1978,28:149
, http://www.100md.com
4，De Bruijn W C,Denbeejien P.Glycogen its che-mistry and morphological appearance in the electron microscope.Ⅱ.The complex formed in the selective comtrast staining of glycogen.Histochem J,1975,7(3):205～229
5，Qvortrup K,Rostgaard J.Ultrastructure of the epithelial cells of the endolymphatic duct in the rat.Acta Otolaryngol,1994,114(1):30～39
6，AL Lami F.Studies of osmium deposits in the carotid body of the cat.Stain Technol,1976,51(3):163～167
7，Rumpelt H J.Hereditary nephropathy correlation of clinical data with glomerular basement membrane alteratons.Clin Nephrol,1980,13:203
收稿日期：2000-03-03, http://www.100md.com